林婉玲，劉芳芳，李來(lái)好，吳燕燕，楊少玲，黃 卉，楊賢慶，林 織

漂洗和斬拌對(duì)海鱸魚(yú)肌球蛋白理化特性的影響

林婉玲1,2，劉芳芳1,3，李來(lái)好1※，吳燕燕1，楊少玲1，黃 卉1，楊賢慶1，林 織4

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；2. 韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院，潮州 521041；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4. 廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司，陽(yáng)江 529800）

為探究漂洗和斬拌對(duì)海鱸魚(yú)肌球蛋白理化特性的影響，分別提取原料、漂洗魚(yú)糜、斬拌魚(yú)糜的肌球蛋白，通過(guò)測(cè)定總巰基、活性巰基、表面疏水性、濁度等基本性質(zhì)，并結(jié)合紅外光譜和原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）技術(shù)對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和表面形貌進(jìn)行研究。結(jié)果表明：相比原料，漂洗魚(yú)糜肌球蛋白總巰基含量降低19.5%，活性巰基增大63.9%，而斬拌魚(yú)糜肌球蛋白總巰基和活性巰基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比漂洗魚(yú)糜分別降低22.6%和66.8%，漂洗魚(yú)糜的肌球蛋白變性程度最大；肌球蛋白濁度和表面疏水性在經(jīng)過(guò)漂洗和斬拌均增大，漂洗對(duì)表面疏水性影響更大，斬拌對(duì)濁度影響更大；紅外光譜研究結(jié)果顯示，漂洗對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更明顯，原料經(jīng)過(guò)漂洗后，-螺旋相對(duì)含量降低了33.16%，無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量增加了79.42%，-折疊和-轉(zhuǎn)角分別增加1.11%和10.38%，斬拌后，魚(yú)糜肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化率較低；漂洗和斬拌都可改變肌球蛋白的表面形貌，使肌球蛋白聚集簇明顯減小，聚集高度增加。研究結(jié)果證明，漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白理化特性有很大的影響，是魚(yú)糜具有更好的凝膠性能的重要步驟。

蛋白；魚(yú)；檢測(cè)；肌球蛋白；變性聚集；二級(jí)結(jié)構(gòu)；表面形貌

0 引 言

加熱條件下，肌原纖維蛋白在鹽的作用下水溶性增強(qiáng)，肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，失去其非共價(jià)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，隨后分子間又相互締合，并結(jié)合大量的游離水分子，形成具有彈性的凝膠體[1]。肌球蛋白占肌原纖維蛋白總量的50%～55%[2]，是肉中含量最高的一種蛋白質(zhì)，也是肌肉中唯一可以單獨(dú)通過(guò)加熱即可形成凝膠的蛋白質(zhì)[3]，凝膠性、持水性等作為肉類(lèi)產(chǎn)品重要的特性，與肌球蛋白理化性能有著密切的聯(lián)系[4]，肌球蛋白在肌肉蛋白凝膠和肉的結(jié)合中發(fā)揮著主要的作用，并且肌球蛋白在體外不穩(wěn)定，即使在低溫下也能在溶液中自發(fā)聚集[5-6]，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)凝膠性能。因此對(duì)肌球蛋白結(jié)構(gòu)和變性聚集受加工條件的影響研究，有助于指導(dǎo)肉制品的加工。目前已有大量研究表明，肌球蛋白在加熱過(guò)程中巰基（總巰基、活性巰基）、濁度、表面疏水性以及結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化[7-8]?；钚詭€基含量的變化在一定程度上可以反應(yīng)肌球蛋白的變性程度[9]，而濁度反應(yīng)溶液中不溶懸浮顆粒的大小和數(shù)量，可以粗略地估計(jì)蛋白質(zhì)的聚集程度。但是，目前關(guān)于漂洗和斬拌等工藝對(duì)肌球蛋白這些理化特性的影響的研究較少。漂洗和斬拌是魚(yú)糜加工過(guò)程中重要工藝，對(duì)魚(yú)糜品質(zhì)的形成有重要的作用。已有研究表明，經(jīng)過(guò)兩次漂洗，白鰱魚(yú)肌球蛋白交聯(lián)反應(yīng)程度明顯增大[10]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著斬拌時(shí)間延長(zhǎng)，魚(yú)肉蛋白質(zhì)粒徑先減小后增大，證明斬拌會(huì)使蛋白質(zhì)變性聚集，形成微凝膠[11]，同時(shí)斬拌可以使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，并且魚(yú)糜凝膠性能與蛋白質(zhì)構(gòu)象緊密相關(guān)[12]。因此，為了研究魚(yú)糜加工過(guò)程中蛋白質(zhì)凝膠特性的變化，進(jìn)一步研究漂洗與斬拌對(duì)揭示肌球蛋白在魚(yú)糜加工過(guò)程中凝膠變化有重要意義。

原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）與普通的顯微鏡相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，比如原子級(jí)高分辨率，橫向分辨率達(dá)到1 nm，縱向分辨率達(dá)到0.1 nm，作為一種新型的檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集的方法，其可觀測(cè)物質(zhì)表面的形貌特征，掃描圖也可反應(yīng)蛋白質(zhì)的聚集情況，因此可利用該技術(shù)檢測(cè)肌球蛋白聚集平面狀態(tài)下的三維圖像[13]，更直觀的表示肌球蛋白在漂洗和斬拌過(guò)程中的變性聚集情況。因此，本文利用原子力顯微鏡對(duì)漂洗和斬拌過(guò)程造成的肌球蛋白聚集形態(tài)進(jìn)行研究，并結(jié)合濁度、巰基、疏水性以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化等對(duì)肌球蛋白理化性質(zhì)變化進(jìn)行分析，以期為肌球蛋白的變性聚集的研究提供參考意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鱸魚(yú)（），購(gòu)自于廣州市海珠區(qū)華潤(rùn)萬(wàn)家超市，平均質(zhì)量700 g。

食鹽、白砂糖，食品級(jí)，廣州海珠區(qū)客村華潤(rùn)萬(wàn)家超市；乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、三磷酸腺苷二鈉（ATP-Na2）、5、5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）以及其余常見(jiàn)試劑均為分析純，廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司；BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白，購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），分析純，美國(guó)Sigma公司；-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS），電泳級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

絞肉機(jī)，廣東省佛山市順德區(qū)陳村鎮(zhèn)恒基隆五金機(jī)械廠；打漿機(jī)，湖南省長(zhǎng)沙固利食品機(jī)械有限公司；IKA-T25組織勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱，常州澳華儀器公司；Sunrise-basic吸光酶標(biāo)儀，德國(guó)TECAN公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)糜制作

將鮮活海鱸魚(yú)在20 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，冰暈后宰殺清洗并取肉，并進(jìn)行漂洗（水洗1次、0.2%鹽洗1次，每次4 min，肉液比1:4），制成漂洗魚(yú)糜，然后進(jìn)行擠壓脫水，保持含水率低于80%，再進(jìn)行斬拌（空斬5 min后加入食鹽（1%）和白砂糖（1%）繼續(xù)斬拌10 min，斬拌溫度在4～10 ℃），制成斬拌魚(yú)糜，備用。

1.3.2 肌球蛋白提取

根據(jù)Park等[14]的方法，略微修改，為了防止蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)水解，所有用于制備肌球蛋白的溶液要在4 ℃下進(jìn)行保存。稱(chēng)取樣品，加入10倍體積的試劑A（0.1 mol/L KCl和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值為7.5）。用分散勻漿器11 000 r/min條件下將其進(jìn)行均質(zhì)1 min?；旌衔镌? ℃下放置15 min，利用3K30高速冷凍離心機(jī)在3 000 g下離心5 min。向所得沉淀物中加入5倍體積的試劑B（含0.45 mol/L KCl、5 mmol/L-巰基乙醇、0.2 mol/L醋酸鎂（Mg(CH3COO)2）、1 mmol/L乙二醇-雙-（2-氨基乙基）四乙酸（EGTA）和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值為6.8）；再加入ATP-Na2使其成為最終濃度為5 mmol/L的懸浮液，使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白解離，在4 ℃下放置60 min。上述懸浮液在12 000 g下離心10 min。取出上清液，加入5倍體積的1 mmol/L KHCO3進(jìn)行緩慢稀釋?zhuān)? ℃下保存15 min。再將此混合物在20 000 g下離心10 min所得沉淀物用2.5倍體積的試劑C（含0.5 mol/L KCl和5 mmol/L-巰基乙醇的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值為7.5）；進(jìn)行懸浮。所得懸浮液在4 ℃下保存10 min，再緩慢加入2.5倍體積的1 mmol/L KHCO3。同時(shí)，加入MgCl2使其最終濃度為10 mmol/L。將形成的混合物在4 ℃下保存12 h，然后在20 000 g下離心15 min，取沉淀物，即為肌球蛋白。沉淀物用1倍體積溶液D（含0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH值為7.0）溶解，即為肌球蛋白溶液。

1.3.3 肌球蛋白純度鑒定

將提取的肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)至2 mg/mL，并與2×上樣緩沖液1∶1混合，沸水浴5 min，然后12 000 r/min、4 ℃離心5 min得到上清液用于電泳。marker上樣量為5L，樣品上樣量為10L，分離膠為10%，濃縮膠為4%，以80 V恒壓是樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線，然后將電壓切換至120 V，在恒壓下直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠邊緣，電泳結(jié)束，染色液為0.1%的考馬斯亮蘭R-250-乙醇冰醋酸溶液；脫色液為水-乙醇冰醋酸溶液。最后用quantity one軟件進(jìn)行蛋白純度分析。

1.3.4 濁度

參考Cao等[15]，將肌球蛋白濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL，在340 nm測(cè)定吸光值，以吸光值來(lái)表達(dá)肌球蛋白濁度大小。

1.3.5 總巰基和自由巰基的測(cè)定

參考Wei等[16]，略作修改。

總巰基：移取0.5 mL 4 mg/mL的肌球蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl（含8 mol/L尿素，2%SDS，10 mmol/L EDTA，pH值為6.8）的緩沖液，震蕩混勻，并加入0.5 mL 0.1%DTNB（0.1 gDTNB溶于100 mL 0.2 mol/L Tris-HCl，pH值為8.0）緩沖液中，4 ℃避光反應(yīng)1 h，于412 nm處測(cè)定吸光值。

自由巰基：移取0.5 ml 4 mg/mL的肌球蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl不含尿素的緩沖液，震蕩混勻，其余操作同上。

巰基計(jì)算公式：

SH(mol/105g)=×÷(×)（1）

式中為412 nm處的吸光值，為稀釋倍數(shù)，本方法中為11，為摩爾消光系數(shù)，為13 600 L/(mol×cm)，C為蛋白濃度，4 mg/mL。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

參考Yongsawatdigul等[17]，采用ANS法測(cè)定，用0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.0的緩沖液將所提取的肌球蛋白溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑵舛葹?.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL，在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm條件下利用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，利用蛋白濃度-熒光強(qiáng)度作圖，表面疏水性S0-ANS以蛋白濃度-熒光強(qiáng)度曲線斜率表示。

1.3.7 肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（紅外光譜）

參考林婉玲等[18]，首先將肌球蛋白溶液調(diào)節(jié)至相同的蛋白濃度（10 mg/mL），然后在?80 ℃冰箱中凍結(jié)4 h以上，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥直至肌球蛋白樣品完全干燥為止，即得到肌球蛋白凍干樣品。紅外光譜的測(cè)定是將肌球蛋白凍干樣品與提前干燥的無(wú)水溴化鉀以1:100充分研磨混勻，然后壓片。測(cè)定條件為分辨率4 cm-1，室溫下重復(fù)掃描24次，掃描范圍4 000～400 cm-1。掃描結(jié)果用Peak fit 4.12軟件進(jìn)行去卷積，高斯擬合，分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.8 原子力顯微鏡（AFM）

樣品前處理：將肌球蛋白溶液稀釋至20g/mL，準(zhǔn)確吸取10L蛋白溶液滴于直徑為1 cm的圓形云母片上，室溫條件下在超凈臺(tái)上自然干燥，形成蛋白質(zhì)吸附層，然后用超純水沖洗吸附層以消除鹽分的干擾，繼續(xù)自然干燥，制成測(cè)試樣品。蛋白質(zhì)顆粒的粒徑可以用干燥狀態(tài)下從云母片基底表面到蛋白質(zhì)顆粒表面的垂直距離表示，原子力顯微鏡掃描圖可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。

AFM成像：AFM探針為商用氮化硅針尖，操作模式為分子力模式，共振頻率為150～200 kHz，彈性系數(shù)為5 N/m。本試驗(yàn)圖像掃描范圍均為3m×3m，每個(gè)樣品至少選取10個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行掃描，確保得到可重復(fù)的高質(zhì)量圖像，所有圖像均在NanoScope Analysis離線軟件上進(jìn)行，圖片先進(jìn)行Flatten平整化處理，以消除慢掃描方向上的低頻噪音造成的傾斜、扭曲、跳線等的影響，對(duì)每條掃描線進(jìn)行補(bǔ)償，使得到的圖像更加真實(shí)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 9.0和Excel 2010進(jìn)行作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，多組數(shù)據(jù)之間的差異用單因素ANOVA檢驗(yàn)兩兩比較的Duncan’s比較模型，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌球蛋白純度

提取的海鱸魚(yú)原料、漂洗魚(yú)糜、斬拌魚(yú)糜的肌球蛋白的SDS-PAGE圖如圖1所示，通過(guò)quantity one軟件進(jìn)行蛋白純度分析得知，提取的肌球蛋白純度大于80%，可作為本試驗(yàn)原料使用。

2.2 巰基和活性巰基

漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白的變性和聚集都有一定的影響，巰基作為肌球蛋白中具有最高反應(yīng)活性的基團(tuán)，與其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，并且?guī)€基含量的變化可以反應(yīng)蛋白質(zhì)的氧化變性程度[19]。其中總巰基包括活性巰基和隱藏巰基[20]，總巰基指暴露在蛋白表面和埋藏在蛋白分子內(nèi)的巰基，而活性巰基指暴露在蛋白分子表面的巰基[21]。

注：1、2、3分別代表海鱸原料、漂洗魚(yú)糜、斬拌魚(yú)糜肌球蛋白電泳條帶，MHC、MLC分別代表肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈。

如圖2所示，漂洗和斬拌后魚(yú)糜肌球蛋白總巰基含量顯著下降19.5%（<0.05），從新鮮肉的8.51 mol/105g分別減少到6.85和5.3 mol/105g，而活性巰基在漂洗過(guò)程中顯著增加，從1.39增加到3.86 mol/105g，增大了63.9%，后經(jīng)斬拌減小到1.28 mol/105g，活性巰基與總巰基在漂洗階段的比值為0.56，顯著大于原料和斬拌期間的比值。相比漂洗魚(yú)糜，斬拌魚(yú)糜肌球蛋白總巰基和活性巰基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低22.6%和66.8%，在蛋白質(zhì)中，總巰基含量下降表明活性巰基氧化生成二硫鍵，活性巰基的增加表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展[22]，活性巰基與總巰基的比值可以反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度，并且其比值與蛋白質(zhì)解折疊度呈正相關(guān)關(guān)系[23]。這主要是由于漂洗過(guò)程中活性氧攻擊蛋白質(zhì)，并且含有巰基的半胱氨酸屬于氧化敏感氨基酸，經(jīng)過(guò)氧化易形成二硫化物。

圖2 漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白巰基的影響

因此，可以推斷漂洗可以造成肌球蛋白變性伸展，使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)的巰基暴露，從而活性巰基增加，并且部分被氧化形成二硫鍵，造成總巰基含量降低。漂洗魚(yú)糜經(jīng)過(guò)斬拌后肌球蛋白活性巰基和總巰基都顯著降低（<0.05），這主要是因?yàn)殡S著斬拌的進(jìn)行，變性蛋白質(zhì)會(huì)聚集形成微凝膠，而蛋白質(zhì)聚合體的形成會(huì)掩蓋一些巰基，從而使檢測(cè)到的活性巰基顯著降低，總巰基含量的降低與二硫鍵的形成有關(guān)，而二硫鍵的形成有利于蛋白質(zhì)凝膠的穩(wěn)定。這一結(jié)果也與活性巰基與總巰基的比值研究結(jié)果一致，肌球蛋白在漂洗時(shí)解折疊度最大，變性最明顯，而經(jīng)過(guò)斬拌肌球蛋白解折疊度顯著降低。另外巰基的氧化也會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白表面疏水性的增加，變性程度增強(qiáng)，因此有必要進(jìn)一步研究漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響。

2.3 表面疏水性

蛋白質(zhì)的表面疏水性是用來(lái)反映蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露程度，一般情況下，這些疏水氨基酸殘基主要分布在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，并對(duì)肌球蛋白尾部的雙螺旋結(jié)構(gòu)起著穩(wěn)定的作用，在蛋白質(zhì)變性時(shí)，分布在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)就會(huì)暴露，并且疏水基團(tuán)暴露越多，肌球蛋白的表面疏水性越大，因此通常將表面疏水性作為研究肌球蛋白的變性程度的另外一個(gè)指標(biāo)。漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響如圖3，漂洗后，魚(yú)糜肌球蛋白表面疏水性顯著增大，從395增加到759 S0-ANS，增加了47.9%，證明漂洗可以使肌球蛋白內(nèi)部疏水氨基酸殘基暴露，肌球蛋白變性程度較大，但是有研究表明，0.5%鹽水漂洗，會(huì)使高白鮭魚(yú)肌原纖維蛋白表面疏水性顯著降低[24]，因此可以推測(cè)造成肌球蛋白表面疏水性顯著增大是由于冷水漂洗的結(jié)果。而斬拌魚(yú)糜肌球蛋白相比漂洗魚(yú)糜，表面疏水性?xún)H增加5%，差異不顯著，這主要是由于隨著斬拌的進(jìn)行，變性展開(kāi)的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生部分聚集，抑制了蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)疏水基團(tuán)的暴露[25]，與巰基研究結(jié)果一致。

圖3 漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響

2.4 濁 度

通常外界環(huán)境的變化會(huì)改變蛋白質(zhì)表面的微環(huán)境，從而造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，一般是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，-螺旋的解折疊也是肌球蛋白聚集的原因，蛋白聚集后，蛋白質(zhì)顆粒增大，使光發(fā)生散射，引起溶液濁度增加。溶液的濁度與溶液中包含的單個(gè)的粒子所造成的渾濁程度有關(guān)，粒子包括懸浮物以及不溶解的顆粒，與溶液的透過(guò)率成反比關(guān)系。由圖4知，漂洗和斬拌均使肌球蛋白濁度增大，相比原料，漂洗后魚(yú)糜肌球蛋白濁度增大了12.5%，漂洗魚(yú)糜在經(jīng)過(guò)斬拌后，肌球蛋白濁度增大了22.2%，而濁度反映的是肌球蛋白顆粒的大小，可以粗略估計(jì)肌球蛋白的聚集，根據(jù)前文巰基及表面疏水性分析知，漂洗和斬拌均會(huì)造成蛋白質(zhì)的不同程度的變性和聚集，當(dāng)肌球蛋白發(fā)生變性時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間逐漸發(fā)生了肽鏈的展開(kāi)、交聯(lián)、聚集、絮凝等變化，從而使體系濁度逐漸上升[26]，因此斬拌對(duì)肌球蛋白濁度的影響相比漂洗的更大，即斬拌更易造成肌球蛋白的聚集。

圖4 漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白濁度的影響

2.5 紅外光譜測(cè)定結(jié)果

由于在蛋白質(zhì)中，表面疏水性和活性巰基含量的改變都意味著蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化[27]，因此為進(jìn)一步研究漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白變性和聚集的影響，有必要對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。傅里葉紅外光譜在測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用，蛋白內(nèi)部不同的結(jié)構(gòu)會(huì)選擇性吸收不同的紅外波長(zhǎng)，從而產(chǎn)生不同的特征吸收峰。如圖5，是不同處理?xiàng)l件下海鱸肌球蛋白的紅外光譜圖。傅里葉變換紅外光譜圖可提供蛋白質(zhì)酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶信息以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的C-C振動(dòng)和C=O等振動(dòng)信息，酰胺I帶吸收峰是由蛋白多肽骨架的伸縮振動(dòng)而引起的，位于之間1 700～1 600 cm-1波段之間，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較敏感，通常用于分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化。對(duì)酰胺I帶去卷積，進(jìn)行高斯擬合得到各個(gè)子峰，其中各子峰與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：1 600～1 640 cm-1是-折疊；1 640～1 650 cm-1是無(wú)規(guī)卷曲；1 650～1 660 cm-1是-螺旋；1 660～1 695 cm-1是-轉(zhuǎn)角。利用相對(duì)面積變化來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化，漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化如圖6所示。

圖5 肌球蛋白紅外光譜圖

圖6 肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化

不同處理方式對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響如圖6，-螺旋和-折疊是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，又因?yàn)?螺旋和-折疊中含有較多的氫鍵，是較有序、規(guī)則的結(jié)構(gòu)，因此可以推測(cè)魚(yú)肉經(jīng)過(guò)漂洗和斬拌處理后，肌球蛋白結(jié)構(gòu)仍相對(duì)穩(wěn)定。相比原料，漂洗魚(yú)糜肌球蛋白-螺旋相對(duì)含量從40.20%降低到30.19%，降低了33.16%，無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量從8.41%增加到15.09%，增加了79.42%，-折疊和-轉(zhuǎn)角變化率相對(duì)較小，分別增加1.11%和10.38%；斬拌對(duì)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響相比于漂洗較不明顯，-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量分別下降1.16%和7.95%，-折疊和-轉(zhuǎn)角分別增加4.16%和1.92%，并且-折疊和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)是凝膠形成的基礎(chǔ)，兩者含量的增高有利于良好凝膠結(jié)構(gòu)的形成[28]，同時(shí)-螺旋含量的下降有利于蛋白質(zhì)的聚集，肌球蛋白作為唯一可以單獨(dú)加熱形成凝膠的蛋白，對(duì)蛋白質(zhì)凝膠的形成起著至關(guān)重要的作用，因此漂洗和斬拌對(duì)于蛋白質(zhì)的凝膠的形成有著重要的作用。

2.6 漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白表面形貌的影響

2.6.1 緩沖液AFM成像

圖7為緩沖液即肌球蛋白溶解液（pH值為7.0，0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液），由圖可知，緩沖液表面無(wú)明顯雜質(zhì)，證明在超凈臺(tái)自然干燥時(shí)未被塵埃污染，其對(duì)應(yīng)的3維圖進(jìn)一步說(shuō)明云母片表面較為平整，溶液顆粒細(xì)小，無(wú)直徑較大的聚集體。

圖7 緩沖液AFM圖像

2.6.2 不同處理?xiàng)l件下肌球蛋白AFM圖像

AFM圖像可以提供蛋白質(zhì)表面形態(tài)的高分辨率成像，這是研究肌球蛋白聚集特征的重要因素，通過(guò)2D圖像、3D圖像和橫截面圖像觀察海鱸魚(yú)原料以及經(jīng)過(guò)漂洗和斬拌的魚(yú)糜的肌球蛋白聚集體的表面形態(tài)（圖8）。

注：從左至右依次為：2D圖、左圖沿線中相應(yīng)的截面分析、3D圖。 Note: From left to right are 2D image, section analyses along the corresponding lines, 3D graph.

已有研究證明，肌球蛋白在生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)單體或可溶性低聚物[29]，由圖8a可知，海鱸魚(yú)原料在未經(jīng)任何處理的條件下表現(xiàn)出完整的肌球蛋白束，并且肌球蛋白在懸浮液中的均勻分布，無(wú)明顯顆粒狀存在，與雞胸肌肌原纖維蛋白外觀一致[30]。然而王艷敏等[31]研究表明，未加熱的鰱魚(yú)天然肌球蛋白以單體或小聚集體的形式吸附在云母片的表面，Guo等[32]研究表明，金線魚(yú)肌球蛋白在天然狀態(tài)下呈現(xiàn)珠狀，因此可以推測(cè)不同魚(yú)種肌球蛋白在天然狀態(tài)下結(jié)構(gòu)有所差異。蛋白在漂洗（圖8b）和斬拌（圖8c）后，肌球蛋白開(kāi)始以低聚物的形式存在，通過(guò)高度圖像的截面分析，肌球蛋白懸浮液中聚集體的高度從14 nm經(jīng)過(guò)漂洗明顯增高到高于25 nm，斬拌后，肌球蛋白聚集體高度略有下降，但不明顯，如圖8所示。另外經(jīng)過(guò)斬拌，肌球蛋白顆粒聚集簇明顯減小，且分布更加均勻。因此在漂洗和斬拌過(guò)程中，肌球蛋白是變性和聚集共同存在的過(guò)程，又因?yàn)榈鞍踪|(zhì)解聚是加熱進(jìn)一步聚集成簇狀聚合物的前提，通過(guò)原子力顯微鏡的研究，進(jìn)一步證實(shí)了漂洗和斬拌是蛋白質(zhì)加熱形成具有良好凝膠性能的重要前處理步驟。

3 結(jié) 論

漂洗和斬拌作為魚(yú)糜加工過(guò)程中的重要步驟，相比原料，漂洗魚(yú)糜肌球蛋白總巰基減少了19.5%，活性巰基、濁度和表面疏水性分別增大了63.9%、12.5%和47.9%，肌球蛋白變性程度較大；而斬拌過(guò)程中活性巰基減少了66.8%，肌球蛋白變性程度減弱，漂洗對(duì)表面疏水性影響更大，斬拌對(duì)濁度影響更大；漂洗對(duì)魚(yú)糜肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更顯著，尤其是對(duì)-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，-螺旋相對(duì)含量降低了33.16%，無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量增加了79.42%，斬拌后肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化相對(duì)不明顯；漂洗和斬拌均可以造成肌球蛋白表面形貌發(fā)生變化，漂洗后，肌球蛋白聚集簇明顯減小，而聚集高度顯著增大，斬拌后肌球蛋白聚集簇進(jìn)一步減小，聚集高度變化不明顯。因此，漂洗和斬拌對(duì)肌球蛋白的基本理化性質(zhì)以及變性和聚集有很大的影響，是魚(yú)糜加工過(guò)程中重要的前處理過(guò)程。

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Effects of rinsing and mashing on physical and chemical properties of myosin in sea bass

Lin Wanling1,2, Liu Fangfang1,3, Li Laihao1※, Wu Yanyan1, Yang Shaoling1, Huang Hui1, Yang Xianqing1, Lin Zhi4

(1.,,510300; 2.,521041,; 3.,,201306; 4..,.,529800,)

The physicochemical properties, such as total sulfhydryl (T-SH) group, active sulfhydryl (R-SH) group, surface hydrophobicity and turbidity, were determined for the myosin that extracted separately from the raw materials, rinsed- and simmer surimi in sea bass, while the secondary structure and surface morphology of the myosin were analyzed using the combined techniques including the infrared spectroscopy and atomic force microscopy (AFM). The experimental results showed that the content of total sulfhydryl (T-SH) groups in the myosin of the rinsed surimi decreased by 19.5% from 8.51 to 6.85 mol/105g, whereas the active sulfhydryl group increased by 63.9% from 1.39 to 3.86 mol/105g, compared with the raw materials. The content of total sulfhydryl (T-SH) and active sulfhydryl (R-SH) groups in the myosin of the simmer surimi decreased to 5.3 and 1.28 mol/105g compared with the raw materials, indicating decrease by 22.6% and 66.8%, respectively. The ratio of the active sulfhydryl (R-SH) to the total sulfhydryl (T-SH) group in the myosin of the rinsed surimi is the largest than others, inferring that the myosin of the rinsed surimi can be the most deformed in this case. The turbidity and surface hydrophobicity, the indictor for the aggregation and degree of denaturation in proteins, in the myosin of the surimi increased after the treatment of rinsing and simmering. Specifically, the turbidity of the myosin in the surimi increased by 12.5% after rinsing and 22.2% after simmering, compared with raw materials , whereas the surface hydrophobicity increased by 47.9% after rinsing and 5% after simmering. The data reveal that the treatment of the rinsing and simmering can significantly affect the denaturation and aggregation of proteins in the varying level. The rinsing has a greater influence on the surface hydrophobicity, while the mixing effect has a greater influence on the turbidity. The simmering can cause the slight aggregation of the myosin to form a sort of microgel. There was a much more obvious effect of the rinsing on the secondary structure of the myosin. In Fourier transform of the infrared spectroscopy the-helix relative content of the myosin that extracted can decreased by 33.16%, while the random curl relative content increased by 79.42%,-fold and-turn increased by 1.11% and 10.38%, respectively, after the rinsing of raw materials in the sea bream. After rinsing, the change rate of the secondary structure in the surimi myosin was smaller, and the-helix and random curl content decreased by 1.16% and 7.95%,-fold and-turn increased by 4.16% and 1.92%, respectively. Generally, the decrease in the-helix content can be conducive to the aggregation of proteins, and the increase in-sheet and-turn can be beneficial to the formation of the good gel structure. The characterized results from atomic force microscopy (FAM) showed that the myelin myosin exhibited a sort of protein bundle under the natural conditions, and the distribution of the protein bundle in the suspension was uniform without obvious granularity. Both treatment of the rinsing and simmering can change the surface morphology of the myosin in the sea bass, indicating reduce significantly the aggregation clusters of the myosin, while increase the height of the aggregates in the myosin suspension from 14 nm to 25 nm. After mixing, the height of the myosin aggregates did not change significantly. These findings demonstrate that the treatment of the rinsing and simmering have a great influence on the physicochemical properties of the myosin in rinsed and simmer surimi of the sea bass, as well as a certain effect on the degeneration and aggregation of the myosin suspension. This study can be expected to provide potential reference for the future development on the formation mechanism of surimi gel in food industry.

protein; fish; monitoring; myosin; degeneration and aggregation; secondary structure; surface morphology

林婉玲，劉芳芳，李來(lái)好，吳燕燕，楊少玲，黃 卉，楊賢慶，林 織. 漂洗和斬拌對(duì)海鱸魚(yú)肌球蛋白理化特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(1)：310－317.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.037 http://www.tcsae.org

Lin Wanling, Liu Fangfang, Li Laihao, Wu Yanyan, Yang Shaoling, HuangHui, Yang Xianqing, Lin Zhi. Effects of rinsing and mashing on physical and chemical properties of myosin in sea bass[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(1): 310－317. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.037 http://www.tcsae.org

2019-08-20

2019-12-25

“十二五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0400201-6）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2019TS16）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)（CARS-47）；“揚(yáng)帆計(jì)劃”引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)專(zhuān)項(xiàng)（2015YT02H109）

林婉玲，博士，副研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。Email：lwlscsf@163.com

李來(lái)好，博士，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。Email：laihaoli@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.037

TS254.4

A

1002-6819(2020)-01-0310-08