張挺峰, 王 睿, 劉長(zhǎng)仲,*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070;2. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 甘肅張掖 734000)

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum隸屬于半翅目(Hemiptera)蚜總科蚜科(Aphididae)，在世界各地廣泛分布，是許多豆科作物及牧草的主要害蟲之一(賀春貴, 2004)。在美國(guó)，豌豆蚜的危害可導(dǎo)致苜蓿生產(chǎn)者每年損失大約6 000萬(wàn)美元(Harmonetal., 2009)。在我國(guó)西北苜蓿種植區(qū)，豌豆蚜每年可造成苜蓿生產(chǎn)10%～30%的經(jīng)濟(jì)損失(特木爾布和等, 2005)。除直接取食為害外，豌豆蚜還能傳播苜?；ㄈ~病毒、豌豆耳突花葉病毒等30余種病毒，從而造成嚴(yán)重的間接危害(He and Zhang, 2006)。長(zhǎng)期以來(lái)，蚜蟲防治主要依靠大面積使用化學(xué)農(nóng)藥，然而，單一使用化學(xué)農(nóng)藥，致使大量天敵被殺傷，破壞了天敵和蚜蟲的消長(zhǎng)關(guān)系；蚜蟲抗藥性產(chǎn)生，且隨著用藥次數(shù)和用藥量的增加而交替上升；隨之而來(lái)的大量化學(xué)農(nóng)藥使用所造成的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題也日益突出(Scottetal., 1998; Bielza, 2008; Gaoetal., 2012)。

昆蟲病原真菌以其廣泛的存在和豐富的多樣性為病蟲害綜合防治提供了一種可持續(xù)的解決方案。利用病原微生物制成的生物農(nóng)藥由于其生態(tài)友好性和持久性，無(wú)殘留、無(wú)公害、無(wú)毒或低毒、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，在昆蟲生命周期的各個(gè)階段都是首選的殺蟲劑。用昆蟲病原真菌防治害蟲，不同的菌種和菌株對(duì)同一寄主昆蟲的感染毒力常常不同，一般來(lái)說，來(lái)自原寄主的病原真菌比來(lái)自其他寄主的病原真菌對(duì)防治對(duì)象有更高的毒力或?qū)Ｒ坏淖饔糜诎袠?biāo)有害生物。因此，收集田間自然感染的蟲尸，分離和篩選高致病性的昆蟲病原真菌是豌豆蚜生物防治的基礎(chǔ)。本研究于2016年6月在甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿實(shí)驗(yàn)基地，采集獲得自然染病的豌豆蚜蟲尸，分離和純化出一株具有高致病力的病原真菌，自命名TF-2。通過對(duì)TF-2菌株形態(tài)觀察和分子鑒定以及毒力測(cè)定的研究，旨在為利用昆蟲病原真菌進(jìn)行豌豆蚜的生物防治提供菌種資源和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離

2016年6月，將采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)基地(蘭州安寧區(qū))的豌豆蚜蟲尸先用75%酒精消毒3 s，再用滅菌蒸餾水洗滌3次，放入1.5 mL離心管中，加入0.5 mL滅菌蒸餾水，用組織勻漿器將蟲體勻漿并稀釋10倍，取20 μL用涂布棒均勻涂布在PDA固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中(SPX-250-GB，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，在25±1℃、75%±5% RH、光周期16L∶8D條件下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行2次劃線分離，自命名TF-2，保存于4℃冰箱備用。

1.2 供試蚜蟲

試驗(yàn)所用紅色型豌豆蚜采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)基地，挑選無(wú)翅胎生雌蚜，單頭飼養(yǎng)在盆栽蠶豆Viciafabae‘Lincan 2’ (臨蠶2號(hào)，購(gòu)于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)植株上進(jìn)行單克隆系培養(yǎng)，作為供試蟲源。飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃、50%±10% RH的條件下飼養(yǎng)備用。

1.3 回接試驗(yàn)和生物學(xué)測(cè)定

采用浸漬法(Yu, 2016)和改進(jìn)的離體葉片培養(yǎng)法(Feng and Johnson, 1991)進(jìn)行回接試驗(yàn)和生物學(xué)測(cè)定。將分離菌株TF-2培養(yǎng)10 d后，用2 mL 0.01% Tween-80無(wú)菌水沖洗菌落獲得分生孢子，在顯微鏡下配制成不同濃度(1×103, 1×104, 1×105, 1×106和1×107孢子/mL)孢子懸浮液。用毛筆挑選個(gè)體大小基本一致的紅色型無(wú)翅成蚜，浸入孢子懸浮液(1×107孢子/mL)中3～5 s后挑出，自然晾干，選擇活動(dòng)自如、無(wú)殘缺個(gè)體，接入新鮮潔凈蠶豆葉片上，用浸濕的棉團(tuán)包裹葉柄，置于底鋪濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)內(nèi)，在濾紙上滴無(wú)菌水保濕，每葉接蟲5頭，每一濃度處理30頭，重復(fù)3次，對(duì)照組(CK)用0.01% Tween-80無(wú)菌水處理。接種蚜蟲放入恒溫培養(yǎng)箱中(25±1℃, 75%±5% RH, 光周期16L∶8D)飼養(yǎng)，每隔12 h觀察1次，觀察蚜蟲體染菌情況，記錄處理成蟲死亡數(shù)量，及時(shí)清除若蚜。葉柄棉花團(tuán)適時(shí)補(bǔ)充水分，每隔3 d更換1次葉片。

1.4 病原真菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

將保存于4℃冰箱中的菌株TF-2接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃活化5 d，再用挑菌針在菌落邊緣挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，并在接種中心外傾斜45°角插入3個(gè)無(wú)菌蓋玻片(18 mm×18 mm)，在恒溫培養(yǎng)箱中(25±1℃, 75%±5%RH, 光周期16L∶8D)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡自第2天開始觀察記錄菌落形態(tài)、顏色和菌落生長(zhǎng)情況，分生孢子、分生孢子梗、晶體等的形成情況，測(cè)量并拍照。根據(jù)菌株形態(tài)特征，參考《昆蟲真菌學(xué)》(李增智和蒲蟄龍， 1996)檢索表進(jìn)行初步鑒定。

1.5 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1菌株DNA的提?。簩⒒罨木杲臃N于PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱(25±1℃, 75%±5% RH, 光周期16L∶8D)培養(yǎng)20 d，用滅菌的刀片將菌絲從培養(yǎng)基上刮下，收集在滅菌濾紙上，待菌絲干燥2 h后，稱取100 mg，置于滅菌研缽中，加入液氮，研磨成粉末，-20℃保存?zhèn)溆?。采用CTAB法(Guoetal., 2000)提取菌株總DNA(提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司)。

1.5.2rDNA-ITS序列的擴(kuò)增和測(cè)定：選擇使用真菌rDNA-ITS通用引物(Whiteetal., 1990)：ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3′)和ITS4-R(5′-CCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR反應(yīng)體系(50 μL): 5 μL 10×Dream Taq Green Buffer (Thermo Fisher Scientific), DNA模板2 μL, dNTPs (2.5 mmol/L each) 4 μL, ITS1-F (10 μmol/L) 2 μL, ITS4-R (10 μmol/L) 2 μL, 0.5 μL Taq酶，補(bǔ)充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性1 min, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)后，送交南京金瑞斯生物科技有限公司測(cè)序。

1.5.3分子系統(tǒng)發(fā)育分析：將測(cè)得的rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)并申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)。下載相關(guān)菌株的ITS序列，使用MEGA6.0軟件運(yùn)用Clustal X方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)(Cabbone and Kohn, 1993; Moralesetal., 1995; Eapenetal., 2005)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 TF-2菌株回接后豌豆蚜成蟲的罹病癥狀及其毒力

將分離菌株孢子懸浮液(1×107孢子/mL)，對(duì)紅色型豌豆蚜成蟲進(jìn)行回接殺蟲試驗(yàn)。接菌培養(yǎng)2 d 后，浸染蚜蟲行動(dòng)遲緩，體色發(fā)暗，在蟲體的足關(guān)節(jié)處及腹管等處生出白色菌絲(圖1: C)，4 d后蟲體僵硬且全身布滿菌絲(圖1: E, F)，其癥狀與自然染病僵蚜(圖1: A)一致。回接試驗(yàn)證明分離菌株是一株寄生于豌豆蚜的病原真菌。不同濃度TF-2分生孢子浸染豌豆蚜成蟲毒力測(cè)定結(jié)果表明：隨分生孢子濃度增大，致死率升高，最高濃度處理(1×107孢子/mL) 6 d 后校正死亡率達(dá)到100%(表1)，可見分離得到的TF-2菌株對(duì)豌豆蚜成蟲具有較強(qiáng)的致病力。

2.2 菌株鑒定

2.2.1菌株的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征：將菌株TF-2在 PDA 培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)10 d后，菌落直徑24～30 mm。菌落正面白色絨氈狀(圖2: A)，菌落背面奶油色泛黃(圖2: B)。分生孢子梗較長(zhǎng)呈瓶狀，常見從平臥菌絲上單生或側(cè)輪生2～3個(gè)，大小為(19～42) μm×(1.1～2.5) μm，基部較粗至尖端逐漸變細(xì)(圖2: C, D)。分生孢子長(zhǎng)橢圓形(圖2: E)，大小為(4.2～11.8)μm×(1.6～2.6) μm，還能產(chǎn)生卵圓形或橢圓形小分生孢子。菌絲體可產(chǎn)生大量呈八面體晶體(圖2: F)。最適生長(zhǎng)溫度為25±1℃，當(dāng)溫度超過34℃菌株停止生長(zhǎng)。根據(jù)以上形態(tài)觀察結(jié)果，參考李增智和蒲蟄龍(1996)以及Zare和Games(2003)的研究，初步判斷該菌株為蠟蚧菌屬真菌。

圖1 菌株TF-2侵染豌豆蚜癥狀

表1 處理后不同時(shí)間TF-2菌株對(duì)豌豆蚜成蟲的致病力

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)。Corrected mortality (%)=(Mortality in the treatment group-Mortality in the control group)/(1-Mortality in the control group).

圖2 菌株TF-2形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

2.2.2分子鑒定：為進(jìn)一步確定該真菌類型，以ITS1-F和ITS4-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到菌株TF-2的ITS序列送南京金瑞斯生物科技有限公司測(cè)序，得到630 bp DNA序列(GenBank登錄號(hào): MG834532)。通過Blast與GenBank中已有的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株TF-2的rDNA-ITS序列與長(zhǎng)孢蠟蚧菌Lecanicilliumlongisporum(GenBank登錄號(hào): KX426564)相應(yīng)序列一致性高達(dá)99%。選擇GenBank中蠟蚧菌屬Lecanicilliun已公布的具代表性的9個(gè)菌株的DNA序列，采用Clustal X將已知序列和測(cè)得的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)完成后用MEGA6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株TF-2與同屬其他種的親緣關(guān)系(圖3)。Bootstrap值大于70%相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的95%，一般75%以上認(rèn)為是可信的(葉麗芹等, 2011)。結(jié)合形態(tài)特征與rDNA-ITS同源性比對(duì)結(jié)果，確定分離得到的菌株TF-2為長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum。

圖3 基于rDNA-ITS序列的菌株TF-2和蠟蚧菌屬菌種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

昆蟲病原真菌是自然界中昆蟲種群數(shù)量得以控制的主要因素之一，是園藝、林業(yè)和農(nóng)業(yè)中真菌殺蟲劑的重要組成部分(Inglisetal., 2000)。本研究從自然染菌的豌豆蚜蟲尸上分離得到一株病原真菌，經(jīng)毒力測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子鑒定，確定該真菌為長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum。室內(nèi)毒力測(cè)定顯示長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2對(duì)豌豆蚜成蟲具有很強(qiáng)的致病力，是一種具有開發(fā)潛力的病原真菌。ITS序列由于其易擴(kuò)增、信息量豐富、研究廣泛等諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為真菌鑒定的通用核心條形碼(Schochetal., 2012)。利用ITS序列對(duì)長(zhǎng)孢蠟蚧菌以及蠟蚧菌屬的研究已有報(bào)道(張召榮等, 2015; Berlanga-Padillaetal., 2016; Wangetal., 2017)。

長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum是一種重要的蟲生真菌，以前被廣泛地稱為蠟蚧輪枝菌Verticilliumlecanii。蠟蚧輪枝菌是一個(gè)復(fù)合種，其寄主廣泛，可寄生蚜蟲、介殼蟲、螨蟲、真菌等不同類型。國(guó)內(nèi)外在蠟蚧輪枝菌菌株篩選、發(fā)酵生產(chǎn)和制劑加工上均取得顯著進(jìn)展，已登記的生物農(nóng)藥Vealrtec?，對(duì)溫室蚜蟲和粉虱防治具有很好的效果(Goetteletal., 2008)。Gams和Zare于2001年通過ITS序列分析將蠟蚧菌從輪枝菌屬中分出，建立蠟蚧菌屬Lecanillium(Gams and Zare, 2001)，隨后，又逐漸將蠟蚧菌中的部分株系歸為蠟蚧菌屬的其他種。蠟蚧菌屬現(xiàn)有21個(gè)種，其中與昆蟲有關(guān)的主要有蠟蚧菌L.lecanii， 漸狹蠟蚧菌L.attenuatum， 長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum，L.muscarium和L.nodulosum5個(gè)種(Goetteletal., 2008)。

微生物農(nóng)藥可以大幅降低化學(xué)殺蟲劑用量及其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，是無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品首選藥劑。但微生物農(nóng)藥發(fā)展速度緩慢，目前用于蚜蟲防治的不多，主要原因在于真菌孢子萌發(fā)需要特定的條件，如溫度和濕度。有研究表明蠟蚧輪枝菌V.lecanii在100%RH條件下至少需要36 h才能侵染蚜蟲(Alavoetal., 2002)。利用長(zhǎng)孢蠟蚧菌防治桔粉蚧殼蟲Planococcuscitri， 棉蚜Aphisgossypii， 甘藍(lán)蚜Brevicorynebrassicae， 麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜Metopolophiumdirhodum和根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita等已有相關(guān)報(bào)道(Kimetal., 2010; 蘭木佐, 2010; Safooraetal., 2014; Baiswaretal., 2016; Sepidehetal., 2017)。以上研究結(jié)果均為在室內(nèi)可控條件下取得的，但在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中殺蟲效果仍不確定。因此，應(yīng)深入研究了解寄主與病原菌之間的關(guān)系、病原菌的侵染機(jī)制及其田間的流行學(xué)等特點(diǎn)，才能使微生物農(nóng)藥得到更大的發(fā)展。我國(guó)北方地區(qū)蔬菜溫室具有真菌發(fā)生的適宜溫度和濕度，為昆蟲病原真菌的發(fā)生創(chuàng)造了良好的環(huán)境條件，微生物農(nóng)藥的應(yīng)用前景值得關(guān)注。

雖然長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2對(duì)豌豆蚜具有較好侵染效果。但由于病原真菌受到溫度、濕度、光照、生物等外界環(huán)境因素的影響，其在溫室和田間應(yīng)用效果還有待于進(jìn)一步研究明確，后續(xù)我們將針對(duì)長(zhǎng)孢蠟蚧菌防治豌豆蚜的應(yīng)用策略與劑型等開展相關(guān)研究。本研究得到的長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2分離自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿實(shí)驗(yàn)基地自然染病的豌豆蚜蟲尸，屬首次在甘肅發(fā)現(xiàn)，為今后在蔬菜溫室或大田作物中害蟲生物防治提供了菌種資源。