蘇適，黎莉，王雙俠，王斌

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

黑豆是豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、纖維素、異黃酮、多種微量元素等營養(yǎng)成分，其中的異黃酮類化合物[1]具有抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、治療更年期綜合癥等臨床應(yīng)用，可作為預(yù)防和治療疾病的保健品和藥品[2-3]。天然的異黃酮資源十分稀缺，大豆是唯一含有異黃酮且含量在營養(yǎng)學(xué)上有意義的植物資源?，F(xiàn)代生活中食品添加劑和抗菌類藥物的使用越來越多，對異黃酮的需求也在增大。因此，對天然異黃酮抑菌作用的研究也逐漸深入。

提取異黃酮常規(guī)的方法有溶劑浸提法或超聲溶劑法，提取率多在0.221%～0.488%[4-6]。離子液體是（ionic liquid）在室溫下完全由離子組成的液體物質(zhì)，能夠吸收超聲波，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、揮發(fā)性低、萃取能力好、可重復(fù)利用等性質(zhì)[7-9]。李倩等[10]采用微波輔助離子液體提取葛根總黃酮，提取率為8.05%，比傳統(tǒng)的溶劑法的提取率提高了13.5%。鐘方麗等[11]采用離子液體超聲輔助法提取香葉總黃酮，相比于傳統(tǒng)的超聲輔助乙醇法，總黃酮的提取率提高了35.9%。因此，本研究采用超聲輔助離子液體提取黑豆異黃酮，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝。目前，對異黃酮的研究主要集中在抗氧化性而對抑菌性研究很少，本試驗初步探索了黑豆異黃酮的抑菌活性，為深入研究其生物活性提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青仁黑豆：黑龍江??；染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：中國藥品生物制品檢定所；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（純度97%）：阿爾法試劑有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥試劑有限公司。供試菌種：綏化學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 試驗儀器

KQ-50B 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；101C-2B 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實驗儀器總廠；XV-9200 紫外分光光度計：北京市精密儀器廠；SPX-150B-2 生化培養(yǎng)箱：海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考文獻(xiàn)方法[6]，準(zhǔn)確稱取染料木素標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用95%的乙醇溶液配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL 的容量瓶定容，在260 nm 處測定吸光度。以金雀異黃酮的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.112 6x，R2=0.997 9。

1.3.2 黑豆異黃酮的提取

黑豆粉碎→過60 目篩→按照料液比1 ∶3（g/mL）加入正己烷，脫脂2 次→離子液體-超聲輔助提取→提取液離心→測定異黃酮含量。

1.3.3 提取率的計算

稱取4.0 g 已脫脂黑豆粉末，加入一定濃度的離子液體，在一定條件下提取黑豆異黃酮，以5 000 r/min離心40 min，取得上層清液，按1.3.1 項下方法測定其吸光度，并根據(jù)回歸方程，計算黑豆異黃酮濃度及提取率：

式中：C 為測得濃度，μg/mL；V 為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M 為原料質(zhì)量，g。

1.4 提取工藝優(yōu)化

稱取脫脂的黑豆粉末4.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆異黃酮，考察離子液體濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對黑豆異黃酮提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平試驗對提取條件進(jìn)行考察。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選取離子液體濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D），黑豆異黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design 中心組合設(shè)計原理，優(yōu)化黑豆異黃酮提取工藝，以異黃酮的提取率為響應(yīng)值，建立響應(yīng)回歸模型，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Design of response surface experiments

1.6 抑菌能力測定

采用濾紙片法[12]通過抑菌圈直徑的大小來判斷黑豆異黃酮的抑菌活性。將短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及大腸桿菌分別均勻涂布于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)（37 ℃，24 h），制成含菌平板。在平板上分別放置4 個直徑為6 mm 的滅菌濾紙片，向濾紙片上分別滴加濃度為 0.0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mg/mL 的異黃酮。用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的直徑，直徑為6 mm 表示無抑菌作用，大于6 mm 則表示有抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 離子液體濃度對提取率的影響

不同離子液體濃度對黑豆異黃酮提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 離子液體濃度對提取率的影響Fig.1 Effect of the concentration of ionic liquids on extraction yield

由圖1 可知，隨離子液體濃度增大，黑豆異黃酮的提取率逐漸增加，當(dāng)離子液體濃度為0.6 mol/L 時，異黃酮提取率達(dá)到最大值，當(dāng)濃度超過0.6 mol/L 時，提取率開始下降。原因可能是1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽的濃度變大，對異黃酮的溶解性也相應(yīng)的提高；離子液體的濃度過高，提取液黏度也會繼續(xù)增大，溶液擴(kuò)散能力變差，更難滲到黑豆細(xì)胞的內(nèi)部，使得離子液體對黑豆異黃酮的溶出能力降低[13]。因此，選擇離子液體濃度為0.6 mol/L 進(jìn)行試驗。

2.1.2 提取時間對提取率的影響

不同提取時間對黑豆異黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction yield

由圖2 可知，隨提取時間的延長，黑豆異黃酮提取率逐漸增加，提取時間為50 min 時，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長提取時間，異黃酮提取率開始下降。原因可能是提取時間短，黑豆中有效成分不能充分浸出，提取時間的延長，在超聲波空化作用和機械振動的持續(xù)作用下，黑豆異黃酮向溶劑中逐漸溶出，提取率逐漸升高。但是提取時間過長會破壞異黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，提取率下降[14]。因此，超聲時間選擇50 min 進(jìn)行試驗。

2.1.3 料液比對提取率的影響

不同料液比對黑豆異黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

由圖3 可知，隨著溶劑體積的增大，黑豆異黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為 1 ∶20（g/mL）時，提取率達(dá)到最大值，料液比超過 1 ∶20（g/mL）時，提取率開始下降。原因可能是料液比過小，提取液黏度較大，不利于異黃酮的溶出，不能保證黑豆中異黃酮轉(zhuǎn)移到提取液中，提取率較低。料液比增大，大量溶劑會吸收一定的超聲波，降低了超聲波對細(xì)胞的破碎能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異黃酮溶出減少[15]。因此，料液比選擇 1 ∶20（g/mL）進(jìn)行試驗。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響

不同提取溫度對黑豆異黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield

由圖4 可知，隨著提取溫度的升高，黑豆異黃酮的提取率逐漸增大，當(dāng)溫度為60 ℃時，異黃酮的提取率最大；但溫度繼續(xù)升高，提取率開始下降。原因可能是隨著溫度升高，離子液體的運動速率和頻率也不斷變大，使其更容易滲透到黑豆皮組織細(xì)胞中，加速異黃酮的溶出，從而增加異黃酮的提取率。但繼續(xù)升高溫度，會使異黃酮結(jié)構(gòu)上的酚羥基發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞，從而使提取率下降。因此，選擇提取溫度60 ℃進(jìn)行試驗。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案Table 2 Response surface test design scheme

2.2.2 響應(yīng)面的建立與分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以黑豆異黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，得到各因子的二次回歸擬合方程為：Y=0.65+0.070A+0.037B+6.167×10-3C+0.047D+0.044AB+0.030AC-0.022AD-0.018BC-0.061BD+0.069CD-0.089A2-0.086B2-0.13C2-0.023D2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表3 可知，根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗，P＜0.000 1，說明回歸模型方程達(dá)到極顯著水平；失擬值P=0.217 47＞0.05，沒有顯著差異，說明回歸方程與試驗擬合良好；確定系數(shù)R2=0.952 0，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.972 5，說明模型方程與試驗擬合程度好，試驗誤差小，可用此模型對黑豆異黃酮提取條件進(jìn)行分析及預(yù)測。

回歸方程各項方差分析表明，回歸模型一次項A和 B 極顯著（P＜0.01），D 顯著（P＜0.05）；交互項 BD，CD為模型極顯著因素（P＜0.01），其它交互項不顯著；二次項 A2、B2和 C2為模型極顯著因素（P＜0.01），其余各項對黑豆異黃酮得率影響均不明顯。方差分析中，各因素對黑豆異黃酮得率影響的順序為：離子液體濃度＞提取溫度＞超聲時間＞料液比。綜上所述，該模型可用于分析和預(yù)測黑豆異黃酮的提取率，并確定最佳提取工藝條件。

2.2.3 響應(yīng)面分析

采用Box-Behnken 軟件對離子液體濃度、提取時間、液料比和提取溫度之間兩兩交互作用的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response chart of the interaction of factors

由圖5 可知，料液比與提取溫度之間交互作用的響應(yīng)曲面最陡峭，對響應(yīng)值影響最顯著；提取時間與提取溫度之間交互作用的響應(yīng)曲面相對陡峭，說明對響應(yīng)值影響顯著程度次之；提取時間與離子液體濃度、離子液體濃度與料液比、離子液體濃度與提取溫度、提取時間與料液比的交互作用對提取率的影響顯著程度逐漸減小，表現(xiàn)為曲線逐漸平滑，響應(yīng)值無顯著性變化。

2.2.4 驗證試驗

結(jié)合單因素試驗，分析回歸模型，經(jīng)過驗證，最終得出該提取方法準(zhǔn)確可靠。黑豆異黃酮的最佳提取條件：離子液體濃度0.66 mol/L，提取時間49.05 min，料液比1 ∶21.71（g/mL），提取溫度 60 ℃，理論預(yù)計值 0.692%。考慮到實際操作中的局限性，最終選擇離子液體濃度0.65 mol/L，提取時間 49 min，料液比 1 ∶21（g/mL），提取溫度60 ℃，進(jìn)行5 次平行試驗，得到異黃酮提取率的平均值為0.688 %，與預(yù)測值0.692 %接近，驗證了此模型的有效性，說明預(yù)測模型與實際情況擬合較好。

2.3 抑菌活性研究

本試驗測定了不同濃度黑豆異黃酮的抑菌活性，結(jié)果如表4 所示。

由表4 可知，異黃酮濃度低于0.25 mg/mL 時，對5種菌株的生長均無抑制作用；濃度在0.5mg/mL～1.75 mg/mL 對金黃色葡萄球菌的生長有較明顯的抑制作用；濃度在0.75 mg/mL～1.75 mg/mL 對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生長有較明顯的抑制作用。在一定濃度范圍內(nèi)，異黃酮的抑菌作用隨著濃度的升高而增強。

表4 異黃酮抑菌能力測定Table 4 Bacteriostasis of Isoflavones

3 結(jié)論

本研究采用離子液體-超聲輔助提取法，對黑豆異黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，得到最佳工藝條件為：離子液體濃度 0.65 mol/L、料液比 1 ∶21（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間49 min，此條件下黑豆異黃酮的提取率可達(dá)0.688%，較文獻(xiàn)報道的提取率0.221%～0.488%有較大提高。采用濾紙片法確定黑豆異黃酮的抑菌活性，除大腸桿菌和酵母菌無抑菌活性，對其他菌株均表現(xiàn)出抑菌活性。

采用離子液體超聲輔助提取黑豆中異黃酮，可對中藥中的復(fù)雜成分選擇性提取，與傳統(tǒng)提取工藝相比，所需溶劑少，離子液體可重復(fù)利用，是一種高效提取黑豆異黃酮的方法。食品中添加的化學(xué)防腐劑在人體蓄積可致癌，濫用抗菌藥物使得菌株的抗菌能力越來越強，后續(xù)可對其抑菌機制等進(jìn)行研究，更好地為天然抗菌抑菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。