馬 玉 郭 豪 常曉彤

(河北北方學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家口 075000)

巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要成員，其來源于骨髓的造血干細(xì)胞，后者首先在外周血中分化為成熟的單核細(xì)胞，再轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體的大部分組織中，發(fā)育為巨噬細(xì)胞?；诰奘杉?xì)胞的可塑性和激活方式的不同[1]，可將其分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(classical activated macrophage,即M1型)和選擇性活化型巨噬細(xì)胞(alternative activated macrophage,即M2 型)[2]，M1為促炎表型，M2為抗炎表型，當(dāng)應(yīng)對不同的微環(huán)境信號時(shí)，巨噬細(xì)胞可在M1表型和M2表型間迅速轉(zhuǎn)變[3]，以發(fā)揮其促炎或抗炎作用。巨噬細(xì)胞的極化過程依賴于許多關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，在不同疾病中，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可直接或間接作用于目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)域，促進(jìn)促炎或抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，驅(qū)使巨噬細(xì)胞功能表型極化。

巨噬細(xì)胞對非己成分的識別是固有免疫應(yīng)答的重要事件。巨噬細(xì)胞可表達(dá)多種模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，其中Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)是重要的一類。TLRs可識別病原生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)[4]和內(nèi)源性的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs)[5]。目前，在哺乳動物中，共發(fā)現(xiàn)13種TLRs，其中已確認(rèn)的人類TLRs家族成員有10個(gè)，即TLR1～TLR10[2]。巨噬細(xì)胞的TLRs通過識別非已成分，啟動其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與病原體的清除或在無菌炎癥下修復(fù)受損的細(xì)胞和基質(zhì)以維護(hù)組織完整性及其功能[6]。調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與TLRs通路存在交互作用，影響巨噬細(xì)胞的極化過程和表型。本文對此作一綜述，以期為TLRs和巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究提供理論參考。

1 巨噬細(xì)胞極化

巨噬細(xì)胞功能廣泛，在應(yīng)答各種環(huán)境或病理環(huán)境變化時(shí)，巨噬細(xì)胞可經(jīng)歷不同表型的極化，獲得不同的功能表型。M1型巨噬細(xì)胞由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystim-ulating factor,GM-CSF)、脂多糖(lipopolysacch-aride,LPS)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等誘導(dǎo)激活，可分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1、IL-6、活性氮和活性氧中間體等促炎因子和趨化因子，通過其分泌，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，發(fā)揮專業(yè)抗原提呈細(xì)胞的作用，殺滅病原微生物，破壞腫瘤惡性細(xì)胞等[7]。M2型巨噬細(xì)胞可由巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)誘導(dǎo)活化。根據(jù)刺激物的不同， M2型巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步分為不同的亞型：在IL-4、IL-13的刺激下，可誘導(dǎo)成M2a型巨噬細(xì)胞，分泌精氨酸酶1 (Arginase1,Arg 1)和IL-10；在免疫復(fù)合物和 IL-1受體的配體等刺激下可誘導(dǎo)成M2b型巨噬細(xì)胞，其特點(diǎn)是高表達(dá)IL-10，低表達(dá)IL-12、IL-1β 和 TNF-α；在IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)或糖皮質(zhì)激素的激活下可誘導(dǎo)成M2c型巨噬細(xì)胞，可分泌IL-10、甘露糖受體(CD206)、TGF-β等[8]。M2型巨噬細(xì)胞具有較低的抗原呈遞能力和抗炎作用，可下調(diào)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，與寄生蟲感染、組織重塑和腫瘤進(jìn)展有關(guān)[9]。

2 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及與TLRs信號的關(guān)系

既有研究表明，巨噬細(xì)胞極化依賴于轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)[10]，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STATs)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon-regulatoryfactor，IRFs)、核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)、激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CREB)、Krüppel樣因子4(krüppel-like factor 4,KLF4)等，這些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子的激活，控制著巨噬細(xì)胞M1-M2的極化方向，使向M1表型傾斜或向M2表型傾斜[11]。在巨噬細(xì)胞極化過程中，TLRS對極化調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。

2.1STATs STATs是一組廣泛表達(dá)于哺乳動物不同類型細(xì)胞和組織中的、能夠與目的基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，目前共發(fā)現(xiàn)8種亞型[12]。活化的STATs參與巨噬細(xì)胞極化，而STATs的活化依賴于一類可溶性的酪氨酸蛋白激酶(Janus kinases，JAKs)，形成JAK/STAT信號通路。在巨噬細(xì)胞極化過程中，巨噬細(xì)胞的活化因子可導(dǎo)致受體相關(guān)的JAKs激活，STAT在JAK作用下發(fā)生酪氨酸磷酸化并二聚化，二聚化的STAT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合目的基因的啟動子序列并激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。JAK/STAT信號通路通過對應(yīng)的細(xì)胞因子受體傳遞來自IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13等活化因子的信號，活化不同的STATs，產(chǎn)生不同的生物學(xué)應(yīng)答。IFN-γ與巨噬細(xì)胞表面IFN-γ受體(IFN-γR)結(jié)合激活STAT1，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使巨噬細(xì)胞傾向M1表型。而IL-4、IL-10和IL-13經(jīng)JAK/STAT通路，使巨噬細(xì)胞傾向M2表型，IL-4與巨噬細(xì)胞表面的IL-4受體(IL-4R)結(jié)合激活STAT3和STAT6；IL-10與巨噬細(xì)胞表面的IL-10受體(IL-10R)結(jié)合激活STAT3；IL-13與巨噬細(xì)胞表面的IL-13受體(IL-13R)結(jié)合既能活化STAT3和STAT6，也能活化STAT1，但前者處于優(yōu)勢狀態(tài)，因此，IL-4、IL-10和IL-13使巨噬細(xì)胞傾向M2型[9]。

在分子水平，STAT1和STAT3/6活化的平衡，緊密調(diào)控著巨噬細(xì)胞的極化和功能，經(jīng)IL-4誘導(dǎo)STAT6活化的巨噬細(xì)胞可抑制經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)STAT1活化的巨噬細(xì)胞的極化。TLRs信號通路與JAK/STAT通路存在交叉對話，兩者相互作用，影響M1-M2巨噬細(xì)胞極化。巨噬細(xì)胞經(jīng)IFN-γ極化后，對TLR4配體的促炎癥應(yīng)答增強(qiáng)，表明IFN-γ/JAK/STAT通路與TLR4通路在STAT1水平上存在匯集[14]。已知在大多數(shù)丙型肝炎患者中，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持續(xù)感染并難以清除，有研究發(fā)現(xiàn)造成該結(jié)果的一個(gè)重要原因是HCV核心蛋白抑制了單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的極化，其分子機(jī)制是HCV核心蛋白通過活化TLR2后，抑制了下游信號分子STAT1和STAT3的磷酸化，從而M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的極化均受到抑制，導(dǎo)致M1和M2巨噬細(xì)胞功能紊亂，吞噬活性降低[15](圖1)。

圖1 STATs對巨噬細(xì)胞極化的影響及與TLRs的相關(guān)性Fig.1 Effect of STATs on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.2IRFs IRFs是一類對IFN基因表達(dá)起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，能與Ⅰ型干擾素啟動子區(qū)域的病毒應(yīng)答元件結(jié)合，激活I(lǐng)FN-α的表達(dá)，目前在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)9種亞型。IRFs的N-端區(qū)有保守的DNA結(jié)合域，它們具有顯著的同源性，在C-端區(qū)除了IRF6外均有IRF關(guān)聯(lián)域(IRF-association domains，IADs)，可與其他亞型的IRF相互作用。巨噬細(xì)胞的極化受IRFs的影響，其中IRF1、IRF5和IRF8主要參與促炎M1型巨噬細(xì)胞的極化，IRF3和IRF4主要參與抗炎M2型巨噬細(xì)胞的極化[16]。IRF4和IRF5除上述結(jié)構(gòu)外，在IAD1和C-末端之間還有調(diào)控域和抑制區(qū)，被磷酸化激活時(shí)，可將抑制區(qū)轉(zhuǎn)化為活化區(qū)，參與巨噬細(xì)胞極化反應(yīng)[17]。TLRs信號通路影響IRFs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ極化的巨噬細(xì)胞，在應(yīng)答TLR4配體的刺激時(shí)，IRF8表達(dá)增高，促炎性細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，表明IFN-γ通路和TLR4信號通路在IRF8水平匯集，促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞表型[18]。IRF4與TLRs的一個(gè)重要接合子——髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)結(jié)合后，對TLRs信號的促炎癥活性起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用，而IRF5則可增強(qiáng)依賴TLRs誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在巨噬細(xì)胞極化中，IRF4與IRF5競爭結(jié)合MyD88，向NF-κB、AP-1和其他炎癥因子傳遞TLRs的不同激活信號，從而使促炎和抗炎達(dá)到平衡狀態(tài)[19](圖2)。

2.3NF-κB 在無活性的巨噬細(xì)胞內(nèi)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的異二聚體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)IκB被磷酸化后，NF-κB去抑制，游離的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控炎癥、免疫應(yīng)答等相關(guān)基因的表達(dá)。TLRs可識別特定的配體，除了TLR3外的TLRs均可導(dǎo)致NF-κB的激活[20]。細(xì)胞因子或PAMPs/DAMPs通過結(jié)合細(xì)胞表面TLRs，啟動NF-κB介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)[1，21]。當(dāng)巨噬細(xì)胞TLRs應(yīng)答特定配體的刺激時(shí)，在多數(shù)情況下，NF-κB活化后，上調(diào)促炎癥基因的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞傾向M1表型。但由于產(chǎn)生的NF-κB亞基組成存在兩種形式，即促炎癥反應(yīng)的p65/p50 M1型和抗炎癥反應(yīng)的p50/p50 M2型，當(dāng)NF-κB以p65/p50的形式活化時(shí)，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，形成M1表型；如果NF-κB以p50/p50的形式活化時(shí)，抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，形成M2表型。所以，TLRs在應(yīng)答LPS等的刺激時(shí)，能夠轉(zhuǎn)換巨噬細(xì)胞表型，產(chǎn)生M2型細(xì)胞因子，這是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞可塑性的機(jī)制之一，有利于對感染和微環(huán)境的變化迅速作出應(yīng)答[1，22](圖3)。

圖3 NF-κB對巨噬細(xì)胞極化的影響及與TLRs的相關(guān)性Fig.3 Effect of NF-κB on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.4AP-1 在哺乳動物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白AP-1主要是由c-Jun和c-Fos組成的同源c-Jun/c-Jun或異源c-Jun/c-Fos二聚體復(fù)合物，是多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞核內(nèi)的交匯點(diǎn)，能夠調(diào)控諸多與細(xì)胞分裂、增殖、炎癥等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞增殖、分化、凋亡的關(guān)鍵決定因素之一。

在巨噬細(xì)胞內(nèi)，TLRs或IL-1受體通過偶聯(lián)MyD88，啟動MAPKs信號級聯(lián)放大反應(yīng)，激活巨噬細(xì)胞中的AP-1，進(jìn)而AP-1通過激活細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，TLRs或IL-1受體/MyD88/MAPKs/AP-1通路是巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥過程的一條重要通路；c-Jun因子是構(gòu)成AP-1的核心成分，比c-Fos因子，對巨噬細(xì)胞的活化更為關(guān)鍵[23]。AP-1受磷酸化調(diào)控，負(fù)責(zé)c-Jun磷酸化的酶是c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)，JNK是MAPKs家族成員之一，當(dāng)細(xì)胞受到不同的刺激(如Th1或Th2細(xì)胞因子的刺激)，JNK磷酸化c-Jun的不同位點(diǎn)，發(fā)揮正向或負(fù)向調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)或抑制抗炎基因的表達(dá)。在促炎因素的誘導(dǎo)下，AP-1誘導(dǎo)促炎基因的表達(dá)，有研究表明，巨噬細(xì)胞中JNK的活化是肥胖引起胰島素抵抗和炎癥的必要條件[24]。AP-1轉(zhuǎn)錄因子也參與了LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化等炎癥過程，同時(shí)AP-1的激活可與NF-κB協(xié)同作用，促使巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，起到促炎作用[25](圖4)。

圖4 AP-1對巨噬細(xì)胞極化的影響及與TLRs的相關(guān)性Fig.4 Effect of AP-1 on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.5PPAR-γ PPAR-γ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族，PPAR-γ在巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富，是巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)因子，可通過多種機(jī)制抑制促炎基因的表達(dá)[26]。

IL-13和IL-4可誘導(dǎo)PPAR-γ的表達(dá)；PPAR-γ可協(xié)同STAT6促進(jìn)單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化；在肥胖或炎癥應(yīng)激時(shí)，PPAR-γ可導(dǎo)致脂肪組織巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化；當(dāng)PPAR-γ基因敲除時(shí)，在M1型巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子IL-1β和TNF-α作用下，炎癥和胰島素抵抗進(jìn)一步增強(qiáng)[27-29]。PPAR-γ與TLRs下游信號分子 NF-κB密切相關(guān)，越來越多的證據(jù)表明，大黃酚等藥物活性分子的抗炎作用是通過PPAR-γ依賴的NF-κB的失活實(shí)現(xiàn)的[28，29](圖5)。

2.6CREB和KLF4 CREB是一種選擇性結(jié)合cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element,CRE)的核蛋白,含堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，其被蛋白激酶A(PKA)磷酸化后而活化，它的存在能刺激基因轉(zhuǎn)錄,故又被稱為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。研究發(fā)現(xiàn)，CREB能夠通過誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的極化；前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通過活化cAMP/PKA/CREB途徑，阻斷M1巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)了M2巨噬細(xì)胞極化，所以，在急性營養(yǎng)過剩的情況下，巨噬細(xì)胞的CREB抑制了促炎因子的產(chǎn)生，有助于維持胰島素的敏感性[30](圖5)。

KLF4是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)在IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化過程中，STAT6的活化可激活KLF4，KLF4能夠驅(qū)動許多M2表型基因的表達(dá)，且能夠協(xié)同CREB，共同發(fā)揮抗炎應(yīng)答作用[30]。在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞極化的過程中，KLF4能夠使載脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因啟動子活性增高并誘導(dǎo)其表達(dá)，在CREB存在下，此作用進(jìn)一步增強(qiáng)；apoE在脂代謝過程中具有重要作用，apoE缺陷可導(dǎo)致血漿中致動脈粥樣硬化脂蛋白清除受阻，故KLF4可能是一個(gè)潛在的治療動脈粥樣硬化的新靶標(biāo)；另外，TLRs通路活化產(chǎn)生的LPS和TNF-α等促炎因子是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中KLF4表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，進(jìn)而使KLF4誘導(dǎo)抗炎因子表達(dá)，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[31](圖5)。

圖5 PPAR-γ、CREB和KLF4對巨噬細(xì)胞極化的影響及與TLRs的相關(guān)性Fig.5 Effect of PPAR-γ,CREB and KLF4 on macrophage polarization and correlation with TLRs

綜上，IFN-γ和LPS等促炎因子使巨噬細(xì)胞傾向M1表型，在轉(zhuǎn)錄因子STAT1、IRF1/IRF5/IRF8、p65/p50NF-κB和AP-1等作用下，促進(jìn)促炎相關(guān)基因的表達(dá)，這些促炎因子使巨噬細(xì)胞更加傾向M1表型，形成促炎正反饋機(jī)制；同樣，IL-4、IL-10和TGF-β等抗炎因子使巨噬細(xì)胞傾向M2表型，在轉(zhuǎn)錄因子STAT3/6、IRF3/IRF4/、p50/p50NF-κB、PPAR-γ、CREB和KLF4等作用下，誘導(dǎo)更多抗炎因子的表達(dá)，這些抗炎因子使巨噬細(xì)胞表型進(jìn)一步向M2轉(zhuǎn)移，形成抗炎正反饋機(jī)制；不同的轉(zhuǎn)錄因子間存在協(xié)同作用或反饋調(diào)控作用以調(diào)節(jié)極化方向；活化的TLRs信號通路可通過影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響巨噬細(xì)胞極化方向。

上述這些轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化參與了許多感染性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。巨噬細(xì)胞極化機(jī)制復(fù)雜，TLRs存在嗜性差異，未來的研究應(yīng)全面探索不同疾病介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜，明確和轉(zhuǎn)錄因子交集的TLRs信號通路中的信號分子，以此挖掘相關(guān)疾病的治療新靶點(diǎn)。