連克乾， 張昕， 周捷宇， 廖燕芬， 司姍姍

1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州（510080）； 2.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院番禺院區(qū)種植修復(fù)科，廣東 廣州（511400）； 3.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院綜合急診科，廣東廣州（510280）

目前純鈦（titanium，Ti）被普遍應(yīng)用于臨床的牙種植體材料，但在種植失敗的病例中，其逐漸展露出因應(yīng)力遮擋效應(yīng)導(dǎo)致的植體周圍骨吸收、基臺(tái)折裂、種植體周圍炎、本體感受器缺乏、骨整合時(shí)間長(zhǎng)及遠(yuǎn)期存活率不確切等缺點(diǎn)［1?2］。聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，包括骨、關(guān)節(jié)、脊柱和顱骨頜面部的骨缺損修復(fù)和植入物更換，以及心臟瓣膜及整形外科。PEEK具有良好的機(jī)械性能，其彈性模量為3～4 GPa，接近骨松質(zhì)，彎曲強(qiáng)度大于140 MPa，拉伸強(qiáng)度大于93 MPa［3］，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但對(duì)于PEEK作為牙種植體原材料在生物相容性方面與純鈦相比較的效果尚不確切。本實(shí)驗(yàn)比較了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK和Ti表面的體外生物相容性，旨在探究PEEK是否具有優(yōu)于Ti的體外生物相容性，為PEEK應(yīng)用于牙種植體原材料方面提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

聚醚醚酮棒（深圳大藍(lán)塑業(yè)有限公司），鈦棒（日本住友集團(tuán)），熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡JSM?6330F（日本電子株式會(huì)社），Alamarblue（Sigma?Aldrich公司，美國(guó)），全自動(dòng)酶標(biāo)儀Infinite200（Tecan公司，瑞士），堿性磷酸酶AKP測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)公司，中國(guó)），茜素紅（天津市天新精細(xì)化工公司），十六烷基吡啶（Sigma?Aldrich公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源自出生3～4 d的SD乳鼠［SD乳鼠來(lái)源于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK（粵）2011?0029］，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求，于體外分離提取原代細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)至第3代或第4代細(xì)胞用于各組實(shí)驗(yàn)（圖1），細(xì)胞接種于各個(gè)試件表面的接種密度為1× 105個(gè)/mL。

1.3 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)情況

為研究SD乳鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在體外成骨誘導(dǎo)環(huán)境下分化為成骨細(xì)胞的能力，采用1%茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在加入成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)7 d、14 d后，形成礦化結(jié)節(jié)的情況如圖2所示。

Figure 1 Morphology of the bone marrow mesenchymal cells observed by inverted microscopy圖1 倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

Figure 2 Alizarin red staining mineralization nodules圖2 茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色

1.4 試件制備

將直徑為10 mm的PEEK棒和Ti棒切割成厚度為1 mm、直徑為10 mm的圓片狀PEEK片（PEEK組）和Ti片（Ti組），用200#、500#、1200#的碳化硅砂紙逐級(jí)打磨拋光。依次用丙酮、無(wú)水乙醇、超純水超聲清洗10 min，高溫高壓（103.4 kPa，121.3℃，30 min）消毒滅菌后干燥備用（圖3）。

Figure 3 PEEK and Ti images圖3 PEEK片和Ti片實(shí)物圖

1.5 掃描電鏡觀察細(xì)胞的黏附形態(tài)

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)平行試件。將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞按照相同密度（1×105個(gè)/mL），相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，分別于1、4、24 h終止培養(yǎng)，掃描電鏡觀察試件表面細(xì)胞形態(tài)。

1.6 Alamarblue方法檢測(cè)細(xì)胞的黏附和增殖能力

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)平行試件，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置空白孔和背景孔。將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞按照相同密度（1× 105個(gè)/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，分別于1 h、3 h、1 d、3 d終止培養(yǎng)，將各試件置于等量Alamarblue溶液中，孵育24 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm和600 nm波長(zhǎng)下樣本的吸光度值。各試件吸光度值計(jì)算公式：OD＝OD570nm?OD600nm。

1.7 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)平行試件。將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞按照相同密度（1× 105個(gè)/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，于接種24 h后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7、14天終止培養(yǎng)，按照堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書操作，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm波長(zhǎng)下，各組吸光度OD值。同時(shí)按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定蛋白濃度，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定560 nm波長(zhǎng)下各組吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。通過(guò)BCA蛋白定量分析公式和ALP試劑盒計(jì)算公式，得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PEEK組和Ti組的細(xì)胞ALP活力值（金氏單位/gprot）。

1.8 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量檢測(cè)

PEEK組和Ti組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置5個(gè)平行試件，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置背景孔和空白孔各1個(gè)。將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞按照相同密度（1× 105個(gè)/mL）、相同接種量（600 μL）接種于各試件表面，于接種24 h后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7、14天終止培養(yǎng)，加入1%茜素紅溶液及10%十六烷基吡啶水溶物，于562 nm波長(zhǎng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀處檢測(cè)處吸光度，去除背景值后的OD值與礦化結(jié)節(jié)的礦化程度成正比。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究數(shù)據(jù)類型為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)于兩組獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)，若滿足正態(tài)性和方差齊性采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷；若兩樣本所屬總體均符合正態(tài)性，但方差不齊，則采用校正的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡下細(xì)胞黏附形態(tài)觀察

為比較骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK片和Ti片試件表面的黏附形態(tài)，掃描電鏡下觀察骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)如圖4所示。復(fù)合培養(yǎng)1 h后，細(xì)胞在PEEK片和Ti片表面均呈圓球狀突起，未完全鋪開伸展，邊緣部分鋪展于試件表面；復(fù)合培養(yǎng)4 h后，試圖在各試件表面伸展，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)明顯的板狀偽足；復(fù)合培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞在各試件表面完全伸展鋪平，偽足明顯，呈典型成骨細(xì)胞形態(tài)，大多數(shù)為梭形、多角形。表明骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK片和Ti片試件表面均可黏附、增殖生長(zhǎng)，且形態(tài)無(wú)明顯差異。

Figure 4 SEM showing the morphology of bone marrow mesenchymal cells cultured on PEEK and Ti substrates after 1,4 and 24 hours圖4 掃描電鏡下PEEK與Ti試件表面骨髓間充質(zhì)細(xì)胞接種1 h、4 h、24 h的形態(tài)

2.2 Alamarblue方法檢測(cè)細(xì)胞的黏附和增殖能力

Alamarblue法檢測(cè)顯示（表1），PEEK組與Ti組1 h的 OD值為0.321±0.010與0.285±0.008，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.354，P＝0.001）；PEEK組與Ti組3 h的 OD值為0.323±0.008與0.296±0.012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.018，P＝0.004）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK組表面培養(yǎng)1 h、3 h時(shí)的活細(xì)胞數(shù)均高于Ti組。

比較骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面的增殖能力（表1），結(jié)果表明：PEEK組與Ti組1 d的 OD值為0.233±0.020與0.220±0.007，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.690，P＝0.015）；PEEK組與Ti組3 d的OD值為0.182±0.007與0.127±0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝9.071，P<0.001）。 uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK組表面培養(yǎng)1 d、3 d時(shí)的活細(xì)胞數(shù)均高于Ti組。

表1 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面培養(yǎng)的黏附與增殖情況Table 1 The adhesion and proliferation of the bone marrow mesenchymal cells on all substrates x±s

2.3 ALP活力測(cè)定

測(cè)定成骨誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面的ALP活性（表2），在PEEK組與Ti組培養(yǎng)7 d后，活力值為（10.849±0.949）gprot與（4.888±0.784）gprot，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.831，P<0.001）；在PEEK組與Ti組培養(yǎng)14 d后，活力值為（7.050 ± 1.001）gprot與（4.938 ± 0.712）gprot，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.385，P＝0.001）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明，培養(yǎng)7 d、14 d時(shí)PEEK組的細(xì)胞ALP活性高于Ti組。

表2 成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面培養(yǎng)7 d、14 d后的堿性磷酸酶活性Table 2 ALP activity of the osteogenesis induced bone marrow mesenchymal cells cultured on all substrates for 7 and 14 days x±s，gprot

2.4 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量測(cè)定

成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面接種培養(yǎng)7 d、14 d后，經(jīng)茜素紅染色，十六烷基吡啶礦化結(jié)節(jié)半定量分析（表3），在PEEK組與Ti組培養(yǎng)7 d后，OD值為0.552±0.181與0.296±0.055，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.026，P＝0.031）；在PEEK組與Ti組培養(yǎng)14 d后，OD值為1.034±0.233與0.583± 0.080，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.100，P＝0.010）。uPEEK?uTi的95%置信區(qū)間也表明PEEK組的OD值高，即PEEK組的礦化程度高于Ti組。

3 討論

牙種植體材料是否具有良好的細(xì)胞黏附增殖性能，是評(píng)價(jià)其生物學(xué)性能的重要指標(biāo)之一。當(dāng)牙種植體植入頜骨內(nèi)，周圍血液及組織液中的蛋白便迅速吸附至種植體表面，以此誘發(fā)之后的細(xì)胞與種植體直接或間接的黏附作用［4］。細(xì)胞黏附是細(xì)胞增殖分化等后續(xù)細(xì)胞行為的首要步驟，也是細(xì)胞與牙種植體最早發(fā)生的反應(yīng)。在1～4 h細(xì)胞黏附行為最為旺盛，24 h后定植于種植體表面的細(xì)胞，便開始增殖行為。理想的牙種植體材料應(yīng)有利于細(xì)胞的早期黏附，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖并為細(xì)胞生長(zhǎng)提供合適的微環(huán)境［5］。ALP是成骨分化的早期生化指標(biāo)［6］。ALP活性的高低可反映成骨分化的程度及功能狀態(tài)，其活性越高，說(shuō)明成骨方向分化越明顯，成熟度越高，細(xì)胞活力旺盛。因此分化早期可用ALP活性判斷細(xì)胞的成骨分化能力，后期的成骨指標(biāo)主要采用形成礦化結(jié)節(jié)的能力來(lái)判斷。

表3 成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組試件表面培養(yǎng)7 d、14 d的礦化程度Table 3 The mineralization of the osteogenesis induced bone marrow mesenchymal cells cultured on all substrates for 7 and 14 days x±s

本實(shí)驗(yàn)對(duì)PEEK與Ti進(jìn)行了體外細(xì)胞生物相容性的比較，通過(guò)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK材料表面的黏附、增殖和成骨能力評(píng)價(jià)PEEK的細(xì)胞生物相容性，探討PEEK作為牙種植體新材料的可能性。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在PEEK片和Ti片試樣表面均可黏附，并無(wú)明顯差異，說(shuō)明PEEK和Ti均有細(xì)胞黏附能力；但在Alamarblue檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中觀察到不同時(shí)間點(diǎn)，PEEK組的活細(xì)胞數(shù)均高于Ti組，說(shuō)明PEEK組的黏附及增殖情況均優(yōu)于Ti組。堿性磷酸酶試劑盒和茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)半定量分析，結(jié)果表明PEEK組的ALP活性和礦化程度均高于Ti組。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在PEEK及其復(fù)合物的生物相容性方面已有很多探索，PEEK及其復(fù)合材料被認(rèn)為是一種先進(jìn)的生物材料，用于治療創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)成形術(shù)或組織丟失損傷［7］。近年來(lái)有關(guān)PEEK性能的報(bào)道，揭示了其機(jī)械性能優(yōu)于現(xiàn)有的牙科金屬材料［8］。PEEK的彈性模量為3～4 GPa，加入碳纖維后可以將彈性模量提高到18 GPa，接近骨皮質(zhì)的彈性模量（15 GPa）。在生物相容性方面，PEEK對(duì)人體器官既沒(méi)有誘變作用，也沒(méi)有細(xì)胞毒性的證據(jù)，這說(shuō)明其具有良好的生物相容性。PEEK在納米水平進(jìn)行修飾后，可以提高其生物活性和骨傳導(dǎo)性能。納米粒子（如TiO2、HAF、HAp等）可與PEEK結(jié)合形成具有生物活性的納米復(fù)合材料［9］。另外，Nakahara等［10］在動(dòng)物體內(nèi)研究中將涂層和未涂層的碳纖維增強(qiáng)PEEK及鈦合金種植體分別進(jìn)行兔股骨拔出試驗(yàn)，結(jié)果顯示涂層的碳纖維增強(qiáng)PEEK種植體于植入的第6周界面剪切應(yīng)力消失，而涂層的鈦合金種植體于植入的第12周界面剪切應(yīng)力才消失；于之后2周再對(duì)未涂層碳纖維增強(qiáng)PEEK和鈦合金樣品進(jìn)行評(píng)估，得出了與人類成骨細(xì)胞相似的反應(yīng)，在該研究中未涂層的碳纖維增強(qiáng)PEEK植體的剪切強(qiáng)度顯著低于涂層的植體剪切強(qiáng)度。此結(jié)果表明PEEK及其復(fù)合材料能夠比Ti更早達(dá)到骨結(jié)合，這與本文的體外細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果相呼應(yīng)，即PEEK的細(xì)胞生物相容性優(yōu)于Ti。

盡管PEEK具有良好的生物相容性、射線可穿透性、彈性模量與骨組織接近，但它是一種生物惰性材料，無(wú)法形成良好骨結(jié)合。目前已有大量研究通過(guò)PEEK及其復(fù)合物表面改性的方法來(lái)提高生物活性［11］。比如使用地塞米松加負(fù)載米諾環(huán)素的脂質(zhì)體（Dex/Mino脂質(zhì)體）修飾的PEEK表面具有良好的穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，并具有增強(qiáng)抗菌、抗炎和骨整合能力［12］。還有通過(guò)快速環(huán)境溫度磺化處理PEEK表面，以提高其親水性和骨傳導(dǎo)性，用于骨植入［13］。也有利用加速中性原子束處理技術(shù)，增強(qiáng)了PEEK的體內(nèi)外生物活性，提高植入性醫(yī)療器械的生物活性等［14］。由此可見(jiàn)PEEK表面修飾可增強(qiáng)其作為牙種植體植入材料的細(xì)胞黏附、增殖、生物相容性和成骨性能；PEEK還能影響生物膜結(jié)構(gòu)，減少種植體周圍炎癥的發(fā)生［15］。將來(lái)需要對(duì)PEEK種植體進(jìn)一步研究和更多的臨床對(duì)照試驗(yàn)，使它可以取代Ti成為牙種植體材料。