王 爍, 謝麗霞, 陳 浩, 吳光安, 周 浩, 王 瑜,于 毅, 鄭 禮, 翟一凡,*, 閆 毅,*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲學(xué)系, 山東泰安 271000; 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 濟南 250100)

設(shè)施蔬菜是我國農(nóng)業(yè)的主要支柱產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收的重要途徑，但由于設(shè)施環(huán)境相對封閉和特殊，果類蔬菜缺乏授粉媒介，僅能人工輔助授粉。目前種植戶主要采用2,4-D丁酯類激素人工噴花或蘸花，該方法耗時費工，易產(chǎn)生畸形果，還造成激素殘留，嚴重影響果菜的質(zhì)量安全，導(dǎo)致部分果菜類蔬菜產(chǎn)品的銷售、出口受限，降低了農(nóng)民的收益。隨著需要授粉的作物不斷增多，需要商業(yè)化授粉蜜蜂的數(shù)量也隨之增多。20世紀80年代，地熊蜂在歐洲商業(yè)化生產(chǎn)且被用以取代高昂的機械授粉(Trilloetal., 2019)。

地熊蜂Bombusterrestris屬于膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂總科(Apoidea)熊蜂屬Bombus。地熊蜂應(yīng)用范圍廣泛，在全世界熊蜂種類商業(yè)化應(yīng)用最為成熟，全球范圍內(nèi)均有應(yīng)用(周浩等, 2016)。熊蜂是一類多食性社會性昆蟲，是多種蟲媒植物特別是豆科、茄科及一些瀕危植物的重要授粉者(黃家興等, 2007)。相較于其他傳粉昆蟲，熊蜂有著體型大、絨毛多、飛行速度快、適應(yīng)性強、耐低溫及在陰天也能授粉等優(yōu)點(王歡等, 2019)。使用熊蜂授粉不但省工省力，減少勞動強度，而且可避免因使用激素所致的畸形果，防止激素殘留，顯著提高果菜產(chǎn)品的質(zhì)量安全和商品性能。同時熊蜂具有對高風(fēng)險化學(xué)農(nóng)藥的高敏感性，常作為設(shè)施果菜種植環(huán)境的指示生物。目前，歐盟國家已普遍使用熊蜂授粉技術(shù)。隨著我國消費者對安全優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的需求日益提高，以及政府對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管力度的加強，我國設(shè)施果菜生產(chǎn)過程中，使用熊蜂授粉技術(shù)的面積也在逐年擴大。

新煙堿類殺蟲劑屬于氯化煙酰殺蟲劑，是目前最大的殺蟲劑類型之一(Simon-Delsoetal., 2015)，是繼擬除蟲菊酯類殺蟲劑之后又一重大突破(ERSA, 2012)。其具有獨特新穎的作用方式、良好的根部內(nèi)吸性、高效、廣譜和對環(huán)境相容性好等特點，被廣泛用于防治褐飛虱和煙粉虱等刺吸式口器害蟲以及部分鞘翅目和鱗翅目害蟲(Tomizawa and Casida, 2003),一經(jīng)上市便成為市場發(fā)展最快、銷售最成功、效果最出色的一類殺蟲劑。其作用靶標為乙酰膽堿受體，因昆蟲的受體與哺乳動物受體存在差異，使得新煙堿類殺蟲劑對昆蟲毒性較高而對哺乳動物毒性較低，對人畜安全性較高(Millar and Denholm, 2007)。但由于其作用機制對蜜蜂有著較大的殺傷性，使新煙堿藥劑一度陷入禁用風(fēng)波之中。為保護授粉昆蟲，歐盟于2018年禁止在戶外使用噻蟲胺、噻蟲嗪和吡蟲啉3種新煙堿殺蟲劑(Codlingetal., 2018)。目前國內(nèi)已對蜜蜂的生態(tài)風(fēng)險性進行了系統(tǒng)的評估(趙怡楠等, 2014)，但缺少新煙堿類殺蟲劑對熊蜂的生態(tài)風(fēng)險評估。為了明確新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂的影響，本試驗參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)，采用飼喂法和接觸法測定新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂的毒性，并參照歐洲和地中海植物保護組織(EPPO, 2000)所采用的危害熵 (hazard quotient, HQ) 值來對8種新煙堿類殺蟲劑的生態(tài)風(fēng)險性進行評估，為溫室施用新煙堿類殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)，通過合理的選擇新煙堿類殺蟲劑來減輕或避免地熊蜂在傳粉時受到的傷害，同時為我國開展新煙堿類殺蟲劑對熊蜂的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蜂種為地熊蜂工蜂，購自山東魯保科技開發(fā)有限公司，于溫度25±2℃、相對濕度60%±10%、黑暗條件下進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程未接觸化學(xué)農(nóng)藥和試劑。試驗所用地熊蜂均為個體大小基本一致的健康成年工蜂。

1.2 供試藥劑

供試藥劑為25%噻蟲嗪水分散粒劑[先正達(中國)投資有限公司]、20%噻蟲胺懸浮劑(江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司)、20%啶蟲脒可溶粉劑(江蘇龍燈化學(xué)有限公司)、70%吡蟲啉水分散粒劑[拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司]、20%呋蟲胺可溶粒劑(日本三井化學(xué)ARGO株式會社)、10%烯啶蟲胺水劑(浙江世佳科技有限公司)、2%噻蟲啉微囊懸浮劑(山東國潤生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司)、20%氟吡呋喃酮水劑(拜耳作物科學(xué)有限公司)。

1.3 新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂的毒力測定

參考我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)，將農(nóng)藥對地熊蜂的毒性劃分4個等級(以有效成分計)：低毒(LD50>11.0 μg a.i./ 蜂)；中毒(2.0 μg a.i./蜂

1.3.1急性經(jīng)口毒性：參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等， 2014)，將各供試殺蟲劑母液用50%的蔗糖水溶液稀釋成5個濃度梯度，按每頭蜂取食20 μL的量在飼喂器中加入不同濃度的藥劑200 μL，將饑餓處理2 h的成年工蜂移入蜂籠，每個蜂籠10頭成蜂，每個處理重復(fù)3次，并設(shè)50%蔗糖水為空白對照。飼喂3 h待藥劑消耗完后添加充足50%蔗糖水繼續(xù)飼養(yǎng)，記錄24 h和48 h地熊蜂工蜂死亡數(shù)，計算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2急性接觸毒性：參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)，用8%吐溫-80水溶液配制的母液稀釋成5個濃度梯度。用微量點滴儀將不同濃度的供試藥劑按每頭蜂2 μL點滴在用CO2麻醉后的地熊蜂工蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后轉(zhuǎn)入蜂籠中，用充足的50%蔗糖水飼喂，每個蜂籠10頭成蜂，每個處理重復(fù)3次，并設(shè)8%吐溫-80水溶液為空白對照。記錄24 h和48 h地熊蜂工蜂死亡數(shù)，計算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.4 新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂工蜂的生態(tài)風(fēng)險評估

新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂工蜂的生態(tài)風(fēng)險評估參照歐洲和地中海植物保護組織(EPPO, 2000)所采用的HQ值。HQ值為農(nóng)藥田間推薦用量(AR) (g a.i./hm2)與農(nóng)藥對地熊蜂工蜂急性經(jīng)口或接觸LD50(μg a.i./蜂)值的比值: HQ=AR/LD50。HQ>2 500，高風(fēng)險; 50

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計軟件Probit軟件對試驗內(nèi)容所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算得出LD50和LD90值(95%置信區(qū)間)，并分析每種農(nóng)藥的毒性等級。根據(jù)試驗的數(shù)據(jù)分析噴施農(nóng)藥暴露場景下的風(fēng)險熵值，并進行生態(tài)風(fēng)險評估。

2 結(jié)果

2.1 8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的急性經(jīng)口毒性

由表1結(jié)果可知，通過飼喂法測得的地熊蜂成年工蜂24 h的LD50值由小到大順序分別為：噻蟲胺<噻蟲嗪<烯啶蟲胺<呋蟲胺<吡蟲啉<噻蟲啉<啶蟲脒<氟吡呋喃酮；48 h的LD50值由小到大順序分別為：噻蟲胺<噻蟲嗪<烯啶蟲胺<呋蟲胺<吡蟲啉<噻蟲啉<啶蟲脒<氟吡呋喃酮。

地熊蜂工蜂急性經(jīng)口毒性測定結(jié)果為噻蟲胺毒性最高，氟吡呋喃酮毒性最低。同時，8種新煙堿類藥劑24 h的LD50值均大于48 h的LD50值。根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)中農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性分級標準，8種新煙堿殺蟲劑中急性經(jīng)口毒性除啶蟲脒、噻蟲啉與氟吡呋喃酮為低毒外，其余5種均為高毒。

2.2 8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的急性接觸毒性

由表2結(jié)果可知，通過接觸法測得的地熊蜂成年工蜂24 h的LD50值由小到大順序分別為：噻蟲胺<噻蟲嗪<呋蟲胺<烯啶蟲胺<吡蟲啉<噻蟲啉<啶蟲脒<氟吡呋喃酮；48 h的LD50值由小到大順序分別為：噻蟲胺<噻蟲嗪<呋蟲胺<烯啶蟲胺<吡蟲啉<噻蟲啉<啶蟲脒<氟吡呋喃酮。與急性經(jīng)口毒性結(jié)果一致，對地熊蜂工蜂急性接觸毒性測定結(jié)果為噻蟲胺毒性最高，氟吡呋喃酮毒性最低，8種新煙堿類藥劑24 h的LD50值均大于48 h的LD50值。同時根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)中農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性分級標準，8種新煙堿藥劑中急性接觸毒性除啶蟲脒、噻蟲啉與氟吡呋喃酮為低毒外，其余5種均為高毒。

表1 8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的急性經(jīng)口毒性

毒性等級參照根據(jù)中華人民共和國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則. 第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等, 2014)中農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性分級標準The toxicity level is based on the grading standard of the acute toxicity of pesticides to bees in Environmental Safety Assessment Test Criteria for Chemical Pesticides-Part 10: Acute Toxicity Test for Bees (Yuanetal., 2014). 低毒Low toxicity: LD50>11.0 μg a.i./bee; 中毒Moderate toxicity: 2.0 μg a.i./bee

表2 8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的急性接觸毒性

2.3 8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的生態(tài)風(fēng)險評估

通過飼喂法和接觸法測得的48 h的LD50值計算得到8種新煙堿類殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的危害熵值(HQ)。8種供試制劑中，啶蟲脒、噻蟲啉和氟吡呋喃酮的經(jīng)口與接觸危害熵值均小于50，為低風(fēng)險；吡蟲啉、烯啶蟲胺、呋蟲胺的經(jīng)口與接觸危害熵值均大于50小于2 500，為中等風(fēng)險；而噻蟲嗪與噻蟲胺的接觸危害熵值均大于2 500，為高風(fēng)險，但經(jīng)口危害熵值則在50～2 500之間，為中等風(fēng)險(表3)。

表3 8種新煙堿殺蟲劑對地熊蜂成年工蜂的危害熵值

AR: 推薦的農(nóng)藥單次最高施用量Recommended application rate of a pesticide. 殺蟲劑對地熊蜂工蜂的風(fēng)險評估參照歐洲和地中海植物保護組織(EPPO, 2000)所采用的HQ值。HQ值為農(nóng)藥田間推薦用量與農(nóng)藥對地熊蜂工蜂急性經(jīng)口或接觸 LD50值的比值。The risk assessment of insecticides to the workers ofB.terressisrefers to the HQ values used by the European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO, 2000).HQ value is the ratio of the field recommended dose to the LD50value by oral or direct contact exposure．高風(fēng)險High risk: HQ>2 500; 中等風(fēng)險Moderate risk: 50

3 結(jié)論與討論

本試驗分別采用了飼喂法和接觸法對地熊蜂成年工蜂進行了室內(nèi)毒力測定，從測定結(jié)果來看，所選8種新煙堿類殺蟲劑，無論采用飼喂法還是接觸法，對地熊蜂成年工蜂的測定結(jié)果一致，除啶蟲脒、噻蟲啉與氟吡呋喃酮為低毒外，其余藥劑均為高毒(表1和2)。這表明絕大多數(shù)新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物地熊蜂存在嚴重影響。同時，測定結(jié)果顯示噻蟲胺的毒性最高，氟吡呋喃酮的毒性最低。基于以上試驗結(jié)果，我們推斷出新煙堿類殺蟲劑的作用機理類似，均具有胃毒、觸殺、內(nèi)吸和滲透作用，作用原理也均與乙酰膽堿受體類似，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，乙酰膽堿亞基組成不同等原因，最終導(dǎo)致其毒性存在一定差異(袁銳等, 2018)。有研究表明，啶蟲脒對蜜蜂的毒性為中毒(季守民等, 2015)，這可能與熊蜂體積比蜜蜂大，造成敏感性更小的原因，但同為體型較小的凹唇壁蜂Osmiaexcavata對啶蟲脒則表現(xiàn)出更高的敏感性(袁銳等, 2018)，因此，具體產(chǎn)生不同的原因還有待進一步研究。

此外，本試驗風(fēng)險評估采用的是歐洲標準危害熵值(HQ)來判斷風(fēng)險的高低，而我國風(fēng)險評估程序則是參照NY/T2882.4-2016《農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險評估指南. 第4部分: 蜜蜂》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部, 2016)來進行風(fēng)險的評估。本試驗根據(jù)我國風(fēng)險評估標準，根據(jù)農(nóng)藥使用方法確定對蜜蜂暴露的可能性，當根據(jù)使用方法不能排除蜜蜂受到農(nóng)藥的暴露時，應(yīng)根據(jù)可能的暴露途徑，在相應(yīng)的暴露場景下進行風(fēng)險評估。本試驗所選農(nóng)藥直接噴施于作物，所以針對噴施場景進行風(fēng)險評估。

初級風(fēng)險表征用噴施農(nóng)藥暴露場景的風(fēng)險熵值(risk entropy value, RQsp)來評估每種化學(xué)農(nóng)藥的影響。噴施場景下RQsp為RQsp=AR/(LD50×50)其中AR是推薦的農(nóng)藥單次最高施用量，單位是g a.i./hm2或g農(nóng)藥制劑/hm2，LD50為經(jīng)口和接觸的蜜蜂的半致死劑量，單位為μg a.i./bee或μg農(nóng)藥制劑/蜂。根據(jù)中國的實際情況，《農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險評估指南. 第4部分: 蜜蜂》規(guī)定，若RQsp≤1時，風(fēng)險可接受；當RQsp>1時，風(fēng)險不可接受，可進行高級風(fēng)險評估。由此公式可以算出在噴施場景下8種新煙堿類殺蟲劑的風(fēng)險熵值(RQsp)，其中啶蟲脒、噻蟲啉和氟吡呋喃酮風(fēng)險均為可接受，而其余5種藥劑均為不可接受。對照本試驗采用的歐洲標準，我們可以得出結(jié)論，在歐洲風(fēng)險評估標準中低風(fēng)險在我國風(fēng)險評估標準中為可接受，而中等風(fēng)險和高風(fēng)險則均為不可接受。通過表3的結(jié)果表明，噻蟲嗪與噻蟲胺對地熊蜂成年工蜂的經(jīng)口毒性為中等風(fēng)險，而接觸毒性為高風(fēng)險，分析原因，可能是由于兩種藥劑觸殺能力大于胃毒能力，因此對哺乳動物較為安全，而對于熊蜂的授粉昆蟲的危害較大。而其他6種藥劑的風(fēng)險一致，但具體的HQ值大小上也存在不同，說明飼喂法和接觸法兩種方法進行急性毒性測定時結(jié)果存在差異，為保證試驗的準確性兩種方法應(yīng)該同時進行。

雖然設(shè)施農(nóng)業(yè)上使用熊蜂授粉主要集中在花期，但由于新煙堿類殺蟲的強內(nèi)吸性，使得不同發(fā)育時期施用也會對熊蜂授粉產(chǎn)生一定影響。有研究表明，新煙堿類殺蟲劑，如噻蟲嗪、吡蟲啉等在花粉中有殘留，會對地熊蜂授粉和發(fā)育情況存在潛在影響(Kunzetal., 2015)。由于其在植物體內(nèi)傳導(dǎo)機制尚未明確，已知同為蜜蜂科的意大利蜜蜂Apismelliferaliguistica受新煙堿類殺蟲劑影響較大，不宜使用。因此，根據(jù)本試驗研究結(jié)果和參考他人研究結(jié)果后，在深入研究總結(jié)出其對熊蜂毒性和作用機制之前，盡量不使用新煙堿類殺蟲劑防治設(shè)施農(nóng)業(yè)害蟲。此外，啶蟲脒、噻蟲啉和氟吡呋喃酮的毒性測定雖為低毒，風(fēng)險評估亦為低風(fēng)險，但田間實際生產(chǎn)應(yīng)用仍需僅需進一步做大田試驗驗證后方可下定論。氟吡呋喃酮是拜耳公司在歐盟禁用部分新煙堿殺蟲劑來防止對蜜蜂危害時研究推出的新煙堿類殺蟲劑，在我國登記時間較短，因而對我國蜜蜂、熊蜂、壁蜂等授粉昆蟲的影響需要進一步試驗研究驗證。

目前，關(guān)于授粉昆蟲的研究大部分集中在意大利蜜蜂，而對于熊蜂的研究較少(黃家興和安建東, 2018)。有研究表明，大部分新煙堿類殺蟲劑對熊蜂的急性毒性較高，但后續(xù)的應(yīng)用問題還需要進一步研究解決。如Stanley等(2015)指出，長期接觸新煙堿類殺蟲劑會損害熊蜂的記憶學(xué)習(xí)能力；Harrap等(2019)研究表明，熊蜂善于學(xué)習(xí)區(qū)分有圖案的花朵，除了視覺模式外，它們還能區(qū)分那些只在氣味、表面紋理、溫度或靜電荷模式上不同的花朵，經(jīng)訓(xùn)練的熊蜂可在不同的感官模式間傳遞所學(xué)的模式而不需要重新學(xué)習(xí)。Farooqui (2013)研究發(fā)現(xiàn)，由于不合理使用新煙堿類農(nóng)藥使得蜜蜂等授粉昆蟲壽命縮短，筑巢、取食等行為發(fā)生改變，成為蜂群崩潰綜合征(colony collapse disorder, CCD)的主要誘因；CCD研究小組調(diào)查了百余種病蜂種群樣本，也認為新煙堿藥劑具有重大嫌疑(Stokstad, 2007)。此外，由于土地管理的變化導(dǎo)致花卉資源的損失通常被認為是傳粉昆蟲下降的主要原因，這是因為傳粉昆蟲如熊蜂等需要依靠豐富的花卉資源和多樣化的選擇來滿足它們的能量需求(Rotheray, 2017)。雖然新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂等授粉昆蟲的亞致死效應(yīng)研究不斷深入(Henryetal., 2012; 藺哲廣等, 2014)，但新煙堿類殺蟲劑對熊蜂的慢性毒性以及亞致死效應(yīng)仍需進一步探究。另外，本研究在藥劑選擇方面選用了商業(yè)制劑，但由于制劑在組成成份、含量、劑型、溶解性上存在一定差異，可能會對毒力測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。同時目前僅研究了室內(nèi)急性毒性試驗，而田間實際施藥對地熊蜂的影響還需進一步試驗驗證。當下國內(nèi)外的蜜蜂、熊蜂等授粉昆蟲急性毒性測試技術(shù)已經(jīng)很完善，但慢性毒性測試技術(shù)仍處于探究摸索階段。今后應(yīng)關(guān)注其長遠發(fā)展，并對新煙堿類殺蟲劑的長期慢性毒性開展風(fēng)險評估。