陳慶霄

(河南科技大學(xué)林學(xué)院, 昆蟲進化與系統(tǒng)學(xué)實驗室, 河南洛陽 471023)

除少數(shù)穴居和寄生性昆蟲外，絕大多數(shù)昆蟲具有一對復(fù)眼(compound eyes)，用于感知外界光線，幫助自身進行飛行、覓食、求偶、避敵以及導(dǎo)航等行為(Chapman, 2013)。昆蟲的復(fù)眼由許多結(jié)構(gòu)相同的小眼(ommatidia)組成，這些小眼的發(fā)育受到遺傳保守的Pax6基因調(diào)控(Gehring and Ikeo, 1999)。復(fù)眼高度的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與進化保守性已使其成為昆蟲綱(Insecta)系統(tǒng)發(fā)育以及器官演化研究的重要模型(Caveney, 1986; Melzeretal., 1997; Paulus, 2000; Oakley, 2003; Harzsch and Hafner, 2006; Chenetal., 2012)。

根據(jù)昆蟲晝夜節(jié)律不同，復(fù)眼被分為并列型眼(apposition eye)和重疊型眼(superposition eye)兩種基本類型，前者常存在于日出型昆蟲中，后者多存在于夜出型昆蟲中(Kunze, 1979)。這兩種類型的復(fù)眼的小眼都由角膜(cornea)、晶體(crystalline cone)、視網(wǎng)膜細胞(retinula cell，或稱感光細胞photoreceptor cell)和色素細胞(pigment cell)等組成(Nilsson, 1989)。然而，重疊型眼還具有一個獨特的透明區(qū)(clear zone)，這在并列型眼中并不存在(Horridge, 1975)?；涗洷砻?，節(jié)肢動物復(fù)眼的起源可追溯到早寒武紀時期(Strausfeldetal., 2016; Parketal., 2018)。在這一時期，并列型眼已存在于古老的三葉蟲中(Scholtzetal., 2019)，但這也不排除重疊型眼同時存在的可能性。昆蟲并列型眼與重疊型眼之間是否存在演化關(guān)系，迄今仍存在爭議，尚無定論(Meyer-Rochow, 2014)。

鱗翅目(Lepidoptera)是昆蟲綱最大的植食類群(Mitteretal., 2017)，其絕大多數(shù)日出型蝶類具有并列型眼，而夜出型蛾類和少數(shù)蝶類具有重疊型眼(Horridgeetal., 1972)。目前，關(guān)于鱗翅目重疊型眼的結(jié)構(gòu)特征已在夜蛾科(Noctuidae)(Meinecke, 1981; 高慰曾和郭炳群, 1983; 郭炳群, 1984, 1988)、尺蛾科(Geometridae)(Meyer-Rochow and Lau, 2008)、天蛾科(Sphingidae)(Eguchi, 1982; 高慰曾, 1986)、草螟科(Crambidae)(Belu?ietal., 2017)、螟蛾科(Pyralidae)(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971)、毒蛾科(Lymantriidae)(Lau and Meyer-Rochow, 2007)中被研究。然而，有關(guān)鱗翅目重疊型眼的研究還不充分，其他夜出型類群的復(fù)眼研究極為匱乏。燈蛾亞科(Arctiinae)是鱗翅目裳蛾科(Erebidae)中較大的一個亞科，其成蟲多為夜出型昆蟲，具趨光性(Zahirietal., 2012)。燈蛾亞科昆蟲復(fù)眼的類型及結(jié)構(gòu)特征仍未知，亟需開展研究。親土苔蛾Manuleaaffineola屬燈蛾亞科苔蛾族(Lithosiini)土苔蛾屬Eilema昆蟲，由于其夜出活動及具有較強趨光性的特點，故而被選擇為我們的研究對象。

本研究利用光學(xué)和電子顯微技術(shù)觀察親土苔蛾成蟲復(fù)眼的組織和超微結(jié)構(gòu)，闡明其復(fù)眼類型及結(jié)構(gòu)特征，旨在填補燈蛾亞科昆蟲復(fù)眼結(jié)構(gòu)研究的空白，進一步擴充夜出型昆蟲復(fù)眼的特征數(shù)據(jù)，以期為重疊型眼的變異趨勢及復(fù)眼演化研究提供有價值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與飼養(yǎng)

以燈誘法于2019年6月自河南洛陽天池山(34°15′N, 111°50′E，海拔1 000 m)采集親土苔蛾成蟲活體。

1.2 樣品制備

將單個活體成蟲用乙醚麻醉。麻醉后的雌蟲與雄蟲(各5頭)置于Ringer氏生理鹽水(NaH2PO4∶CaCl2∶KCl∶NaHCO3∶NaCl∶dH2O=0.01 g∶0.12 g∶0.14 g∶0.2 g∶6.5 g∶1 000 mL)中，在Olympus SZ61光學(xué)顯微鏡下剖出完整復(fù)眼。將復(fù)眼放入2%多聚甲醛+2.5%戊二醛混合液中，于4℃下避光保存6 h以上。固定后的復(fù)眼樣品經(jīng)磷酸緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.2)多次漂洗后，用四氧化鋨固定液(0.1 mol/L OsO4, pH 7.2)避光固定2 h，再用相同的磷酸緩沖液漂洗多次。樣品經(jīng)不同濃度梯度的乙醇溶液(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%)脫水處理，再依次用100%乙醇-LR White樹脂混合物(1∶1, v/v)滲透8 h，純LR White樹脂滲透6 h和3 h。將滲透后的樣品包埋于含純LR White樹脂的透明膠囊中，置于烘箱中60℃聚合48 h(陳慶霄和花保禎, 2016)。

1.3 光學(xué)顯微觀察

將樣品塊在Leica EM UC7切片機上，用玻璃刀切成厚度約2 μm的半薄切片。將半薄切片置于帶水滴的載玻片上，烘干后用1%甲苯胺藍染液染色，用蒸餾水沖洗掉染料，在連接CCD成像系統(tǒng)的Olympus BX-51型光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 透射電子顯微觀察

將樣品塊在Leica EM UC7切片機上，用玻璃刀切成厚度約70 nm的超薄切片。超薄切片依次用2%醋酸雙氧鈾染色8 min和4%檸檬酸鉛染色10 min，在JEOL JEM-1230透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

研究結(jié)果表明，親土苔蛾成蟲復(fù)眼在雄蛾與雌蛾之間不存在明顯的結(jié)構(gòu)差異。因此，為方便描述，我們統(tǒng)一選擇雌蛾的復(fù)眼進行描述。

2.1 親土苔蛾成蟲復(fù)眼組織結(jié)構(gòu)

親土苔蛾成蟲復(fù)眼的小眼由角膜、晶體、視網(wǎng)膜細胞、初級色素細胞(primary pigment cell)、次級色素細胞(secondary pigment cell)和基膜(basement membrane)等構(gòu)成。在復(fù)眼中，所有小眼的晶體與視桿(rhabdom)并不相接，兩者之間存在一個透明區(qū)，厚度約110 μm(圖1: A)。每個小眼的透明區(qū)由6個次級色素細胞組成(圖1: B)。

圖1 親土苔蛾雌蛾復(fù)眼組織結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡觀察

2.2 親土苔蛾成蟲復(fù)眼超微結(jié)構(gòu)

小眼最外層為外凸的角膜，厚度約16 μm，分層。角膜遠端大部分區(qū)域的片層較厚，排列疏松，向外凸起，而近端部分的片層呈水平狀緊密堆疊。角膜的外表面覆蓋微小的乳頭狀凸起，稱為角膜突(corneal nipples)，高約300 nm(圖2: A)。

角膜下方是一個長圓錐形晶體，高約50 μm(圖1: A)。晶體為真晶體(eucone)類型，由4個晶錐細胞(cone cells)及其細胞內(nèi)分泌物組成。晶錐細胞的細胞核位于晶體的最遠端部分(圖2: A)。在細胞核下方，晶錐細胞的分泌顆粒并不均勻分布，外部分布稀少，形成一圈電子較透明的區(qū)域，寬約800 nm；而內(nèi)部分布致密，呈電子不透明狀(圖2: B, C)。4個晶錐細胞的細胞質(zhì)(除分泌顆粒外)分別從核區(qū)沿顆粒分布區(qū)的外緣向下延伸，在晶體近端聚集，形成一個細長的晶體束(crystalline tract)，長約15 μm(圖2: D)。晶體束內(nèi)含有致密的纖維狀微管(microtubules)。

晶體被一對初級色素細胞圍繞。初級色素細胞的最遠端與角膜內(nèi)表面相接，包含微管(圖2: B)。2個初級色素細胞沿晶體外緣一直向下延伸至晶體束遠端，并未包裹晶體束(圖2: C, D)。初級色素細胞外側(cè)分布著一縱列球狀電子致密的色素顆粒，直徑0.4～0.6 μm(圖2: C)。初級色素細胞的細胞核位于晶體的中部水平(圖3: A)。在晶體近端，初級色素細胞包含電子致密的細小顆粒狀物質(zhì)，它們聚集在晶體周圍(圖2: D; 圖3: B)。

6個次級色素細胞圍繞著一個小眼(圖1: B)。每個次級色素細胞填充在相鄰小眼之間，從角膜內(nèi)表面一直延伸至基膜處。在晶體遠端水平，次級色素細胞位于相鄰初級色素細胞外側(cè)狹窄的空間中(圖2: A, C)。在晶體近端水平，次級色素細胞膨大，填充在晶體束與視網(wǎng)膜細胞之間，形成透明區(qū)(圖1: A)。透明區(qū)中的次級色素細胞分布著電子致密的球狀色素顆粒，直徑0.4～0.6 μm(圖2: D; 圖3: C)。次級色素細胞的細胞核位于晶體束的末端水平，在細胞核的周圍聚集著線粒體(圖3: D)。

圖2 親土苔蛾雌蛾小眼遠端縱切透射電鏡觀察

圖3 親土苔蛾雌蛾小眼遠端橫切透射電鏡觀察

小眼的視網(wǎng)膜細胞從晶體束末端穿過透明區(qū)一直向下延伸(圖4: A)。視網(wǎng)膜細胞的最遠端部分與晶體束末端相接(圖4: B)。從橫切面上看，7個視網(wǎng)膜細胞首先出現(xiàn)在晶體束末端外緣(圖4: C)。這些視網(wǎng)膜細胞在向下延伸的過程中可能出現(xiàn)了一定程度的扭轉(zhuǎn)，以至于在縱切面上呈現(xiàn)出視網(wǎng)膜細胞截斷的現(xiàn)象(圖4: A)。在晶體束下方，7個視網(wǎng)膜細胞圍繞小眼的中心軸呈輻射狀排列，它們的內(nèi)側(cè)細胞膜沒有特化成微絨毛，故不形成視桿。這些視網(wǎng)膜細胞的細胞質(zhì)中分布著粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在靠近小眼中心軸處聚集著大小、形狀不一的電子透明囊泡(圖4: D)。向近端，視網(wǎng)膜細胞的細胞核在距晶體束末端約18 μm開始出現(xiàn)(圖4: A)，在細胞核的周圍還分布著光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4: E)。

圖4 親土苔蛾雌蛾小眼視網(wǎng)膜細胞遠端透射電鏡觀察

在視網(wǎng)膜細胞的細胞核聚集區(qū)域下方，視網(wǎng)膜細胞急劇變細，形成細桿狀的視網(wǎng)膜細胞束，穿過具球狀色素顆粒的透明區(qū)(圖5: A)。在這一區(qū)域可見7個視網(wǎng)膜細胞仍沒有形成視桿(圖5: B)。再向近端，距細胞核聚集區(qū)約70 μm處，視網(wǎng)膜細胞束膨大，相鄰細胞束之間的透明區(qū)范圍縮小，且不具有色素顆粒(圖5: C)。在這一水平，每個視網(wǎng)膜細胞的細胞膜特化成密集堆疊的指狀微絨毛，形成視小桿(rhabdomere)。7個視網(wǎng)膜細胞的視小桿聚集在一起形成視桿(圖5: D)。

圖5 親土苔蛾雌蛾小眼透明區(qū)橫切透射電鏡觀察

圖6 親土苔蛾雌蛾小眼視網(wǎng)膜細胞近端橫切透射電鏡觀察

從距晶體束末端約120 μm向下，視網(wǎng)膜細胞的視小桿微絨毛排列整齊，并在小眼中心軸聚集，形成中心閉合的視桿，長度約80 μm。在復(fù)眼的大部分區(qū)域，小眼視桿呈分支狀，多為6個分支(圖6: A)。這種分支狀的視桿由7個視網(wǎng)膜細胞形成，每個視網(wǎng)膜細胞近似三角形，其視小桿呈V形，微絨毛整齊堆疊在三角形細胞的兩個長邊上(圖6: B)。然而，在復(fù)眼的背側(cè)邊緣，一小部分小眼的視桿近似矩形，無明顯分支(圖6: C)。這些矩形視桿也由7個視網(wǎng)膜細胞的視小桿組成，其中位于矩形短邊的兩個視網(wǎng)膜細胞的視小桿呈三角形，其微絨毛平行排列，兩個矩形長邊分別有3個和2個視網(wǎng)膜細胞，其視小桿微絨毛也相互平行，而分別位于矩形長邊和短邊的視小桿微絨毛相互垂直(圖6: D)。在這一區(qū)域，視網(wǎng)膜細胞的細胞質(zhì)中包含線粒體(mitochondria)以及多泡體(multivesicular bodies)。透明區(qū)終止于這一區(qū)域的遠端，形成透明區(qū)的次級色素細胞驟縮呈近小三角形，填充在相鄰視網(wǎng)膜細胞束之間。在相鄰視網(wǎng)膜細胞束之間還填充著圓形或線形微氣管(tracheoles)。

圖7 親土苔蛾雌蛾小眼基部視網(wǎng)膜細胞橫切透射電鏡觀察

當(dāng)小眼視桿繼續(xù)向近端延伸，一個新的視網(wǎng)膜細胞開始出現(xiàn)，因其僅存在于小眼的基部，故稱為基部視網(wǎng)膜細胞(basal retinula cell)。這個基部視網(wǎng)膜細胞首先出現(xiàn)在小眼視網(wǎng)膜細胞束的中央，被其余7個視網(wǎng)膜細胞完全包裹?；恳暰W(wǎng)膜細胞的視小桿沿細胞外圍分布，呈圓環(huán)狀，而其余的7個視網(wǎng)膜細胞的視小桿圍繞著這個圓環(huán)形的基部視網(wǎng)膜細胞視小桿，此時的視桿不再呈現(xiàn)中心閉合狀(圖7: A)。再向近端，基部視網(wǎng)膜細胞向外擴張，在外圍視網(wǎng)膜細胞一側(cè)開口。基部視網(wǎng)膜細胞的視小桿不再閉合，而是平行排列于細胞的兩側(cè)(圖7: B)。外圍7個視網(wǎng)膜細胞逐漸被基部視網(wǎng)膜細胞隔開，位于基部視網(wǎng)膜細胞的兩側(cè)。在這一水平上，所有視網(wǎng)膜細胞的細胞質(zhì)中都包含大量線粒體，其中基部視網(wǎng)膜細胞中還具有多泡體(圖7: C)。視網(wǎng)膜細胞束之間填充著具內(nèi)脊的微氣管(圖7: D)。

圖8 親土苔蛾雌蛾小眼基膜透射電鏡觀察

基膜位于小眼的基部，厚度約1 μm，將小眼的感光區(qū)與視葉隔開(圖8: A)。小眼的視桿終止于基膜上方約25 μm處。視桿的末端僅由基部視網(wǎng)膜細胞兩側(cè)的視小桿形成，其余7個視網(wǎng)膜細胞在外圍轉(zhuǎn)化成神經(jīng)軸突(axons)(圖8: B)。當(dāng)基部視網(wǎng)膜細胞的視小桿消失后，其細胞質(zhì)中出現(xiàn)電子致密的球狀色素顆粒，直徑約0.3～0.5 μm，而外圍7個視網(wǎng)膜細胞的軸突被微氣管分隔開(圖8: C)。基部視網(wǎng)膜細胞的細胞核位于色素顆粒分布區(qū)域的下方(圖8: D)。在基膜上方，次級色素細胞膨大，包含色素顆粒?；恳暰W(wǎng)膜細胞轉(zhuǎn)化成軸突，與其余7個視網(wǎng)膜細胞的軸突一起穿過基膜上的小孔進入視葉(圖8: E)。在基膜下方，每個小眼的8個視網(wǎng)膜細胞的軸突聚集成束(圖8: F)。

3 討論

基于組織與超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，親土苔蛾成蟲復(fù)眼的小眼由1個分層的角膜、1個真晶體、8個視網(wǎng)膜細胞、2個初級色素細胞及6個次級色素細胞等組成，且在晶體與視桿之間還存在一個明顯的透明區(qū)，這與昆蟲典型的重疊型復(fù)眼結(jié)構(gòu)基本一致(Nilsson, 1989)。

透明區(qū)是夜出昆蟲復(fù)眼特有的結(jié)構(gòu)，常由次級色素細胞的透明胞質(zhì)構(gòu)成(Horridge, 1975)。在親土苔蛾成蟲復(fù)眼中，成簇的小眼視網(wǎng)膜細胞穿過透明區(qū)，與晶體束相接。透明區(qū)中的視網(wǎng)膜細胞具細胞核及多種細胞器，但并不形成視桿。這種情況也存在于毒蛾科(Lau and Meyer-Rochow, 2007)和尺蛾科(Meyer-Rochow and Lau, 2008)中。在夜蛾科的非洲粘蟲Spodopteraexempta中，穿過透明區(qū)的視網(wǎng)膜細胞束僅在與晶體相接的最遠端部分具有少量的視桿微絨毛，其下的細胞束都不形成視桿(Meinecke, 1981)。然而，在草螟科(Belu?ietal., 2017)與螟蛾科(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971)中，穿過透明區(qū)的視網(wǎng)膜細胞束具有一個中心融合的細長視桿，與晶體末端相接。由此可見，在不同鱗翅目類群的重疊型眼中，透明區(qū)內(nèi)視網(wǎng)膜細胞的視桿形成情況存在一定的趨同和多樣化變化的特點。

在親土苔蛾復(fù)眼中，小眼具8個視網(wǎng)膜細胞，其中1個視網(wǎng)膜細胞較短，僅位于小眼基部。這種“7+1”式的視網(wǎng)膜細胞排列方式既存在于原始的昆蟲中也存在于與昆蟲綱互為姊妹群的甲殼綱中，故而被認為是祖征(Paulus, 1979, 2000)。此外，“7+1”式的視網(wǎng)膜細胞排列方式也存在于鱗翅目微蛾科(Nepticulidae)(Honkanen and Meyer-Rochow, 2009; Fischeretal., 2012)和夜蛾科(Meinecke, 1981; 郭炳群, 1984, 1988)中。毒蛾科昆蟲Orgyiaantiqua具有9個視網(wǎng)膜細胞，排列成“8+1”式(Lau and Meyer-Rochow, 2007)，這與天蛾科(Eguchi, 1982)和草螟科昆蟲Acentriaephemerella的一致(Lauetal., 2007)。然而，其他一些螟蛾總科昆蟲的小眼視網(wǎng)膜細胞數(shù)目增加到11～13個(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971; Stone and Koopowitz, 1976; Belu?ietal., 2017)。尺蛾科昆蟲Operophterabrumata的小眼視網(wǎng)膜細胞數(shù)目多達15個，呈“14+1”式分布(Meyer-Rochow and Lau, 2008)。蝶類的小眼視網(wǎng)膜細胞數(shù)目通常為9個，呈“8+1”式(Kolb, 1977; Ribi, 1978; Arikawa, 1999; Wernetetal., 2015)。由此可見，在鱗翅目中，相比于蝶類，蛾類的小眼視網(wǎng)膜細胞數(shù)目可能更加多樣化。

親土苔蛾的小眼視桿分為兩種類型：復(fù)眼背緣區(qū)域的視桿橫截面近似矩形，而其余大部分區(qū)域的視桿截面呈多分支狀。這種視桿的區(qū)域性形態(tài)差異也在草螟科歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(Belu?ietal., 2017)以及夜蛾科棉鈴蟲Heliothisarmigera(郭炳群, 1988)、粘蟲Leucaniaseparata(郭炳群, 1984)和非洲粘蟲S.exempta(Meinecke, 1981)中被報道。與分支狀視桿不同，矩形視桿內(nèi)的視小桿微絨毛相互垂直排列，被認為是昆蟲具有偏振敏感能力的主要指示特征(Labhart and Meyer, 1999)。雖然草螟科昆蟲A.ephemerella的小眼視桿在整個復(fù)眼中沒有形態(tài)差異，但復(fù)眼背緣區(qū)視桿要明顯比其他區(qū)域的視桿短得多(Lauetal., 2007)。這種縮短的背緣區(qū)視桿也有助于增加昆蟲的偏振敏感性(Nilssonetal., 1987)。相反，一些蝶類復(fù)眼的去偏振化可能是由于其較長的視桿所致(Nilssonetal., 1984, 1988)。除視桿的長度及微絨毛的排列方式外，昆蟲復(fù)眼的偏振性還與視桿的構(gòu)象(Wehneretal., 1975)以及屈光系統(tǒng)(Meyer and Labhart, 1981; Ukhanovetal., 1996)有關(guān)。由此我們推測，多種因素的結(jié)構(gòu)特征很有可能促使偏振敏感性廣泛存在于許多昆蟲中，然而相關(guān)復(fù)眼的結(jié)構(gòu)及功能研究還相當(dāng)匱乏，亟需得到更多的關(guān)注。

在本研究中，親土苔蛾是在光適應(yīng)下進行麻醉和解剖的，故而我們的研究數(shù)據(jù)顯示的是光適應(yīng)下的重疊型復(fù)眼結(jié)構(gòu)特征。在許多夜出型昆蟲的重疊型復(fù)眼中，光適應(yīng)下的復(fù)眼次級色素細胞的色素顆粒常縱向遷移進入透明區(qū)，用于吸收更多較強的光線，由此將進入視桿的光強減少了3～4個量級(Warrant and McIntyre, 1996)。這種色素的縱向遷移也在親土苔蛾的光適應(yīng)復(fù)眼中被發(fā)現(xiàn)。然而，在具有重疊型復(fù)眼的日出型弄蝶科(Hesperiidae)(Horridgeetal., 1972)和虎蛾科(Agaristidae)(Horridgeetal., 1977, 1983)中，光適應(yīng)下的次級色素細胞的色素顆粒并不發(fā)生縱向遷移進入透明區(qū)，而是維持一個具有無色素的透明區(qū)并提供僅約0.6個量級的光衰竭(Warrant and McIntyre, 1996)。由此我們推測，光適應(yīng)下色素是否縱向遷移進入透明區(qū)很可能與昆蟲的晝夜節(jié)律密切相關(guān)。夜出型昆蟲重疊型復(fù)眼在光/暗適應(yīng)下色素遷移的動力學(xué)機制仍知之甚少，需要更多的功能學(xué)研究。

致謝感謝東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院韓輝林副研究員對標(biāo)本鑒定的幫助；感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)電鏡實驗平臺何曉華實驗師和郭付振高級實驗師在技術(shù)上的支持。