劉譯利 綜述，高 晶 審校

(1.復旦大學附屬婦產科醫(yī)院檢驗科,上海 200011;2.上海健康醫(yī)學院,上海 201318)

數(shù)字聚合酶鏈反應(PCR)是一種新興核酸檢測技術，其利用分割技術將核酸分子移入獨立的反應單元中并進行擴增，在結果統(tǒng)計中加入泊松分布公式的應用，從而提升檢測效能。數(shù)字PCR技術不需要建立標準曲線，對核酸的定量不依賴循環(huán)閾值(Ct值)與標準品，打破了先前核酸檢測技術定量拷貝數(shù)的傳統(tǒng)方法，實現(xiàn)核酸拷貝數(shù)單分子層面的絕對定量。憑借其高靈敏度、高精確性等特點，數(shù)字PCR相對于熒光定量PCR，具有更廣闊的應用前景。

1 數(shù)字PCR技術的原理

數(shù)字PCR是第3代核酸定量技術，實現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)從相對定量到絕對定量的突破。數(shù)字PCR通過將包含核酸分子的反應體系均勻分配至獨立的反應單元并進行擴增，采集終點熒光信號，根據(jù)有無熒光信號將反應單元計為陽性或陰性。在理想狀態(tài)下，反應體系被均勻離散，各反應室中最多僅有1個核酸分子，而在實際操作中，反應體系的目標核酸水平較高或分配不均勻時，無法保證理想狀態(tài)得以實現(xiàn)，因此，對陽性反應單元采用泊松分布公式進行校正以減小誤差。隨著反應單元數(shù)的增加，可以提高反應的靈敏度和特異度，同時可以提高單分子的檢測效率，減少污染，降低成本。數(shù)字PCR根據(jù)其分配反應體系方式的不同可以分為兩類[1]：微滴式數(shù)字PCR和微流控芯片式數(shù)字PCR。

2 數(shù)字PCR技術的特點

數(shù)字PCR技術作為新興的臨床檢測技術，與以往的技術比較，定量目標核酸的方法不同，具有不依賴標準曲線、高靈敏度、高特異度等諸多優(yōu)點，與實時熒光定量PCR技術比較，各方面均有不同。實時熒光定量PCR技術是針對整個反應擴增過程實時采集并分析熒光信號，生成擴增曲線，然后利用Ct值與標準曲線進行核酸水平的定量分析。在臨床檢測中，實時熒光定量PCR技術存在一定的局限性：對標本類型與核酸模版水平要求相對較高，目前主要應用于血液、尿液與肺泡灌洗液等背景簡單的標本中，在檢測如糞便、痰液等背景復雜的標本時，由于標本與標準品間背景不同為檢測引入誤差[2]；部分標本中存在反應抑制劑，如血液抗凝劑、福爾馬林等，降低了擴增效率，影響Ct值；標本目標核酸水平低于檢測限等因素均會影響實時熒光定量PCR技術的精確度與靈敏度,且各標準品水平存在差異，不僅為實驗引入新誤差，還導致各實驗室間數(shù)據(jù)可交換性差。

2.1不需要依賴標準曲線 數(shù)字PCR采用終點熒光信號測量法，針對陽性反應單元應用泊松分布公式校正誤差，實現(xiàn)真正意義上單分子水平的絕對定量，提升各實驗室間數(shù)據(jù)的可互換性。此外，在2代測序技術(NGS)中，文庫的建立往往使用熒光定量PCR技術，但受其擴增效率與標準曲線的限制導致文庫分子的定量不理想，數(shù)字PCR可測定模版的絕對水平與長度，并且擴增過程不易發(fā)生錯配，非常適合NGS文庫的質量控制[3]。

2.2高靈敏度與高特異度 HUGGETT等[4]研究者在利用熒光定量PCR測定野生型DNA中罕見突變基因時，出現(xiàn)引物錯配，野生型基因競爭性擴增的現(xiàn)象，可檢測到的突變率為1%，數(shù)字PCR利用分區(qū)原理，降低了背景干擾，檢測下限突破至0.001%，較熒光定量PCR低了1 000倍[5-6]，輕松實現(xiàn)單分子核酸檢測。同時，數(shù)字PCR技術的分區(qū)處理還可提高對反應抑制劑的耐受能力，降低其對擴增結果的干擾。數(shù)字PCR的應用意味著反應體系從微升級至納升級的突破，在臨床應用最廣泛的微滴式數(shù)字PCR的檢測系統(tǒng)(QX200)[7]中，可以將原體積為20 μL的標本分配至多達20 000個反應室中，即使是低豐度的目的序列也能被靈敏地檢測到。因此，在背景富集的檢測環(huán)境下，存在抑制劑或低豐度目標核酸拷貝數(shù)的標本檢測中，數(shù)字PCR均具有良好的靈敏度與特異度。目前，數(shù)字PCR已被用來檢測糞便標本中的大腸埃希菌[8]。

2.3高精密度 除了不依賴標準曲線外，數(shù)字PCR的高精密度還歸功于泊松分布的應用。泊松分布是指離散概率分布，反應隨機分布狀態(tài)，利用統(tǒng)計學原理，根據(jù)陽性反應單元的個數(shù)及比例進行結果校正，提升檢測精密度。數(shù)字PCR的定量是將有無熒光信號直接計為“陽性”或“陰性”，若目標核酸沒有均勻離散，各反應室中存在一個以上靶核酸，則檢測結果偏差較大，應用泊松分布原理計算結果，可大幅度提高檢測精密度。

2.4步驟簡便，不需要擴增前DNA處理 在熒光定量PCR技術中，提取DNA的步驟復雜且不同試劑盒的提取效率不同，對各實驗室間的數(shù)據(jù)可比性及檢測精確度有一定影響。PAVSIC等[9]學者嘗試在數(shù)字PCR平臺上摒棄這一步驟，利用95 ℃熱處理直接降解病毒蛋白質衣殼，釋放DNA，該方法較傳統(tǒng)提取方式避免了DNA的丟失，可得到更高水平的病毒，更接近實際檢測值。

2.5數(shù)字PCR技術臨床應用的局限性 數(shù)字PCR作為一種新興的核酸檢測技術，在進入臨床檢測前，尚需要進行大量的性能驗證，比對該前沿技術與傳統(tǒng)核酸檢測方法間結果的一致性，并解決質量管理控制等問題，不斷優(yōu)化技術，確保檢測結果的可靠性。

在性能驗證方面，TRYPSTEEN等[10]和BOSMAN等[11]在實驗中發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR少數(shù)反應單元存在假陽性的現(xiàn)象，目前出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因還不得而知，有些學者猜測可能是閾值設置不當導致的。此外，不精密的技術設計在檢測過程中可能帶來污染，由于數(shù)字PCR的高靈敏度，極微量的污染也可能造成結果誤差，并且當前該技術無法單獨分離陽性反應室而從中提取核酸，利用全基因組測序等方法研究假陽性液滴形成。另外，擴增RNA基因時分區(qū)中可能包含未完全反轉錄的模板，取樣過程存在隨機誤差引起目的基因未被提取到等原因均有可能導致假陰性。在技術操作層面，目前數(shù)字PCR技術尚未實現(xiàn)自動化模式且操作繁瑣。如何避免實驗過程中的污染是對技術人員極大的考驗，因此，相關實驗操作人員的技術培訓尤為重要。此外，反應室中有限的標本體積、有限的數(shù)量分區(qū)導致動態(tài)檢測范圍局限；多重檢測能力低、試劑耗材昂貴等因素也導致了數(shù)字PCR技術尚未能廣泛應用于臨床檢測中。

3 數(shù)字PCR技術在病原微生物檢測中的應用

當前數(shù)字PCR技術已經應用于臨床疾病的相關檢測中，如判斷慢性粒細胞白血病復發(fā)風險[12]、器官移植的排斥反應監(jiān)測與個性化治療[13]、無創(chuàng)產前診斷[14-15]、癌癥基因突變檢測[16-17]、腫瘤耐藥突變檢測[5]等方面。在臨床病原微生物檢測領域，數(shù)字PCR技術也有卓越的貢獻。首先，鑒于其高靈敏度，檢測標本不需要利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)和鑒定方法，大幅度縮短了報告時間，為臨床診斷與治療爭取了時間，對傳染性疾病的快速診斷和控制起到了極大的作用；其次，病原體的載量與臨床疾病的發(fā)展、藥效評價和用藥量調整都息息相關，即使是微量的病原體載量波動也具有重要的參考意義，數(shù)字PCR技術可對病原體精準定量，已在病原微生物檢測方面展開了廣泛的研究。

3.1臨床罕見微生物鑒定領域的應用

3.1.1臨床難培養(yǎng)細菌的鑒定 臨床上鑒定細菌的方法主要有：細菌分離培養(yǎng)鑒定、血清學抗體檢測及核酸檢測等，其中利用熒光定量PCR技術進行核酸檢測是最快速、最安全、靈敏度與特異度均較高的方法，但影響該技術檢測結果準確性的因素較多。我國布魯菌病患者多在出現(xiàn)癥狀時自行服用抗菌藥物，導致病原菌血清水平較低，難以被檢測到。韓冰等[18]嘗試利用數(shù)字PCR技術檢測布魯菌，可檢測到的拷貝數(shù)低至0.08 copy/μL，有效提高了低豐度標本的病原菌檢出率。結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌，可累及全身多處器官，其中以感染肺部導致肺結核最為常見，由于血液中僅存在極低載量的結核菌DNA，故一般檢測標本局限于痰液標本、深部痰液取樣困難度高、痰液標本背景復雜等影響因素易導致檢測效能低下。宋能等[19]利用數(shù)字PCR技術檢測結核菌CFP10基因序列，利用質粒測得其最低檢測限為1.2 copy/μL，并選取20例結核菌感染患者，檢測其血液標本中核酸絕對定量水平為3.4～94.0 copy/μL，靈敏度明顯高于熒光定量PCR技術。

3.1.2病毒檢測 新型冠狀病毒為β屬的冠狀病毒，被國際病毒分類委員會命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2。2019新型冠狀病毒肺炎是由新型冠狀病毒感染肺部為主要臨床表現(xiàn)的感染性疾病，數(shù)字PCR技術的高靈敏度與高特異度可提高復雜來源的環(huán)境標本中痕量病毒核酸的檢出率，并且可避免因病毒變異而導致的引物、探針結合能力與擴增效率下降。實驗數(shù)據(jù)表明，數(shù)字PCR技術對于低病毒載量的檢測相對于熒光定量PCR技術更具優(yōu)勢，對于早期疑似病例的篩查、及時阻斷傳染源、控制傳染病暴發(fā)與蔓延起到了至關重要的作用[20]。

早期數(shù)字PCR技術已應用于定量檢測乙型肝炎(簡稱乙肝)病毒DNA，近期有學者在此基礎上將其用于定量乙肝病毒復制過程中的重要標志物——超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子(cccDNA)檢測,cccDNA也是導致乙肝病毒慢性感染與停止抗病毒治療后復發(fā)的主要原因[21]。由于乙肝病毒DNA與cccDNA基因序列同源性較高，且在接受治療時cccDNA水平較低，因此需要選擇靈敏度高、特異性好的檢測方法以提高檢出率與精確度，相比熒光定量PCR技術最低檢測限為50 ng,數(shù)字PCR技術檢測限可低至1 ng，可監(jiān)測管理慢性肝炎患者發(fā)揮重要作用，更能滿足臨床檢測需求。

數(shù)字PCR技術除應用于臨床上病毒的直接鑒定外，還參與到病毒疫苗的研發(fā)中，如定量減毒登革病毒血清[22]、評估嵌合人偏肺病毒表位的重組流感病毒免疫保護效果等[23]。

3.1.3寄生蟲檢測 當前寄生蟲類感染性疾病仍是熱帶國家及發(fā)展中國家需要面臨的公共衛(wèi)生問題之一，臨床上顯微鏡鏡檢是主要的檢測寄生蟲感染的手段，但該方法耗時長，低豐度標本檢出率低。此前，WEERAKOON等[24]研究了數(shù)字PCR技術直接檢測血吸蟲DNA的可行性，實驗中以血清、尿液、唾液、糞便為標本，檢測結果均具有良好的靈敏度，且可根據(jù)血吸蟲DNA的載量變化判斷患者的感染程度，由此證明數(shù)字PCR技術在血吸蟲疾病控制方面同樣起到了重要作用。

3.2微生物載量極低的定性定量檢測 數(shù)字PCR技術可用于檢測臨床原始標本中水平較低的病原菌DNA，例如從血液標本中直接檢測人乳頭瘤病毒(HPV)[25]、結核分枝桿菌等[26]，在70例宮頸癌患者血清標本中有93%的標本檢測到血液循環(huán)中低水平的HPV[25]，可實現(xiàn)感染早期的篩查與治療，檢測的無創(chuàng)性減輕了患者檢查的痛苦，且降低了傷口感染風險。近期，華山醫(yī)院在1項有關青光眼睫狀體炎綜合征的研究中利用數(shù)字PCR技術對患者房水標本進行檢測發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR技術較熒光定量PCR技術的檢測效能更優(yōu)，尤其適合無菌體液標本中的微量病毒檢測。此外，有學者鑒于數(shù)字PCR技術高靈敏度、高精確度等技術優(yōu)勢，有學者將其應用于孕婦羊水[27]和腦脊液結核分枝桿菌的檢測中。

3.3感染性疾病病程變化及預后判斷方面的應用 人類免疫缺陷病毒(HIV)感染患者在接受反轉錄病毒治療后即使抑制了血液中病毒繁殖，但存在于潛伏感染細胞中的HIV-DNA仍可維持HIV的低水平復制，通過檢測釋放于血液循環(huán)中低載量的HIV-DNA，可評估用藥療效與病程發(fā)展。BOSMAN等[11]利用數(shù)字PCR技術與熒光定量PCR技術對經過治療后的患者進行體內殘余HIV-DNA檢測發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR技術比熒光定量PCR技術具有更高的靈敏度，且對于高序列多樣性的標本更具優(yōu)勢。有學者利用數(shù)字PCR技術檢出慢性阻塞性肺疾病患者痰液或肺泡灌洗液中存在的定植肺曲霉菌，提示及時檢出定植菌可有效預防呼吸系統(tǒng)疾病患者病情的進一步惡化與反復，并且可提高預后效果[28]。此外，日本科學家發(fā)現(xiàn)，可利用數(shù)字PCR技術的高靈敏度等特性對日本腦炎病毒及時進行早期檢測，有效緩解了由于發(fā)病急、預后差的疾病特性帶來的嚴重后果[29]，大幅度降低了嚴重并發(fā)癥的發(fā)病率和病死率。

3.4稀有基因突變的檢測 數(shù)字PCR技術在檢測野生型背景下的稀有突變基因方面也有明顯優(yōu)勢。相對于靈敏度低的實時熒光定量PCR技術，數(shù)字PCR技術可檢測到早期痕量的稀有突變，例如檢測背景復雜的痰液標本中的結核分枝桿菌[30]，以及甲型流感病毒的耐藥性突變。我國是流感病毒的高發(fā)地區(qū)，使用數(shù)字PCR技術檢測甲型流感病毒對奧司他韋耐藥性突變的靈敏度可下降至0.1%[31]，對防止患者無效用藥，幫助臨床盡快采取針對性治療，降低傳染病傳播風險等均發(fā)揮了積極作用。

3.5數(shù)字PCR技術實驗室結果標準化的進展 數(shù)字PCR技術檢測不需要憑借外部標準品即可實現(xiàn)精準定量的特性已被應用于熒光定量PCR技術標準品的測量[32]，美國國家標準技術研究院使用數(shù)字PCR技術標定了巨細胞病毒標準品[33]，由于標準品的多樣性與水平的偏差導致熒光定量PCR技術各實驗室間數(shù)據(jù)缺乏可比性，標準化對于質量控制、數(shù)據(jù)的可靠性與可交換性起到了至關重要的作用。

4 小 結

數(shù)字PCR技術作為一種新興的核酸檢測技術，以其高靈敏度、高精確度及絕對定量的技術特點，在各檢測領域均顯示出不可比擬的優(yōu)勢，為目標核酸絕對定量檢測帶來了歷史性進步。在病原菌檢測方面，數(shù)字PCR技術可精確定量病原體載量，檢測罕見微生物，輔助臨床闡釋病程、藥效監(jiān)測、發(fā)現(xiàn)早期疾病。目前，數(shù)字PCR技術尚在發(fā)展初期，距離廣泛應用于臨床檢測、取代實時熒光定量PCR技術仍有許多問題需要解決，包括降低運行成本、提高儀器自動化程度、提高檢測通量、建立行業(yè)統(tǒng)一標準等。隨著科學技術的不斷發(fā)展、檢測平臺的不斷優(yōu)化，有效解決以上問題指日可待，數(shù)字PCR技術將擁有更廣闊的應用前景。