（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004）

胰腺癌是一種有鮮明免疫抑制環(huán)境、預(yù)后極差、惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，5年生存率不到6%。有相關(guān)報告指出，到2030年，胰腺癌將成為惡性腫瘤中致死原因的第2位[1]。胰腺癌的高致死率與其自身的免疫抑制微環(huán)境及腫瘤內(nèi)T細胞的浸潤率明顯降低有著密不可分的關(guān)系。正是因為胰腺癌自身的特殊免疫環(huán)境，使得T細胞的生物活性異常，腫瘤細胞免疫逃逸，免疫檢查點異常等情況紛紛出現(xiàn)。后來研究者們發(fā)現(xiàn)，通過靶向增強宿主本身對于腫瘤的免疫力可能會是突破腫瘤的一個方向。得益于過繼細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）的啟發(fā)，嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor-modified T-cell，CAR-T）療法就此誕生。CAR-T是指提取患者外周血內(nèi)的T細胞，在體外由基因工程技術(shù)編碼CAR基因，將其通過病毒等載體嵌合在T細胞上再回輸入患者體內(nèi)的一項免疫治療新技術(shù)，是繼傳統(tǒng)手術(shù)、放化療以外的新型抗腫瘤免疫療法，并有望在未來成為最大的“腫瘤克星”。

1 CAR-T療法簡介

1.1 CAR-T的組成

T細胞是腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，在免疫缺陷環(huán)境中生長的腫瘤具有較強的免疫原性，缺少T細胞浸潤的實體瘤通常具有較差的預(yù)后意義。CART療法則是很巧妙地運用這一特征，體現(xiàn)了從經(jīng)典免疫學(xué)到合成細胞療法的轉(zhuǎn)變，研究者們通過疾病本身對T細胞進行改造，將選定抗原嵌合到T細胞上，從而改變了T細胞的路徑及用途，并最終改變其代謝和生物效應(yīng)。嵌合抗原受體（CAR）的組成部分是鉸鏈區(qū)（負責(zé)形成正確的構(gòu)像，形成二聚體）、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)域（負責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞的活化信號）、胞外抗原識別區(qū)域以及跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；而胞外的腫瘤抗原結(jié)合區(qū)域通常是由抗原識別區(qū)域的單鏈可變片段（single chain variable fragment，scFv）決定的，scFv決定了CAR的特異性，當(dāng)T細胞遇到特異性腫瘤抗原時，scFv段便會與腫瘤抗原結(jié)合，而后直接激活大量T細胞以及刺激大量細胞因子的分泌，使其對腫瘤細胞直接進行攻擊殺傷。

1.2 CAR-T的設(shè)計及發(fā)展

早期T細胞的小鼠和人體實驗，研究者們都是針對功能細胞本身以識別、純化和擴增來殺死腫瘤細胞，也有學(xué)者在上述研究中，進行了部分升級，如避免毒性的產(chǎn)生、減少免疫系統(tǒng)對其生物學(xué)功能的抑制等來進一步探索。此類過繼細胞治療方法包括使用供體白細胞輸注（DLI）、使用淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）、腫瘤浸潤的淋巴細胞（TILs）和病毒特異性T細胞（VSTs）等，但這些早期的療法都是依賴于宿主自然產(chǎn)生的免疫細胞，這便與本次論述的新型T細胞療法形成了鮮明的對比。

目前CAR-T的發(fā)展已到了第五代。（1）初代的CAR-T只包含一個胞外配體結(jié)合區(qū)域，例如有一個針對scFv，以及來自TCR復(fù)合物中的CD3ζ信號傳導(dǎo)域或Fc受體γ信號傳導(dǎo)域[2]，但因為缺乏共刺激信號，無法有效擴增且殺傷效應(yīng)也不穩(wěn)定，因此在實驗室應(yīng)用及臨床應(yīng)用中價值有限。（2）第二代CAR比第一代CAR擁有了更強大的體外殺傷能力，同時部分具有分化的能力，其中以靶向CD19的CAR最令人矚目，它在成人及兒童的急性淋巴細胞白血病 （acute lymphoblastic leukemia，ALL）中有顯著的療效，有相關(guān)文獻報道靶向CD19的CAR-T用于治療難治性ALL的完全緩解率可高達90%[3-4]，并于2017年FDA批準其上市用于臨床治療。（3）第三代CAR受體則是在共刺激結(jié)構(gòu)CD28和ITAM 信號鏈的之間再融合一個二級共刺激分子和4-1BB，產(chǎn)生了一個三重信號的CAR受體，第三代CAR受體改造的T細胞具有更好的效應(yīng)功能和體內(nèi)存活時間。但目前研究者多選用二代CAR-T而非三代，原因可能是過多的刺激分子協(xié)同作用和過多的嵌合物使生物體內(nèi)免疫反應(yīng)過于強烈[5]。（4）有研究者近年來提出了第四代CAR受體的概念，是在第三代CAR的基礎(chǔ)上增加了IL-12、IL-15等細胞因子，以強化正向調(diào)節(jié)T細胞的增殖、殺傷、存活能力[6]。（5）最新的第五代 CAR-T則是以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計出了可以避免人體發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的基因，并且可以在體外制備異體T細胞，可根據(jù)實驗和臨床的進展隨時提供給患者。

1.3 CAR-T療法的優(yōu)勢

CAR-T療法的主要優(yōu)勢在于沒有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，即“MHC非限制性”。正常人體中，T細胞一般處于活性抑制的幼稚狀態(tài)，只有當(dāng)T細胞受體識別巨噬細胞、樹突細胞等MHC成分后才會被激活，T細胞的這種特性被稱為“MHC的限制性”，由此可見MHC是免疫系統(tǒng)區(qū)分本身和異體物質(zhì)的基礎(chǔ)。而CAR結(jié)構(gòu)則可使T細胞越過MHC直接識別腫瘤細胞并且獲得共刺激信號，則CAR可以巧妙地越過許多腫瘤細胞免疫逃避的機制。其次還有許多其他優(yōu)點，如：（1）降低了患者排斥反應(yīng)的發(fā)生率；（2）靶點選擇范圍很廣，不僅可以利用腫瘤蛋白抗原，也可以利用多糖以及脂類非蛋白質(zhì)抗原；（3）定位精準，回輸?shù)襟w內(nèi)后將有效識別腫瘤細胞，激活并且增殖，以形成持續(xù)的腫瘤殺傷效應(yīng)；（4）應(yīng)用范圍廣泛，一種腫瘤抗原大多數(shù)情況在多種腫瘤細胞中都有表達，因此針對某一靶點抗原的CAR-T細胞構(gòu)建成功后，可應(yīng)用至多種腫瘤細胞中，諸如上述等許多優(yōu)點，研究者們開始發(fā)現(xiàn)這項技術(shù)逐漸為抗腫瘤的現(xiàn)況帶來了新的曙光。

2 CAR-T療法在胰腺癌治療中的應(yīng)用

2.1 胰腺癌的腫瘤抗原表位

學(xué)者們一直探索的理想腫瘤抗原表位是在癌細胞中高度表達的腫瘤特異性抗原，然而到目前為止實體瘤中發(fā)現(xiàn)的抗原都是腫瘤相關(guān)抗原，這類抗原在其他正常組織中也會有表達，這就會讓靶向治療存在一個很大的風(fēng)險，即“脫靶效應(yīng)”。因此選擇一個合適的腫瘤相關(guān)抗原，同時不斷探索胰腺癌的特異性抗原變得尤為重要。胰腺癌的癌細胞表面擁有許多不同的腫瘤相關(guān)抗原表位，以下是目前開展研究的幾個頗有突破的靶點：

2.1.1 B7-H3：又名CD276，是一個在細胞表面表達的免疫檢查點分子，能下調(diào)T細胞的生物活性及自然殺傷細胞的細胞毒活性，有明顯的免疫負調(diào)節(jié)作用。B7-H3在正常組織中的表達很少，而在很多惡性腫瘤中的表達異常升高。且與胰腺癌、前列腺癌、肺癌等惡性實體瘤的預(yù)后相關(guān)[7-8]，因此是一個強有力的免疫治療新靶點。Du H團隊2019年在發(fā)布了一項研究成果[9]：靶向B7-H3的CAR-T細胞，能夠明顯抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細胞在體外的生長。隨后他們在小鼠體內(nèi)進行了實驗，發(fā)現(xiàn)B7-H3-CAR-T細胞同樣能夠明顯抑制胰腺癌細胞的生長，小鼠的存活率達到了100%，并且沒有檢測到相關(guān)的毒副作用。

2.1.2 間皮素（mesothelin，MSLN）：是一種涉及腫瘤侵襲的細胞表面抗原，在間皮瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和其他癌癥中高度表達。MSLN在大多是胰腺癌中都高度表達，且只在心包膜、腹膜和心膜腔中有少量表達，因此是一個值得探究的靶點[10]。2015年，賓夕法尼亞大學(xué)完成了一例meso-CAR-T靶向治療胰腺導(dǎo)管腺（PDAC）癌者的臨床試驗（NCT01897415），實驗控制了患者的腫瘤生長，但由于移植物抗宿主反應(yīng)（graft versus host reaction，GVHR），降低了CAR-T治療效果，所以控制腫瘤生長的時間非常短暫[11]。2018年賓夕法尼亞大學(xué)的研究團隊又發(fā)表了一項臨床實驗報告[12]，評估了6例使用了meso-CART靶向治療的難治性PDAC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者，患者每周靜脈注射3次meso-CAR-T細胞，共注射三周，所有患者均未出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性癥狀，也無劑量限制毒性反應(yīng)，其中2例患者的無進展生存期分別為3.8和5.4個月，3例患者的總代謝活躍體積（metabolic active volume，MAV）保持穩(wěn)定，1例患者經(jīng)活檢證實中葉素表達下降率為69.2%。因此間皮素靶向的CAR-T治療也許可以作為一種探索PDAC免疫生物學(xué)的新工具，指導(dǎo)有效的T細胞免疫治療開發(fā)研究。另外Watanabe等[13]發(fā)現(xiàn)，結(jié)合細胞因子介導(dǎo)的溶瘤腺病毒增強CAR-T細胞治療有明顯的正向效果，將meso-CAR-T與表現(xiàn)TNF-α和IL-2的溶瘤腺病毒結(jié)合，可以增強抗腫瘤作用，使腫瘤浸潤淋巴細胞明顯增加且T細胞功能明顯增強；生存期延長。

2.1.3 成纖維活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）：是活化的成纖維細胞膜上面一種II型膜整合糖蛋白，F(xiàn)AP高表達于絕大多數(shù)人上皮腫瘤間質(zhì)中的成纖維細胞CAF表面，在胰腺癌、乳腺癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰十二指腸腺癌、子宮頸癌等多種惡性腫瘤細胞中可檢測到表達，在人體絕大多數(shù)正常組織中未見表達[14]。FAP促進了腫瘤生長、侵襲、浸潤、轉(zhuǎn)移，因此以FAP為靶點的免疫治療逐漸進入人們的視野。Gunderson等[15]在小鼠胰腺癌模型中使用了小分子抑制劑UAMC-1110來靶向攻擊FAP，并嘗試敲除FAP基因和大腸桿菌-半乳糖苷酶后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP的丟失與抗原特異性腫瘤T細胞浸潤有關(guān)；同時也發(fā)現(xiàn)靶向FAP和CAFs聯(lián)合放療能夠增強抗腫瘤T細胞的浸潤和功能，但這并不能獲得足夠的生存期。雖然結(jié)果不盡人意，但是這卻這給CAR-T靶向FAP治療胰腺癌的研究提供了一個全新的思路。

2.1.4 前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）：是一個含有123個氨基酸的糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于前列腺癌中，具有較高的腫瘤抗原特異性，有研究發(fā)現(xiàn)其過表達于胰腺癌的表面[16]。但也有相關(guān)研究表明，PSCA在正常的胰島細胞中也有表達[17]。Wente等[18]通過胰腺癌小鼠模型實驗證實了抑制PSCA的抗體1G8能夠抑制胰腺癌腫瘤的生長；同時證實了抑制PSCA的抗體在胰腺癌異種嫁接模型中能使腫瘤體積明顯縮小，也能減緩腫瘤的進展。關(guān)于CAR-T靶向PSCA在胰腺癌上的研究目前還尚少，也許這將會是一個值得學(xué)者們繼續(xù)探究的新免疫治療方向。

2.1.5 黏蛋白分子（MUC1）：是一種與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤抗原。有報道稱在胰腺上皮內(nèi)瘤變（Pan IN）的不同階段都有檢測到MUC1的異常高水平表達[19]。Posey AD Jr的團隊[20]用Tn-抗原特異性的單抗5E5進行CAR-T的構(gòu)建，再對MUC1陽性的胰腺癌細胞株進行了試驗，發(fā)現(xiàn)抗-Tn-MUC1-CAR-T細胞在胰腺癌的異種移植模型中表現(xiàn)出了明顯的靶向性細胞毒性，并且成功控制了腫瘤的生長。Wei等[21]嘗試了將PSCA靶向CAR-T聯(lián)合MUC1靶向CAR-T同時對非小細胞肺癌細胞系進行試驗，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合后可以有效抑制小鼠腫瘤的生長，證明了兩者可以協(xié)同清除腫瘤細胞。Yazdanifar M等[22]在2019年新發(fā)現(xiàn)了利用一種新的單克隆抗體TAB004的可變片段構(gòu)建CAR-T，可以特異性地與胰腺癌表面的MUC1結(jié)合，顯示出了強大的殺傷活性，然而并不會結(jié)合或殺死正常的上皮細胞；他們進一步證明了tMUC1-CAR-T細胞在體內(nèi)可以也控制原位胰腺腫瘤的生長。這些都提示了MUC1-CAR-T有望成為胰腺癌CAR-T治療中的新一代技術(shù)。但黏蛋白表達譜是近年來才發(fā)現(xiàn)的新腫瘤標志物，除MUC1以外的其他黏蛋白如，MUC4、MUC5、MUC6等都還需進一步的研究。

2.1.6 HER2：又稱人表皮生長因子受體-2，是一類抑制腫瘤凋亡，促進腫瘤增殖，增加腫瘤侵襲力，促進腫瘤血管生長的癌基因。目前已有相關(guān)研究證實[23]，HER2在胰腺腫瘤中有表達且其具有相當(dāng)大的異質(zhì)性。Raj等[24]近期發(fā)現(xiàn)在IV期PDAC患者（其中包括嚴重的肝、肺轉(zhuǎn)移的患者）來源的異種移植模型中使用靶向HER2可調(diào)節(jié)CAR-T細胞，發(fā)現(xiàn)靶向HER-2的可調(diào)節(jié)CAR-T細胞對晚期PDAC患者的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有效，單次注射就足以引起持久的緩解，繼續(xù)注射10～14次后可以使腫瘤生長緩解。這些數(shù)據(jù)都驗證了也許靶向HER2 CAR-T細胞可以作為強大的抗癌工具。

2.1.7 EGFR：又稱表皮生長因子受體，在腫瘤細胞中呈現(xiàn)過度表達，在正常細胞中也有表達。2017年Muzumdar等[25]指出90%胰腺癌患者都會過表達EGFR，這也為EGFR作為新的CAR-T治療靶點提供了新思路。而后也有學(xué)者證實了靶向EGFR的CART細胞療法在針對難治性膽道癌中的臨床實驗結(jié)果是安全有效的[26]，在進行實驗的17例患者中，1例患者獲得了完全緩解，10例達到了疾病穩(wěn)定狀態(tài)，同時也證實了靶向EGFR的CAR-T細胞療法中，Tcm細胞（中央記憶型T細胞）的聚集可以預(yù)測臨床反應(yīng)。

2.2 CAR-T療法治療胰腺癌存在的阻礙

實體瘤特別是胰腺癌中的CAR-T細胞相較于各類惡性血液腫瘤，仍然面臨著許多的阻礙。開展CAR-T研究需要考慮到幾個方面：（1）能夠克服胰腺癌微環(huán)境；（2）靶點的選擇必須具有特異性；（3）能夠準確定位腫瘤組織；（4）在胰腺癌腫瘤中存活率可觀；（5）能夠持續(xù)增殖擴增；（6）無嚴重的毒副反應(yīng)，對體內(nèi)正常組織不能造成致命損傷。綜上來看，CAR-T細胞療法在臨床上還面臨著許多的挑戰(zhàn)。

2.2.1 腫瘤微環(huán)境：腫瘤微環(huán)境是在實體瘤的發(fā)展和形成過程中，腫瘤細胞及其形成的免疫抑制分子、免疫抑制細胞等相互作用，形成的一個利于腫瘤細胞生長發(fā)育的免疫抑制環(huán)境。在這種環(huán)境中，腫瘤細胞可以逃避機體自身的免疫攻擊產(chǎn)生免疫逃逸。腫瘤微環(huán)境的組成是由三部分組成的：（1）基質(zhì)，包括基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)；（2）細胞，包括腫瘤細胞、免疫細胞等；（3）細胞因子，包括細胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子等[27]。胰腺癌中富含具有免疫抑制作用的腫瘤微環(huán)境，為胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移都創(chuàng)造了有利條件。2019年美國麻省理工學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)[28]，進一步縮小微型抗體可以獲得納米抗體（nanobody），基于納米抗體的CAR-T在突破各種腫瘤微環(huán)境中都有可觀的表現(xiàn)，通過在兩種不同的黑色素瘤小鼠模型中進行實驗，發(fā)現(xiàn)nanobody-CAR- T細胞能夠顯著減緩腫瘤生長，改善了小鼠的存活率并且沒有過多的毒副作用，同時他們也發(fā)現(xiàn)靶向EIIIB蛋白的CAR-T可以減少腫瘤中的血液供應(yīng)、損傷腫瘤血管、抑制微環(huán)境的免疫效應(yīng)、并且讓癌癥藥物更加具有滲透性。這一全新的視角，基于nanobody-CART細胞，或許能夠成為一種全新的模式用以突破腫瘤微環(huán)境的鴻溝。同年麻省理工學(xué)院的另一研究團隊又提供了一個全新的視角[29]，發(fā)現(xiàn)通過人為增加有腫瘤抗原的分子疫苗，使CAR-T大量活化且離開淋巴結(jié)，進入腫瘤細胞，大幅提高CAR-T在腫瘤中的殺傷效率，這在克服腫瘤微環(huán)境的抑制難題里也是一大突破。

2.2.2 細胞因子釋放綜合征：細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）也就是“細胞因子風(fēng)暴”，是CAR-T細胞療法常見的急性不良反應(yīng)。目前有學(xué)者認為，CRS是在CAR-T細胞作用于靶抗原后迅速被激活、增殖而后免疫系統(tǒng)被活化，多種細胞因子如：IL-6、IL-10等瞬間大量釋放所引起的全身性免疫反應(yīng)[30]。CRS的臨床表現(xiàn)以低血壓、低氧血癥、呼吸困難并伴有高熱為主，嚴重的CRS其血流動力學(xué)也會受到影響[31]，導(dǎo)致毛細血管壁異常或凝血障礙，甚至?xí)l(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血。通過基因工程，給CAR-T基因“裝置”一個可控基因，則可以有效避免負性細胞效應(yīng)的發(fā)生，在出現(xiàn)急性毒性的時候，可以有效及時地清除CAR-T細胞在體內(nèi)的存留。近期有學(xué)者[32]發(fā)現(xiàn)達沙替尼這種酪氨酸激酶抑制劑可以阻斷CAR-T細胞磷酸化，它扮演著CART細胞“開關(guān)”的角色用于控制CAR-T進入體內(nèi)后的生物活性，給輸注了CAR-T細胞的小鼠服用達沙替尼后，有70%的小鼠沒有發(fā)生CRS，有25%發(fā)生了CRS但卻存活了。目前CAR-T細胞治療胰腺癌仍然處于臨床試驗階段，如何深度了解CAR-T治療后的CRS并且正確處理它，也是我們今后在胰腺癌研究中需要努力和關(guān)注的方向。

2.2.3 脫靶效應(yīng)：現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原較少，所以CAR-T細胞識別結(jié)構(gòu)區(qū)域絕大多數(shù)會識別腫瘤相關(guān)抗原，近而導(dǎo)致許多正常組織的損傷。文獻報道，一例患者在應(yīng)用CAR-T細胞治療5 d后因多器官正常組織表達相關(guān)抗原引起的脫靶效應(yīng)而導(dǎo)致死亡的案例[33]。為了最大限度解決CAR-T細胞的脫靶效應(yīng)，來自哈佛醫(yī)學(xué)院和麻省總醫(yī)院的學(xué)者們近期發(fā)現(xiàn)了一種雙特異性T細胞接合器“BiTE”，經(jīng)過處理后它可以同時靶向兩個分子，研究團隊將BiTE通過基因工程技術(shù)與CAR-T嵌合后再輸注進植入人腦膠質(zhì)瘤細胞的小鼠體內(nèi)，讓其靶向T細胞表面抗原的同時也靶向腫瘤細胞表面的EGFR，經(jīng)過3周時間竟有80%的小鼠表現(xiàn)出了完全緩解，且嵌合了BiTE的CAR-T細胞只會局部殺傷腫瘤細胞，并沒有影響其他表達EGFR的正常組織[34]。

2.2.4 實體瘤組織的障礙：CAR-T細胞通過外周血進入實體瘤的過程中，由于實體腫瘤本身的組織致密，特別是其微環(huán)境中的細胞外基質(zhì)還有血管的復(fù)雜性等因素，這些都可能導(dǎo)致進入瘤體內(nèi)的CAR-T細胞的數(shù)量和活性大打折扣，從而對治療的效果也有很大的負面影響。有學(xué)者[35]在2018年設(shè)計出了一種可以同時表達IL-7和CCL19的CAR-T細胞，以促進T細胞增殖、維持T細胞穩(wěn)定的同時還召集大批外周血中的T細胞和樹突細胞進入瘤體的淋巴組織，這樣便大大增強了CAR-T細胞在實體瘤中的存活時間和殺傷腫瘤效應(yīng)。

3 CAR-T療法技術(shù)改良的新進展

目前CAR-T技術(shù)的安全性和其限制性，還在一定程度上阻礙了此項科學(xué)技術(shù)的發(fā)展?？茖W(xué)家為此也開發(fā)了多種改良的CAR-T技術(shù)以提高其免疫反應(yīng)安全性，根據(jù)其效應(yīng)的機制原理及上文綜述，總結(jié)可將近年來CAR-T技術(shù)的進展大致分為三類：

3.1 及時清除CAR-T細胞的殘留

將“自殺基因”整合到T細胞中，在這種裝置下，一個刺激細胞凋亡的分子在不良事件中就可以啟動自殺基因來殺死已轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細胞。目前這一領(lǐng)域的初步研究表明，單純皰疹病毒胸苷激酶（HSVTK）、iCasp9、突變的人胸苷激酶（mTMPK）、CD20可在供體T細胞中表達[36-39]，且在細胞治療的早期試驗階段表現(xiàn)出了可觀的安全自殺作用。在一項研究中[40]，HSV-TK、iCasp9和CD20的激活都最終體現(xiàn)了有效的T細胞破壞，然而iCasp9和CD20可以立即誘導(dǎo)細胞死亡，而HSV-TK表達的T細胞則需要暴露在更替洛韋中3 d才能充分發(fā)揮其作用，而mTMPK轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在所有的T細胞殺傷率中都體現(xiàn)了較差的反應(yīng)。目前，只有HSV-TK和iCasp9這兩項在進入臨床試驗中體現(xiàn)了較高的安全性。

3.2 雙抗原方案

這類技術(shù)的初衷便是以提高腫瘤殺傷的特異性，特別是針對實體腫瘤的特點。如在CAR-T細胞中同時表達CAR和iCAR（抑制性CAR受體）在接觸正常組織細胞時CAR-T的活性被抑制，而接觸到癌細胞時才會被激活。Fedorov等[41]通過利用PD-1、CTLA-4作為iCARs來表明，裝置iCARs可以有效阻止T細胞的激活、增殖和細胞因子的分泌；或是另一種雙抗原的方案，2012年Kloss的團隊[42]提出這種加入嵌合共刺激受體（CCR）的試驗概念，他們成功地改變了T細胞對腫瘤組織的特異性，CAR可以識別目標第一抗原而CCR可以識別第二抗原，只有在目標細胞同時表達這兩種抗原才會激活CAR-T細胞的生物活性，大大增加了CAR-T細胞殺傷作用的特異性。Roybal等[43-44]也提出了一個synNotch受體的概念，其研究目的是作為一個全新的細胞-細胞通信平臺，從而產(chǎn)生更安全有效的雙抗原T細胞，首先當(dāng)雙受體T細胞識別出第一個抗原時，synNotch受體可以釋放一種轉(zhuǎn)錄因子來控制CAR的表達，而針對第二抗原的CCR使T細胞進入了效應(yīng)細胞狀態(tài)，對靶細胞具有高度活化、增殖和細胞毒性狀態(tài)。

3.3 “裝置開關(guān)”策略

即通過開關(guān)分子選擇性的激活CAR-T細胞的存活。研究者Wu的團隊[45]在近期提出了一種互補性的正調(diào)控方式，成為ON-switch CAR-T細胞，它可以在外源性分子（如AP21967）存在的情況下消除攜帶同源抗原的靶細胞，其機制是將CAR分成兩個部分，在遇到外源性分子的時候兩部分進行二聚化，而后完成組裝成一個完整的CAR，進而激活CAR-T細胞的生物學(xué)活性。這個“開關(guān)”的結(jié)構(gòu)就可以通過逐步滴定來調(diào)節(jié)分子濃度，從而調(diào)節(jié)T細胞激活的時間或刪除一些小分子結(jié)構(gòu)，可以明顯減輕CAR-T生物活動中的一些毒性作用。類似的設(shè)計，Juillerat的團隊提出了一種“瞬態(tài)”CAR-T的概念[46]，這種方法是構(gòu)建一種全新的CAR結(jié)構(gòu)，在鉸鏈域直接進行二聚，并在其中添加了特定的分子結(jié)構(gòu)；而后的試驗中這一概念被證實可以用于給分裂CAR結(jié)構(gòu)提供一個基本平臺，并為之后的CAR-T細胞工程化發(fā)展指出了一條更安全的道路。另一個概念是利用“雙功能分子”作為控制T細胞的活性“開關(guān)”，雙功能分子可以同時結(jié)合癌細胞呈遞的抗原和T細胞的表面受體。因此，只有其存在時CAR-T細胞才能被激活。有研究提出，雙功能分子可以作為一個連接的橋梁，一邊連接可有效殺死癌細胞的細胞毒性T細胞，另一邊可以連接針對CD3分子的T細胞和在腫瘤細胞表面的相關(guān)抗原，從而雙重開關(guān)激活T細胞，進而有效破壞目標靶細胞[47]。

4 展望

CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)腫瘤中已取得了不俗的成果，已一躍成為當(dāng)下腫瘤治療中最有前景的治療方式之一，甚至有部分學(xué)者認為這將會是未來治愈腫瘤的“最佳選擇”。胰腺癌是當(dāng)代“癌中之王”，因其獨特的腫瘤生物學(xué)特性和其臨床治療的滯后性，使得胰腺癌逐漸成為了CAR-T治療的重點對象，且許多針對胰腺癌的新型CAR-T治療方案已經(jīng)展露出了非常光明的前景。尋找特異性胰腺癌腫瘤抗原靶點將成為胰腺癌CAR-T治療的一大突破口，我們應(yīng)該利用好現(xiàn)代基因測序技術(shù)來積極尋找關(guān)于胰腺癌的特異性腫瘤生物分子標志，為CAR-T特異性功能設(shè)計創(chuàng)造更多的可能性。同時要結(jié)合胰腺癌的免疫學(xué)特點，聯(lián)合應(yīng)用免疫療法協(xié)調(diào)解決胰腺癌微環(huán)境免疫抑制、抗原逃避等問題，最大限度地擴增CAR-T細胞的生物學(xué)活性。我國目前已經(jīng)成為開展CAR-T臨床試驗最多的國家，隨著CAR-T設(shè)計思路和治療方案的不斷創(chuàng)新，CAR-T治療有望成為胰腺癌治療的一大“利器”。