何春萌 黃 瑛

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院（上海 201102）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是微氧條件下生存的革蘭陰性螺桿菌[1]，生長(zhǎng)條件苛刻。由Giulio Bizzozero最早發(fā)現(xiàn)，Warren與Marshall首先分離培養(yǎng)成功，并證明其致病性。H.pylori在世界范圍內(nèi)感染率約50%[1]。研究表明，我國(guó)H.pylori感染率為56.22%[2]，中國(guó)自然人群兒童及青少年H.pylori總感染率達(dá)29%[3]。H.pylori感染可導(dǎo)致慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤及胃癌。1994年世界衛(wèi)生組織將H.pylori列為I 類致癌因子[4]。近年研究表明，H.pylori感染與消化系統(tǒng)中慢性肝病、上消化道出血，高氨血癥、肝性腦病等疾病以及內(nèi)分泌、造血、心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)[5]。

外排泵是一類將藥物自細(xì)菌胞漿內(nèi)泵出胞外的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過降低胞漿內(nèi)藥物濃度從而使細(xì)菌具有耐藥性。目前抗菌藥物耐藥相關(guān)外排泵可分為五大家族：主要易化子 (major facilitation superfamily，MFS) 超家族、多藥和毒性化合物外排（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）家族、ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族、耐藥結(jié)節(jié)分化（resistance nodulation-cell division，RND）家族和小多重耐藥（small multidrug resistance，SMR）家族[6]。而Hef系統(tǒng)即為H.pylori細(xì)胞膜上RND外排泵。2000年由Bina等[7]于H.pylori11 637菌株中首先發(fā)現(xiàn)，并命名為hefABC、hefDEF 和hefGHI，為H.pylori26695 ORFs 0605-0607、0971-0969、1327-1329和H.pyloriJ99 ORFs 0552-0554、0905-0903、1246-1249。其中hefGHI只在體內(nèi)具有活性，hefABC及hefDEF在體內(nèi)、外均具有活性。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，Hef 系統(tǒng)與AcrABTolC系統(tǒng)具有同源性。hefA、hefD、hefG編碼TolC樣外膜通道蛋白，hefB、hefE、hefH編碼AcrA樣膜融合蛋白，hefC、hefF、hefI 編碼AcrB 樣內(nèi)膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8-12]。

現(xiàn)有研究多集中于針對(duì)HefABC 系統(tǒng)進(jìn)行研究，其余研究較少。本文就HefABC系統(tǒng)與H.pylori耐藥性關(guān)系研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 我國(guó)H.pylori耐藥現(xiàn)狀

隨著抗生素的使用增多，H.pylori的耐藥率逐漸增高，且出現(xiàn)大量雙重、多重耐藥菌株?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)臨床使用三聯(lián)或四聯(lián)療法治療H.pylori感染，即質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）和兩種抗生素聯(lián)合或PPI、鉍劑、兩種抗生素，根除率為80%。常用抗生素為硝基咪唑類甲硝唑（metronidazole）、大環(huán)內(nèi)酯類克拉霉素（clarithromycin）、β-內(nèi)酰胺類阿莫西林（amoxicillin）和四環(huán)素類[13]。H.pylori基因突變率很高[14]，且特定的點(diǎn)突變提高了H.pylori對(duì)多種抗生素的耐藥水平[15-16]。國(guó)內(nèi)2012－2014 年浙江麗水地區(qū)甲硝唑與克拉霉素及甲硝唑與左氧氟沙星交叉耐藥率均＞15%[17]；2011－2014年青島地區(qū)雙重及多重耐藥率為29.9%，克拉霉素＋左氧氟沙星耐藥率為10.4%，左氧氟沙星＋甲硝唑耐藥率最低，為3.0%[18]；北京地區(qū)雙重耐藥率為29.6%，三重及以上耐藥率為33.4%[19]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明我國(guó)現(xiàn)階段H.pylori感染雙重及多重耐藥率高，值得重視。

2 HefABC外排泵與H.pylori耐藥關(guān)系

2.1 hefABC基因表達(dá)與H.pylori耐藥性關(guān)系

現(xiàn)有研究多集中于hef基因與單種藥物耐藥的相關(guān)性研究。在對(duì)H.pylori多重耐藥性與hef 基因相關(guān)性進(jìn)行的研究中，研究者通過氯霉素體外誘導(dǎo)臨床分離株產(chǎn)生耐藥性，測(cè)定誘導(dǎo)后菌株對(duì)甲硝唑、四環(huán)素、琥乙紅霉素、環(huán)丙沙星和青霉素G 的耐藥性,從而篩選出多重耐藥株，并與臨床分離株對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多重耐藥菌hefA mRNA 表達(dá)水平顯著高于敏感株；再構(gòu)建hefA基因敲除株，測(cè)定基因敲除前后菌株對(duì)10 種抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），結(jié)果顯示，基因敲除株總體對(duì)4 種抗生素的MIC 顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且通過PCR 擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，所有臨床分離株均存在hefA 及hefC 基因，無(wú)hefABC 系統(tǒng)缺失[20]。這項(xiàng)研究表明，hefA基因在H.pylori多重耐藥機(jī)制中起重要作用，HefABC系統(tǒng)在H.pylori中普遍存在。

還有研究者對(duì)特定H.pylori野生株構(gòu)建了hefC、hefF、hefI3個(gè)等位基因突變株，測(cè)試突變株與野生株對(duì)12種抗生素的MIC值，發(fā)現(xiàn)hefC突變株70%抗生素MIC值下降，其中克林霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟MIC值出現(xiàn)了8～16 倍的減低，而hefF與hefI基因突變前后細(xì)菌耐藥性無(wú)明顯差異[8]。更進(jìn)一步證實(shí)hefABC系統(tǒng)與H.pylori耐藥性有關(guān)。

另外，通過篩選臨床157例患者的H.pylori菌株，對(duì)其針對(duì)不同抗生素MIC 值測(cè)定，發(fā)現(xiàn)15 株多重耐藥菌株；而通過測(cè)定hefA及gyrB（一種內(nèi)源性基因）表達(dá)比值，發(fā)現(xiàn)耐藥菌株hefA表達(dá)均顯著高于單藥耐藥或抗生素敏感菌株[21]。

2.2 與甲硝唑耐藥性關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，暴露于5 種甲硝唑濃度下存活的H.pyloritolC同源基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hefA基因表達(dá)與甲硝唑濃度增加具有一致性[10]。

研究證明，rdx基因、frxA基因表達(dá)減低可導(dǎo)致H.pylori甲硝唑耐藥性增加[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，在亞抑制濃度甲硝唑中培養(yǎng)H.pylori敏感株，誘導(dǎo)其子株產(chǎn)生甲硝唑耐藥性，產(chǎn)生耐藥性菌株hefA基因表達(dá)均大幅增高，而其中6株Rdx酶活性并無(wú)下降，5株耐藥性可以被外排泵抑制劑（efflux pump inhibitor，EPI）PAβN抑制。Rdx酶活性減低菌株耐藥性則不可被PAβN抑制。由此可以認(rèn)為，甲硝唑耐藥性產(chǎn)生分為兩步：①hefA的表達(dá)增多；②Rdx酶活性降低。且hefA基因表達(dá)增多是H.pylori產(chǎn)生耐藥性的第一步[11]。

另有研究者收集53種H.pylori臨床菌株，21種具有甲硝唑耐藥性，其中17種發(fā)現(xiàn)rdxA、frxA基因突變，3種含完整rdxA、frxA基因菌株均有hefA基因表達(dá)，而在敲除hefA后，MIC值顯著下降，喪失耐藥性[24]。提示hefA基因表達(dá)可使H.pylori產(chǎn)生甲硝唑耐藥性，且與rdxA、frxA基因無(wú)關(guān)。

2.3 與克拉霉素耐藥性關(guān)系

研究者通過RT-PCR 對(duì)15 個(gè)克拉霉素耐藥株的hefABC、hefDEF、hefGIH基因表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hefABC系統(tǒng)基因在每個(gè)菌株中均有表達(dá)，推測(cè)該系統(tǒng)與克拉霉素耐藥性關(guān)聯(lián)密切[25]。

對(duì)臨床分離的12 株克拉霉素耐藥H.pylori菌株的基因測(cè)序顯示，12 株耐藥菌hefABC 均存在不同類型的基因突變，且突變點(diǎn)位較敏感菌株明顯增多。其中hefA基因存在4 種突變類型，hefB基因存在3 種突變類型，hefC基因存在2種突變類型。hefABC 基因突變可能導(dǎo)致該基因表達(dá)增多[26]。

2.4 與阿莫西林耐藥性關(guān)系

體外培養(yǎng)含hefC基因特定H.pylori菌株26695，將對(duì)阿莫西林MIC值＞0.5 mg/L的菌株為IS1～I(xiàn)S5共5例，自IS1～I(xiàn)S5菌株，MIC值逐漸增大，耐藥性提高。分析基因序列與26695 序列對(duì)比顯示，IS 1～I(xiàn)S 5 均存在hefC基因突變，且hefC基因中D131E和L378F位點(diǎn)同時(shí)突變的菌株耐藥性上升16 倍，僅有L 378 F 位點(diǎn)突變耐藥性上升8倍，僅有D131E位點(diǎn)突變耐藥性無(wú)改變。說明D131E及L378位點(diǎn)突變可導(dǎo)致hefABC基因表達(dá)增多[27]。

2.5 與其他抗菌藥物耐藥性關(guān)系

除抗生素外，還發(fā)現(xiàn)膽固醇能增加H.pylori對(duì)膽酸鹽和陽(yáng)離子甾體化合物（ceragenins，一種新型的抗菌藥物類）的耐藥性[28]。而在存在膽固醇的培養(yǎng)基中，當(dāng)同時(shí)伴有膽酸鹽或ceragenins 時(shí)，hefC表達(dá)明顯增多，提示HefABC 系統(tǒng)對(duì)新型抗菌藥物也存在抑制作用，這也符合RND系統(tǒng)底物多樣的特點(diǎn)。

2.6 與細(xì)菌生物膜形成相關(guān)性

生物膜是單個(gè)細(xì)菌繁殖形成的菌落，具有立體結(jié)構(gòu)，可具有與浮游細(xì)胞不同的表型及生化特性[29-30]。生物膜的形成可增加致病菌的耐藥性[31]。研究發(fā)現(xiàn)，hef基因可促進(jìn)生物膜形成。

在對(duì)H.pylori生物膜形成與克拉霉素敏感性及耐藥基因突變之間關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，H.pylori外排泵基因HP605、HP971、HP1327或HP1489在生物膜株中的表達(dá)明顯高于浮游株，且生物膜株多藥聯(lián)合用藥時(shí)耐藥性顯著高于浮游株[32]。

利用qPCR技術(shù)同步監(jiān)測(cè)多種臨床耐藥株H.pylori生物膜株及浮游株hefA和HP1165基因表達(dá)量，結(jié)果顯示，H.pylori生物膜株耐藥性較浮游株明顯增高，且hefA及HP1165表達(dá)也隨之增高[33]。hefA及HP1165表達(dá)與人β防衛(wèi)素（hβDs）釋放具有協(xié)同作用。hβDs可殺滅H.pylori，抑制H.pylori生長(zhǎng)，但長(zhǎng)期hβDs刺激可使得H.pylori躲避免疫系統(tǒng)攻擊，而hβDs的表達(dá)可在個(gè)體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)生物膜形成的作用[34]。

3 外排泵抑制劑研究進(jìn)展

根據(jù)現(xiàn)有研究已知HefABC家族外排泵在H.pylori多重耐藥性產(chǎn)生中具有重要地位，而針對(duì)RND 系統(tǒng)的EPIs 是解決H.pylori耐藥性的重要途徑。外排泵抑制劑主要有以下3 類：①能量阻斷劑，如羰基氰化物間氯苯腙（carbanyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP），其通過質(zhì)子動(dòng)力解耦聯(lián)，從而使外排泵失活；②競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合底物結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制細(xì)菌外排泵活性，如 Phe-Arg-β-naphthylamide（PaβN）；③非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，作用于外排泵本身，使其構(gòu)象發(fā)生變化而失活，如格羅泊霉素。

研究顯示，CCCP 降低H.pylori多重耐藥株氯霉素、琥乙紅霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松和四環(huán)素的MIC值[35]。H.pylori耐藥菌對(duì)克拉霉素的MIC 值與隨著PAβN劑量存在一致性[12]。但以上兩項(xiàng)研究均顯示，EPIs對(duì)敏感株作用不大。

由于對(duì)EPIs的藥理研究尚不全面，EPIs相關(guān)藥物尚未用于臨床。

綜上，現(xiàn)對(duì)于不同革蘭陰性菌RND 系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥性研究關(guān)系較多，近期RND 系統(tǒng)研究多集中于銅綠假單胞菌多重耐藥機(jī)制與RND 系統(tǒng)相關(guān)性探索。對(duì)于H.pylori多重耐藥性研究較少，且處于初步階段。多項(xiàng)研究均顯示，HefABC系統(tǒng)表達(dá)可導(dǎo)致H.pylori對(duì)不同藥物耐藥性的增強(qiáng)。但針對(duì)多藥耐藥仍需進(jìn)一步研究。另有研究表明，RND系統(tǒng)除外排藥物外，也可與致病毒素外排相關(guān)[36]?，F(xiàn)有研究?jī)H局限于hef基因與H.pylori耐藥性之間的聯(lián)系，而并沒有對(duì)于外排毒力蛋白，如空泡細(xì)胞毒素A（vacuolar cytotoxin A，VacA）的研究。現(xiàn)有針對(duì)HefABC家族與H.pylori耐藥性研究仍較少，對(duì)于其機(jī)制研究不夠系統(tǒng)，仍有許多不足及待發(fā)現(xiàn)之處，有待進(jìn)一步探索，以便發(fā)掘HefABC系統(tǒng)與H.pylori耐藥的關(guān)系。