吳子溫 路運才

摘 要：簡單重復序列作為第二代分子標記技術，在農作物分子輔助育種、種質資源鑒定等方面得到了廣泛的應用。該文介紹了SSR標記引物開發(fā)及其原理，并對SSR標記在玉米種質資源遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建、雜交種種子純度鑒定以及雜種優(yōu)勢種群劃分等方面的應用進行了綜述，旨在為推進精準育種、縮短育種周期等提供參考。

關鍵詞：玉米;簡單重復序列;分子標記;標記輔助育種

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2020）（02-03）-0013-04

當前，玉米作為糧飼兼用型作物在農業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了不可取代的作用，并在飼料、工業(yè)等方面也有一定的應用[1-2]。截至2012年，我國玉米總產(chǎn)量超過了谷類產(chǎn)量，成為我國第一大糧食作物。而當前，我國玉米遺傳育種仍是以傳統(tǒng)常規(guī)育種為主，這種育種方式主要依據(jù)表型性狀的觀察，容易受到外界因素的影響。近年來，隨著B73、Mo17等骨干玉米自交系基因組序列的公布，SSR等分子標記技術在玉米遺傳育種方面得到了廣泛的應用[3]。

1 SSR引物開發(fā)

隨著引物開發(fā)軟件的不斷更新，不同物種引物設計的軟件各不相同。在玉米引物開發(fā)上常用軟件有Primer5.0、Oligo7、DNAsis等。NCBI、MaizeGDB等網(wǎng)站的BLAST選項中找到候選引物的原始序列，通過原始序列可對候選引物重新設計。引物設計的原則：候選引物長度最好在15～30、堿基的分布應符合隨機性、候選引物序列中不可出現(xiàn)互補序列?，F(xiàn)如今，MaizeGDB已經(jīng)公開的玉米SSR引物約有2000對。SSR核心序列引物的來源有以下3個：（1）利用SSR序列兩翼的保守序列，在基因文庫中搜索選擇出所需引物序列;（2）微衛(wèi)星富集法[4];（3）利用計算機軟件對核苷酸數(shù)據(jù)庫中選擇的引物進行引物設計。對所獲得的引物用PCR進行擴增，所擴增出來目的片段的長短，取決于引物重復單元的重復次數(shù)。利用瓊脂糖凝膠電泳，將所擴增出來的微衛(wèi)星片段進行觀察比較。楊珊等[5]利用20份自交材料的24個SSR引物中篩選出了4個對玉米耐鹽堿性相關的SSR引物。李余良等[6]從玉米基因數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了251對SSR引物，電泳檢測出12對關于雌穗發(fā)育差異的SSR引物多態(tài)性高。

2 SSR標記的原理與特點

SSR標記技術是以PCR為基礎發(fā)展起來的第二代分子標記技術。SSR是由1～6個單核苷酸為重復單元串聯(lián)在一起，在高等生物中均有SSR存在。然而，每個SSR序列的核心序列具有相同結構單元，在玉米基因組中常見的二核苷酸重復單元是（AC）n和（GA）n，這些重復單元以首尾相連的形式串聯(lián)在一起，一般重復單元多為10～50個。SSR核心序列重復次數(shù)與該座位上的等位基因具有強烈的正相關性。不同數(shù)目重復單元串聯(lián)在一起是生物高度多態(tài)性形成的主要原因。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）可以隨機選擇酶切位點，但是DNA探針選擇是比較困難[7]。隨機擴增長度多態(tài)性DNA（RAPD），該方法檢測所需時間與之相比有所縮減，需要的DNA樣品較少，但是該方法共顯性差并且存在著共遷移的問題。擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）雖說在穩(wěn)定性和效率上有了一定的改善，但是實驗所需費用與之相比并沒有減少，對一些堿基差異較大但分子量相同的片段識別能力較差。綜合以上幾種標記方法，簡單重復序列（SSR）有以下優(yōu)點：（1）在真核生物基因組中均有分布，特別在高等生物中分布隨機且廣泛[8-9];（2）做SSR標記時，對DNA的需求量較少;（3）遵循原始遺傳特性，具有共顯性的特點[10];（4）做PCR分析時，對DNA的要求不高，盡管DNA已經(jīng)出現(xiàn)了一定的降解，但是對測量結果也無影響;（5）設計的引物序列不同，決定了其相對應的等位基因不同的位點，這樣可以方便交流，共同開發(fā)不同的引物[11]。

3 SSR標記在玉米中的應用

3.1 遺傳多樣性分析 中國是玉米種植大國，品種類型十分豐富，包括普通玉米品種、糯玉米品種、飼用玉米品種等[12]。王鳳格等利用SSR標記對328份玉米品種的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)近年來育成品種遺傳多樣性指數(shù)在不同年份間變化不大，東華北及黃淮海地區(qū)存在品種同質化問題[13]。研究現(xiàn)有不同種質（品種）的遺傳多樣性，對深入剖析及挖掘優(yōu)異品種的基因組成和提高育種效率具有重要的理論和實踐意義[14-15]。關于我國種質資源情況，姚杰等[16-17]對我國的種質資源進行了搜集整理。分子標記的出現(xiàn)為遺傳多樣性分析提供了新的方法。近幾年來，國內外學者對于SSR標記在玉米遺傳育種上的應用開展了大量研究。例如，Zhu等[18]采用SSR標記技術對貴州的21份玉米進行了遺傳多樣性分析，結果表明，利用20對引物檢測到了97個基因變異位點，在參與實驗的21份玉米材料間平均遺傳距離為0.43。Zheng等[19]采用SSR標記技術依托于UPGMA法進行了聚類分析，可將165份糯玉米材料劃分為3大類群。張海劍[20]對玉米的彎孢葉斑病進行遺傳多樣性分析，為了解不同年份，不同地區(qū)的差異，該課題組進行2年多點取樣，并利用篩選出13條引物對175個月彎孢菌做PCR擴增，得到多態(tài)性較高的條帶105條。利用聚類分析法可將該菌分為2群5個亞群。劉洋等[21]對熱帶44份甜玉米作物的耐旱性進行篩選，對葉長、百粒重、株高等表型性狀進行了遺傳多樣性分析。結果表明，在這44份材料中只有4份材料表型性狀優(yōu)良，耐旱性較強。張鵬等[22]利用SSR熒光標記法對云南省的玉米材料進行遺傳多樣性分析，在30對SSR引物對42份材料檢測出了277個基因變異，每個位點平均檢測出9.2個等位基因。李勤等[23]為了解巴山地區(qū)玉米的遺傳多樣性，利用SSR引物對26份玉米材料進行多態(tài)性分析，結果表明，檢測到212個等位變異，每對引物可檢測到8.83個等位變異。蒙祖慶[24]對西藏地區(qū)玉米地方品種與外地品種進行遺傳多樣性分析，經(jīng)過2地玉米實驗對比表明，西藏地區(qū)玉米的基因多樣性明顯高于國內其他地區(qū)?？梢?，SSR分子標記對明確玉米種質資源遺傳的多樣性、玉米育種材料的選擇以及種質資源創(chuàng)新做出了重大貢獻。

3.2 構建玉米DNA指紋圖譜 開發(fā)適用于植物品種SSR指紋分析軟件工具Genemapperhe和Genemarker，實現(xiàn)了植物品種SSR指紋分析的自動化和標準化[25]。DNA指紋鑒定類型包括自交系的溯祖、真實性鑒定、派生關系的鑒定。在農作物品種審定登記制度實施以來，審定品種數(shù)量呈現(xiàn)了“井噴式”的增長。相關數(shù)據(jù)表明，我國玉米的進口量逐年增加，新品種相對較少，需求量低于供給量[26]?，F(xiàn)階段面臨的現(xiàn)狀是新品種的選育同質化過于嚴重，導致玉米品種遺傳基礎狹窄;所育成的新品種與原有品種性狀相似，很難區(qū)別品種之間的差異[27]。因此，玉米DNA指紋圖譜構建成為了迫切的需求，玉米DNA指紋圖譜構建對種質資源鑒定、育種者維權、純度分析起到了重大作用。構建指紋圖譜依據(jù)是每一個品種DNA組成不同，構建指紋圖譜所選用的DNA帶譜相對穩(wěn)定，不受環(huán)境條件和地理條件的影響，所形成的數(shù)據(jù)庫可納入計算機軟件進行系統(tǒng)式管理。玉米新品種所形成的DNA指紋庫，可以為人們提供豐富、有價值的遺傳信息[28]。王鳳格等[29]利用篩選出的40對SSR核心引物對3998份中國審定的品種建立了DNA指紋庫。邱洪波等[30]從34對核心引物中的6對引物建立起了喀斯特山區(qū)的指紋圖譜。邸仕忠等[31]從重慶市66個玉米自交系幾百對引物中，最終挑選出重復性較高的10對核心引物，完成了對重慶市66個玉米自交系的指紋圖譜構建。劉濤等[32]、蓋樹鵬等[33]、吳渝生等[34]分別完成了黔東南地區(qū)、山東省、云南省骨干親本的指紋圖譜的構建。

3.3 雜交種種子純度的鑒定 種子純度是指種子在種植后所表現(xiàn)出來表型特征和生理生化指標的一致性，并且種子純度的高低對種子質量的好壞起到了決定性作用[35-37]。玉米雜交種純度的鑒定方法分為外在表型和生理生化指標2種，而所鑒定的對象一般是大田生產(chǎn)所用的未登記和審定的實驗用種。外在表型鑒定包括對種子、幼苗和成年植株的農藝性狀進行鑒定。這是我國使用最廣泛的方法，具有直觀、方便、操作簡單的優(yōu)點，但是目前我國育種同質化比較嚴重，導致不同品種間的農藝性狀差異小，這對表型性狀的鑒定造成了嚴重影響[38]。生化鑒定法包括同工酶鑒定和DNA分子標記鑒定2種。同工酶電泳法具有受環(huán)境因素影響小、快速、準確的優(yōu)點。Yu等[39]利用玉米雜交種對酯酶同工酶進行了鑒定，并取得了良好的成果。近幾年來，隨著對分子生物學的了解越來越透徹，SSR標記在水稻[40]、西瓜[41]和玉米上也得到了廣泛的應用。閆米閣等[42]將玉米雜交種強盛16、強盛9、強盛62的SSR引物選擇出來，利用SSR標記技術準確有效的鑒定出了以上4個品種的純度。李群等[43]選擇9對引物在玉米雜交種登海11號和其父母本上進行試驗，選擇出了玉米雜交品種登海11號種子純度鑒定的引物位點。李曉輝等[44]利用SSR分子標記技術對挑選出220對引物，通過電泳進一步實驗選擇出了58對引物用于13個雜交種種子純度鑒定，結果表明，該方法可以將13個雜交種一一區(qū)分開。從常規(guī)鑒定和生化鑒定2個方面闡明了玉米雜交種純度鑒定的方法，得出了SSR分子標記是目前種子純度鑒定最適宜的方法[45]。

3.4 劃分玉米雜種優(yōu)勢種群 雜種優(yōu)勢群是指子一代個體匯集了父母本的所有有利基因，群間自交系雜交，時往往可以將父母本的有利基因匯集在一起[46]。研究雜種優(yōu)勢種群關系對我國玉米種質資源的改良具有重要的意義[47]。祁志云等[48]以不同類群測驗種自育自交系及美國種質共24份，采用不完全雙列雜交設計，對供試材料進行了雜種優(yōu)勢群劃分，結果表明，群間特殊配合力大于群內特殊配合力。駢躍斌等[49]為了解32份玉米自交系的雜種優(yōu)勢群的分類情況，按照UPGMA的方法對32份自交材料進行了聚類分析，將供試的32份自交系材料分為4個大類群。從雜種優(yōu)勢的實踐上來看，雙親不屬于同一類群的雜交種體現(xiàn)出了高產(chǎn)優(yōu)質的特點，而雙親屬于同一類群的雜交種未體現(xiàn)出這一特性。許崇香等[50]對黑龍江省的25個自交系進行了雜種優(yōu)勢種群的劃分，通過UPGMA方法做聚類分析，可以將25份自交系材料分為4大類群。杜青等[51]等對廣西省的33份骨干自交系進行了雜種優(yōu)勢群的劃分，用已挑選的60對引物對33份自交系玉米進行了實驗，結果表明，廣西省的自交系來源多且遺傳多樣性好，雜種優(yōu)勢種群劃分對雜種優(yōu)勢的利用起到了重大作用[52]。

4 展望

SSR標記技術是近幾年發(fā)展起來理想的標記技術，具有巨大的應用前景。隨著玉米基因組學的迅猛發(fā)展及分子育種實踐的持續(xù)深入，SSR標記技術將會得到快速發(fā)展與改進[53-55]。SSR標記技術的深入應用，方便了育種者從分子層次上揭示表型性狀與基因之間的關系。隨著育種家們對SSR標記技術的運用日益熟練，開展了對玉米新抗逆基因的探索、種質資源的高效評價和高飽和度遺傳連鎖圖譜的構建。但是，SSR標記所臨的問題是開發(fā)新的SSR引物投入高、難度相對較大并且在構建玉米高密度遺傳圖譜時需要引入其他的標記技術。但未來隨著科學家們對SSR標記技術運用程度的逐步加深，SSR標記技術面臨的難題將會被逐一攻破。

參考文獻

[1]梁曉玲，王業(yè)建，楊杰，等.玉米耐旱遺傳育種研究及分子育種策略[J].玉米科學，2018，26（03）：1-5.

[2]Ribeiro C A G， Pinto M D O， Maciel T E F， et al. Universal tail sequence-SSR applied to molecular characterization of tropical maize hybrid[J]. Sci. agric， 2017， 74（2）：163-168.

[3]Saiyad M M， Kumar S. Evaluation of maize genotypes for fodder quality traits and SSR diversity[J]. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology， 2018，27（1）：78-89.

[4]Gao G， He G， ts by magnetic bead enrichment[J].Acta Botanica Sinica， 2003（11）：1266-1269.

[5]楊姍，張春宵，金峰學，等.玉米自交系耐鹽鑒定相關SSR標記的開發(fā)[J].分子植物育種，2015，13（06）：1239-1247.

[6]李余良，胡建廣，夏磊，等.基于熱脅迫甜玉米雌穗發(fā)育差異表達基因的SSR標記開發(fā)[J].中國農學通報，2015，31（03）：244-248.

[7]Chao H， Chun S Y， Li L， et al. Comparisons of Location Between in situ Hybridization and Cohybridization of Two RFLP Markers in Maize[J]. Acta Genetica Sinica， 1999，26（1）：69-75.

[8]Smith J S C，Chin E C L，Shu H， et al. An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize （Zea mays L.）：comparisons with data from RFLPS and pedigree[J]. Theoretical & Applied Genetics， 1997，95（1-2）：163-173.

[9]Li Y， Zhang Y. Study on the genetic diversity of introduced yugoslavia maize inbred Lines and prediction of heterosis using SSR markers[J]. Journal of Yunnan Agricultural University，2004，19（6）：627-634.

[10]Menkir A， Kling J G ，Badu-Apraku B ，et al. Molecular marker-based genetic diversity assessment of Striga-resistant maize inbred lines[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，110（6）：1145-1153.

[11]孫琦，孟昭東，張發(fā)軍，等.SSR標記在玉米遺傳育種中的應用[J].玉米科學，2006（01）：37-39.

[12]劉永建.用SSR標記研究西南糯玉米種質資源的遺傳多樣性[D].雅安：四川農業(yè)大學，2002.

[13]王鳳格，田紅麗，趙久然，等.中國328個玉米品種（組合）SSR標記遺傳多樣性分析[J].中國農業(yè)科學，2014，47（05）：856-864.

[14]李芳芳，劉松濤，么大軒，等.一個糯玉米突變體的遺傳鑒定[J].河北農業(yè)大學學報，2018，41（01）：6-10.

[15]Kyujin S， Jinah K， Kijin P， et al. Analysis of genetic diversity and population structure for core set of waxy and normal maize inbred lines using SSR markers[J].Korean Journal of Breeding Science，2011：430-441.

[16]A.Forrest Troyer，姚杰.美國當代玉米種質資源的歷史演變Ⅰ·種族與品種[J].作物雜志，2007（03）：4-9.

[17]A.Forrest Troyer，姚杰.美國當代玉米種質資源的歷史演變 Ⅱ. 自交系[J].作物雜志，2007（04）：1-6.

[18]Zhu Y， Tao G， Huang Y， et al. SSR-based Analysis on the Genetic Relationship of 21 Maize Germplasms in Guizhou Province[J].Agricultural Science & Technology，2013，14（11）：1578-1582.

[19]Zheng H， Wang H， Yang H， et al. Genetic Diversity and Molecular Evolution of Chinese Waxy Maize Germplasm[J].Plos One，2013，8.

[20]常佳迎，劉樹森，馬紅霞，等.黃淮海地區(qū)夏玉米彎孢葉斑病菌遺傳多樣性分析[J].中國農業(yè)科學，2019，52（05）：822-836.

[21]高玉堯，許文天，胡小文，等.熱帶甜玉米（Zea mays L. saccharatastult）種質資源遺傳多樣性分析及抗旱性鑒定[J/OL].分子植物育種：1-15[2019-11-30].

[22]張鵬，管俊嬌，黃清梅，等.42份云南玉米自交系基于SSR熒光標記的遺傳多樣性分析[J].江西農業(yè)學報，2019，31（10）：29-33.

[23]李勤，張選明，李航兵，等.秦巴山地玉米種質資源的SSR標記遺傳多樣性分析[J].湖南農業(yè)科學，2019（06）：1-4.

[24]蒙祖慶，宋豐萍，劉婷.西藏玉米地方品種與國內骨干自交系間的遺傳關系分析[J].核農學報，2018，32（07）：1298-1308.

[25]王鳳格，李欣，楊揚，等.植物品種SSR指紋分析專用軟件SSR Analyser的研發(fā)[J].中國農業(yè)科學，2018，51（12）：2248-2262.

[26]韓昕儒.全球化背景下中國玉米的供求、貿易與預測[D].北京：中國農業(yè)大學，2016.

[27]Setimela P S， Warburton M L， Erasmus T . DNA fingerprinting of open-pollinated maize seed lots to establish genetic purity using simple sequence repeat markers[J]. South African Journal of Plant and Soil，2016：1-8.

[28]高玉倩.吉林省玉米新品種SSR標記指紋數(shù)據(jù)庫的構建及其分析[D].吉林：吉林農業(yè)大學，2011.

[29]王鳳格，楊揚，易紅梅，等.中國玉米審定品種標準SSR指紋庫的構建[J].中國農業(yè)科學，2017，50（01）：1-14.

[30]邱紅波，葉雨勝，彭忠華.喀斯特高海拔山區(qū)玉米骨干自交系SSR指紋圖譜的構建[J].玉米科學，2010，18（04）：63-65，70.

[31]邸仕忠，孫小紅，羅永統(tǒng)，等.重慶市常用及新選玉米自交系SSR指紋圖譜構建[J].安徽大學學報（自然科學版），2015，39（05）：96-102.

[32]劉濤，胡萍，趙德剛，等.黔東南地方玉米品種SSR分子標記指紋圖譜構建[J].種子，2010，29（09）：24-26，29.

[33]蓋樹鵬，王日新，黃進勇.山東省玉米骨干自交系和雜交種的SSR指紋圖譜構建[J].中國農學通報，2011，27（24）：40-44.

[34]吳渝生，楊文鵬，鄭用璉.3個玉米雜交種和親本SSR指紋圖譜的構建[J].作物學報，2003（04）：496-500.

[35]Devi E L， Hossain F， Muthusamy V， et al. Microsatellite marker-based characterization of waxy maize inbreds for their utilization in hybrid breeding[J]. 3 Biotech，2017，7（5）：316.

[36]尹祥佳，焦珍珍，趙慧軍，等.利用SSR熒光標記鑒定玉米雜交種純度的研究[J].中國種業(yè)，2018（09）：56-63.

[37]譚振馨，李汝玉，李群，等.玉米雜交種SSR標記純度鑒定方法研究[J].山東農業(yè)科學，2004（04）：8-11.

[38]羅黎明，劉麗，于麗娟，等.DNA分子標記技術在玉米種子純度鑒定中的應用[J].生物技術進展，2011，1（01）：7-13.

[39]Hyun Young Yu， Farooqahmed S. Kittur，David R，et al.? Determination of β-glucosidase aggregating factor （BGAF） binding and polymerization regions on the maize β-glucosidase isozyme Glu1[J]. Phytochemistry，2009，70（11）.

[40]Sang X， Yang Z， Zhong B，et al. Assessment of purity of rice CMS lines using cpDNA marker[J]. Euphytica，2006，152（2）：177-183.

[41]Xiang A C， Mei Y X， Zhong L Q， et al. Seed Purity Test of Hybrid Varieties of Watermelon by SSR Marker[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2006，26（10）：2006-2010.

[42]閆米格，駢躍斌，李素玲，等.應用SSR標記技術進行引物篩選及玉米雜交種純度的鑒定[J].吉林農業(yè)科學，2011，36（03）：9-12.

[43]李群，李汝玉，顏廷進，等.應用SSR標記技術鑒定登海11號玉米雜交種純度的研究[J].種子，2004（10）：21-23.

[44]李曉輝，李新海，李文華，等.SSR標記技術在玉米雜交種種子純度測定中的應用[J].作物學報，2003（01）：63-68.

[45]Hayano-Kanashiro C， Martínez de la Vega， Octavio，et al. An SSR-based approach incorporating a novel algorithm for identification of rare maize genotypes facilitates criteria for landrace conservation in Mexico[J].Ecology and Evolution，2017，7（6）：1680-1690.

[46]林峰，梁帥強，周玲，等.玉米自交系的遺傳多樣性分析及雜種優(yōu)勢群劃分[J].江蘇農業(yè)科學，2015，43（11）：107-109.

[47]姚文華，羅黎明，汪燕芬，等.利用SSR標記和產(chǎn)量對27份玉米自交系進行雜種優(yōu)勢群劃分[J].玉米科學，2009，17（01）：54-58.

[48]祁志云，楊華，李淑君，等.玉米種質雜種優(yōu)勢群劃分及主要性狀相關性與通徑分析[J].西南農業(yè)學報，2013，26（04）：1316-1321.

[49]駢躍斌，許晶，武巖軍，等. SSR分子標記技術在玉米雜種優(yōu)勢群劃分中的應用[J]. 山西農業(yè)科學，2012，40（5）：439-441.

[50]許崇香，閔麗，安英輝，等.利用SSR標記劃分黑龍江省中早熟玉米自交系雜種優(yōu)勢群的研究[J].玉米科學，2011，19（02）：45-49.

[51]杜青，鄭加興，呂巨智，等.利用SSR標記劃分廣西骨干玉米自交系的雜種優(yōu)勢群[J].玉米科學，2017，25（06）：21-27.

[52]趙欣欣，趙曉東，王奇，等.SSR、AFLP和SRAP分子標記用于玉米雜交種鑒定的多態(tài)性比較[J].吉林農業(yè)大學學報，2018，40（05）：545-550.

[53]宋偉彬，趙海銘，賴錦盛.2018年度中國玉米生物學研究進展[J].玉米科學，2019，27（02）：1-9.

[54]宋偉彬，李英男，趙海銘，等.2017年中國玉米生物學研究進展[J].玉米科學，2018，26（04）：1-9.

[55]宋偉彬，趙海銘，楊爽，等.2016年度中國玉米生物學研究進展[J].玉米科學，2017，25（03）：1-10.

（責編：張宏民）