陳琳 周紅

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科150001

COPD是一種以持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的疾病。由于其患病人數(shù)多,病死率高,消耗大量社會資源,所以受到人們的廣泛關注。目前對于COPD的相關研究甚多,但目前沒有確切的治療方法可以阻止COPD的進展,因此迫切需要對其發(fā)病機制進行新的探索。除了已知的機制之外[1],有學者提出細胞凋亡假說、自身免疫反應、微生物組的變化以及無效的受損修復機制等[2]。最新發(fā)布的慢性阻塞性肺疾病全球倡議2019新增了關于COPD危險因素的4項研究,包括社會經(jīng)濟地位、室內生物燃料、人類免疫缺陷病毒感染及基因多態(tài)性[3-8]。目前隨著一些新的測序技術的發(fā)現(xiàn),有關微生物組的變化的研究受到人們的高度重視,特別是肺部微生態(tài)。但肺部菌群在COPD患者中的地位和作用一直存在爭議,但隨著研究技術的發(fā)展,可能為研究COPD的發(fā)病機制和治療方法提供一個新視角。因此,本文就目前國內外關于肺部微生態(tài)在COPD中的研究進展進行系統(tǒng)闡述。

1 COPD的肺部菌群與下呼吸道微生態(tài)的研究方法

1.1 COPD的肺部菌群 人體的呼吸道分上、下呼吸道,由于呼吸道與外界相通,所以無論是上呼吸道或是下呼吸道應該都存在一定的微生物,但是人們對下呼吸道及肺部的微生物菌群的研究卻少之又少。傳統(tǒng)觀念認為由于上呼吸道的黏液及纖毛運動的作用,顆粒物和微生物到達不了下呼吸道,所以認為下呼吸道及肺部是無菌的。但是隨著支氣管鏡及非培養(yǎng)的微生物檢測技術的發(fā)展,目前證明健康人群的肺部并不是無菌的,并明確研究了幾種肺部疾病中的微生物菌群組的變化[9-13]。相關研究表明肺部存在的部分菌群與口鼻咽部菌群重疊,但肺部缺少存在于口鼻咽部的棒狀桿菌屬、狡詐菌屬等,研究還發(fā)現(xiàn)口鼻咽部同樣也缺少肺部的部分菌群如惠普爾養(yǎng)障體等,這也提示了口鼻咽部可能并不是肺部微生物的唯一途徑[14-15]。

COPD的肺部菌群相關研究結果表明,隨著COPD病情進展,肺部菌群的多樣性也會隨之改變。Millares等[16]通過16S r RNA基因擴增和焦磷酸測序分析了同一COPD患者不同嚴重程度的痰液標本情況,發(fā)現(xiàn)鏈球菌、假單胞菌、莫拉菌、嗜血桿菌、奈瑟菌、無色桿菌和棒狀桿菌屬在急性加重期的相對豐度增加超過20%,但在2組之間沒有發(fā)現(xiàn)生物多樣性參數(shù)的顯著差異。Erb-Downward等[17]對COPD患者與 “健康”吸煙者的支氣管肺泡灌洗液進行測序,發(fā)現(xiàn)中度和重度患者中肺部微生物組的菌群多樣性減低。同時此項研究的實驗者通過獲得的COPD患者的肺外植體進行解剖學分析發(fā)現(xiàn),晚期COPD患者的同一肺部細菌群落中可能存在顯著的微觀解剖差異。而且這在受試者左肺上葉特別明顯,嗜血桿菌在左肺上葉的節(jié)段性支氣管中占主導地位,嗜麥芽窄食菌在左肺上葉的遠端支氣管中占主導地位,形成鮮明對比的是,假單胞菌在中上支氣管和同一肺內的許多其他部位中占主導地位。

目前有研究者提出了COPD的肺部菌群 “惡性循環(huán)假說”,該假說提出有吸煙史的COPD患者,因吸煙帶來的氣道黏膜清除能力下降,當微生物進入呼吸道后可在肺部定植,隨后進一步損傷肺部防御功能,損傷氣道黏膜,并且可識別受體誘導炎癥及免疫反應,而炎癥反應又會損害宿主的免疫力,進而使得微生物長期的定植于肺部,最終導致肺部的慢性炎癥和微生物定植,形成惡性循環(huán)[18-19]。

1.2 下呼吸道微生態(tài)的研究方法

1.2.1 下呼吸道的標本采集及評價 由于下呼吸道的解剖結構的特殊性和病原學的復雜性,準確的完成下呼吸道的標本采集并非易事。痰標本的質量可直接影響病原學診斷的準確性和可靠性。常見的標本采集方法及評價如下,(1)咳痰標本:此方法應用最早且最廣泛,采集方便、易行,但由于會受到口咽部定植菌的污染,所以最受爭議。(2)經(jīng)支氣管鏡采樣:包括經(jīng)纖維支氣管鏡吸引、防污染毛刷采樣、支氣管肺泡灌洗等。這些方法可以減少標本的污染,提高微生物的檢出率,這將有益于肺部微生態(tài)的研究進展。(3)經(jīng)氣管穿刺吸引物:一般認為經(jīng)氣管穿刺吸引物敏感性較高,但特異性欠佳,且創(chuàng)傷性較大,目前臨床上已經(jīng)被防污染套管毛刷等其他技術所取代。(4)經(jīng)胸壁針刺吸引物:與其他有創(chuàng)操作相比,經(jīng)胸壁針刺吸引物特異性較高而敏感性較差。(5)開胸肺活檢組織標本:組織既可送檢病理檢查,還可做微生物學檢驗,準確率高,最大缺陷就是需要全身麻醉及實施胸廓切開術。(6)經(jīng)人工氣道吸引物:此方法收集的分泌物是目前臨床較常用的微生物檢驗標本,但由于一些致病菌的存在,故建立人工氣道患者肺部病原學診斷更為困難。

1.2.2 下呼吸道微生態(tài)的實驗室檢測方法 目前常見的檢測方法包括:涂片鏡檢、培養(yǎng)鑒定、組織病理、免疫學和分子生物學技術檢測等。其中前兩種是人們早期常用的檢測方法,但檢測的肺部微生物有限。隨著非培養(yǎng)檢測技術的出現(xiàn)與發(fā)展,目前對于肺部微生態(tài)的研究得到了進一步的了解。常見的分子生物學技術檢測方法主要包括基因測序技術、宏基因組技術、PCR技術、基因芯片技術、指紋圖譜技術、FISH熒光原位雜交技術,末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術等[20]。其中針對肺部微生態(tài)較為常用的方法是基因測序技術及宏基因組技術?；驕y序方法包括16S r RNA全長基因測序法及焦磷酸測序法。16S r RNA全長基因測序技術[21]是通過對比已知數(shù)據(jù)庫的基因序列與通過測序獲得的16S r RNA全長基因序列,來確定標本中的微生物種類。新一代的DNA測序技術焦磷酸測序法[22]是基于酶級聯(lián)反應的序列分析技術,它將退火后的引物與檢測樣本模板DNA在4種酶的作用下,耦聯(lián)引物上每一個脫氧核糖核苷三磷酸的聚合與熒光信號的釋放,最后通過儀器測定熒光信號的強度,達到實時檢測DNA序列的每一個堿基,并得到一定的峰值。宏基因組技術[23]是從樣本中直接提取全部微生物DNA或RNA,建立一個文庫,然后研究及分析全部微生物的遺傳組成及功能基因,它對于研究肺部微生態(tài)的多樣性提供了一種新的方式。

2 COPD與腸道菌群微生態(tài)失衡的相關研究

對于COPD的病理機制的研究,目前仍認為慢性氣道炎癥是關鍵,但對于COPD的疾病本質仍無明確揭示,且COPD穩(wěn)定期的治療仍缺乏有效的方法,所以需要從新的角度來認識COPD的根本病因及發(fā)展機制。目前有相關研究證明COPD患者常常合并胃腸道疾病,例如炎癥性腸病[24]或腸易激綜合征[25]。Madan等[26]通過研究嬰兒從出生到21個月期間呼吸道和腸道微生物群的動態(tài)變化情況顯示,腸道菌群的定植預示著呼吸道菌群的種類,并且存在有很大的重疊性,同時隨著時間的推移,細菌多樣性顯著增加,且呼吸道中菌群獲得的多樣性更快。此外,實驗表明飲食的變化也會導致呼吸道微生物群落的改變,這表明營養(yǎng)與呼吸道微生物群落的發(fā)展之間存在聯(lián)系。有研究表明人體正常菌群與宿主共生,在腸道中具有特定的優(yōu)勢。所以在正常情況下腸黏膜的共生菌可以阻止病原菌的入侵,這一現(xiàn)象被稱為 “細菌拮抗”或 “細菌干擾”[27]。對于肺部微生物,有研究者對健康個體肺部微生物進行DNA檢測,發(fā)現(xiàn)口腔和肺部的微生物群落的分類譜相似,所以這些微生物可能是通過口腔少量吸入進入肺部,并短期內繁殖。但實驗發(fā)現(xiàn)特定細菌在肺中的豐度顯著高于從口腔中出現(xiàn)的預期,表明肺微生物組不完全來自口腔[28]。并且肺部微生物的環(huán)境條件與其他部位不同。綜上,微生物的短暫性進入以及其選擇性消除是肺部微生物組成和穩(wěn)態(tài)維持的主要決定因素。

在COPD的發(fā)生、發(fā)展中,有各種因素可導致腸道微生態(tài)的失衡,例如抗生素的使用、生活方式的不同、飲食習慣的改變等。當COPD處于急性加重期,大量使用廣譜抗生素后,腸道的屏障作用下降,腸道內正常的寄生菌生長受到抑制,而棲居在胃腸道下端的革蘭陰性桿菌及霉菌開始增殖,導致正常的菌群生態(tài)組成發(fā)生改變,引起菌群失調。大量的革蘭陰性菌細胞壁溶解,釋放大量的具有多種生物活性的內毒素[29],當肝臟無法完全解毒及相應抗體無法完全中和時,會引起內毒素入血,導致內毒素血癥,然后內毒素經(jīng)下腔靜脈進入右心房,接著進入肺動脈及通過毛細血管灌注到其他器官,但是肺部受到的影響較大[30]。內毒素在肺部會引起大量炎性介質釋放,導致慢性炎癥形成,直接或間接影響著COPD的病理改變及病情進展。綜上,調節(jié)及穩(wěn)定COPD患者的腸道菌群微生態(tài),減少內毒素的釋放,對于預防及治療COPD可能是一種新的途徑。目前常見的調節(jié)腸道菌群微生態(tài)的方法有用營養(yǎng)的方法調整、抗生素調整、活菌制劑的應用等。

3 COPD的肺部微生態(tài)與吸煙、大氣顆粒的相關研究

3.1 吸煙對COPD的肺部微生態(tài)的影響 眾所周知,吸煙對于人體的傷害是巨大的,有研究認為,COPD的疾病狀態(tài)可隨著吸煙暴露的程度而變化。吸煙可以加重氣道炎癥和氣道重塑,使氣道壁和肺實質發(fā)生慢性炎癥及結構的破壞,上述改變都可作為微生態(tài)失調的微觀環(huán)境因素。相關研究顯示,COPD患者與健康吸煙人群的肺部微生物有明顯不同[31-32]。雖然健康吸煙人群和健康非吸煙人群在肺部微生物種群組成中是相似的,但是2組人群的口腔菌群卻明顯不同。在吸煙者體內,從口腔吸入肺部的微生物種群與炎癥的加重有關,當口腔微生物發(fā)生變化時,機體不能有效地清除從口腔吸入肺部的微生物,即可導致疾病的發(fā)展,這可能就是只有部分吸煙者會患COPD的原因。因此,分析呼吸道微生態(tài)對于有吸煙史的COPD患者的早期診斷是有益的。

3.2 大氣顆粒對COPD的肺部微生態(tài)的影響 近年來,隨著人類科技發(fā)展的加速,生物燃料使用、工業(yè)生產(chǎn)、交通活動及自然因素等綜合因素使得人類的環(huán)境問題越來越嚴重,其中大氣顆粒物對人類健康的影響也越來越受到人們的關注。顆粒物按其直徑大小可分為粗顆粒物、細顆粒物、超細顆粒物。因為呼吸系統(tǒng)與外界相同,所以肺部是大氣顆粒物主要作用的靶器官,但具體作用機制尚不明確。但隨著肺部微生態(tài)認識的不斷深入,大氣顆粒物暴露對肺部微生態(tài)的影響以及在COPD發(fā)病機制中的作用開始受到人們的關注[33]。目前已知的致病機制主要是通過炎性損傷、氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)失調、免疫損傷、氣道高反應性、DNA損傷等機制[34]。當大氣顆粒物吸入呼吸道后,通過上述機制使呼吸道原有的生態(tài)平衡發(fā)生紊亂,失去菌群屏障,菌群的種類發(fā)生改變,某些菌種轉變?yōu)闂l件致病菌,間接或直接促使COPD的發(fā)生發(fā)展。Yu等[35]發(fā)現(xiàn),顆粒物的暴露與體內微生物菌群的多樣性密切相關,并隨著周圍顆粒物暴露量以及所處的環(huán)境污染程度的增加而增加。目前研究人員越來越多的關注顆粒物與COPD的肺部微生態(tài)的相關研究,想進一步探索COPD的發(fā)病機制,為COPD的治療開辟新途徑。

4 小結

隨著人類疾病的發(fā)展,COPD已經(jīng)成為同高血壓、糖尿病 “等量齊觀”的最常見的慢性疾病,目前成為世界第3位死因。但是COPD目前的治療方法仍不是行之有效,依舊無法根治,甚至無法有效延緩疾病進展,所以目前迫切需要從新的角度來了解COPD根本的發(fā)生發(fā)展機制,來制訂新的治療方法。隨著分子生物學的發(fā)展,人們逐漸認識到肺部微生態(tài)這一概念,相關研究也在進一步探索,但目前尚不能明確肺部微生態(tài)在COPD發(fā)病機制或治療方法中的具體作用。相信未來隨著技術的發(fā)展,當明確COPD發(fā)病機制后,隨之而來的微生物制劑或是聯(lián)合其他藥物的治療方法或許有利于COPD患者的防治。

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