李南薇，劉功良，高蘇娟，白衛(wèi)東，賈愛娟

1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院（廣州 510225）；2. 廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司（中山 528437）

長期以來，細(xì)菌被認(rèn)為以浮游狀態(tài)存在。隨著電子掃描顯微鏡出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌在一定條件下會吸附在特定表面，并增殖形成群居膜狀結(jié)構(gòu)，這種由附著于載體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落被稱為生物被膜（Biofilm）。生物被膜廣泛存在于各種潮濕表面，是細(xì)菌粘附于載體表面生存時(shí)的一種特殊狀態(tài)[1-3]。任何細(xì)菌在特定的條件下均能形成生物被膜，常見的被膜態(tài)致病菌包括單核細(xì)胞增生性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、克雷伯氏肺炎桿菌和銅綠假單胞菌等[4]。

在自然環(huán)境中，生物被膜是多數(shù)細(xì)菌的溫床，它賦予細(xì)菌對環(huán)境壓力的抗性。生物被膜幾乎存在于各種物體表面，如水槽表面、廚房角落、魚缸內(nèi)壁、空調(diào)冷凝水出水管內(nèi)壁、動物表皮、牙齒、溪流中的小石塊、船只、醫(yī)療器械、生產(chǎn)設(shè)備等，對日常生活產(chǎn)生廣泛影響[5-6]。

食品加工的主要目的是為消費(fèi)者提供美味、健康、安全的食品。食品安全是保護(hù)人類健康，提高人類生活質(zhì)量的基礎(chǔ)，無論是在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家，人類健康均遭受著食源性疾病的威脅。據(jù)估計(jì)，每年全球大約三分之一的人有犯食源性疾病的經(jīng)歷。食源性病原菌是導(dǎo)致食物變質(zhì)和引發(fā)食源性疾病的主要因素，也是食品安全要面對的長期難題。國內(nèi)外過去的研究工作主要集中在食品中游離態(tài)致病致腐微生物上[7]。然而，越來越多研究表明，細(xì)菌生物被膜、亞致死細(xì)胞的修復(fù)及病毒的變異等問題是食品安全的重要隱性危害，也是導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)的重要原因[7]。據(jù)估計(jì)，65%～80%細(xì)菌性感染是由生物被膜引起的[8]。其中，食品工業(yè)中形成的生物被膜最有可能是食源性疾病的罪魁禍?zhǔn)?。如在食品發(fā)酵中，一些腐敗菌和病原菌會形成生物被膜，從而導(dǎo)致最終產(chǎn)品的腐敗和疾病的爆發(fā)。因此，食品工業(yè)中生物被膜對食品安全的威脅不容忽視。

1 生物被膜的結(jié)構(gòu)與特性

生物被膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且其結(jié)構(gòu)、生理學(xué)特性和化學(xué)特性隨著微生物種類和環(huán)境的變化而不同。通常，生物被膜主要由細(xì)菌、營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物及裂解產(chǎn)物和水等組成，其中水分可達(dá)97%，細(xì)菌分泌的胞外聚合物組分（EPS）主要包括蛋白質(zhì)、胞外多糖、DNA和磷脂等生物大分子[1-2,9]。

大多數(shù)胞外多糖帶負(fù)電荷，可從周圍環(huán)境吸引各種有機(jī)物和無機(jī)物，故生物被膜的形態(tài)因細(xì)菌及環(huán)境的不同而異。如克雷白桿菌的胞外多糖復(fù)合物堅(jiān)硬，且均勻分布于細(xì)菌表面，而銅綠假單胞菌表面則形成一種柔韌并有一定厚度的多糖蛋白復(fù)合物。然而，不同生物被膜的結(jié)構(gòu)卻驚人地相似，都由水化的多陰離子基質(zhì)和包繞于其中的細(xì)菌所組成。生物被膜游離端由73%～98%細(xì)胞外物質(zhì)和空隙組成，所以這種結(jié)構(gòu)被形容為被膜“建筑物”[10]。

基于在生物被膜內(nèi)位置的不同，可將細(xì)菌分為游離菌、表層菌和深層菌。處于生物被膜不同位置的細(xì)菌存在著生理狀態(tài)、形態(tài)、代謝及基因表達(dá)等方面的差異。表層菌與游離菌比較相似，相對容易獲得營養(yǎng)和氧氣，代謝活動較旺盛，故菌體較大；深層菌由于處于生物被膜深處，營養(yǎng)物質(zhì)貧乏，代謝廢物濃度高，其養(yǎng)料的獲取及代謝物的排出只能通過周圍的水通道進(jìn)行，在惡劣的生存條件下，會主動或被動地降低代謝活動，甚至轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)，一般不會頻繁地分裂，菌體相對較小[11]。深層菌越接近吸附物體表面，pH和氧濃度較低，往往生長緩慢甚至不生長，通過降低自身代謝、節(jié)約能量、改變表現(xiàn)型、增強(qiáng)抗性和自身毒性，保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境壓力改變的影響，并且增強(qiáng)抵抗抗生素、消毒劑及機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺滅、吞噬作用等。更重要的是，微生物一旦形成被膜即可為細(xì)胞粘附提供新位點(diǎn)，使游離微生物個(gè)體不斷粘附于被膜上；同時(shí)，個(gè)體也不斷從被膜內(nèi)釋放或游離出來，使被膜成為慢性傳染源[5,8]。

生物被膜作為一種特殊的細(xì)菌生長和生存方式，具有特點(diǎn)[12-13]：（1）生物被膜是細(xì)菌在自然界的主要存在形式，是不同于浮游菌的一種群體生長方式；據(jù)估計(jì)，在自然界超過90%的細(xì)菌是以生物被膜形式存在的。（2）生物被膜中的細(xì)菌群體是被細(xì)菌分泌的聚合物組分包裹的，生物被膜中生物體數(shù)量高于其它所有方式存在的生物體數(shù)量總和。（3）生物被膜內(nèi)的細(xì)菌群體具有一定功能和組織。（4）生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境的一種生命現(xiàn)象，在不利于其生長或存在條件下，細(xì)菌間相互粘連，并分泌聚合物基質(zhì)形成膜狀物；生物被膜中的細(xì)菌，具有更強(qiáng)的環(huán)境壓力抗性。

2 生物被膜的形成過程

隨著近年來透射電鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等先進(jìn)儀器的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)生物被膜的形成是一個(gè)動態(tài)過程，主要包括5個(gè)階段[9,13-15]。

2.1 細(xì)菌定植

即細(xì)菌的初吸附。構(gòu)成生物被膜的初始細(xì)胞僅有少量EPS，并且多數(shù)細(xì)菌能夠借助菌毛獨(dú)立運(yùn)動。此階段的吸附可逆，因?yàn)槲降奈⑸镞€未進(jìn)行分化，許多細(xì)菌可以從載體表面游離出來成為浮游菌。

2.2 粘附

即不可逆吸附過程。從可逆吸附過程轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫖?，意味著在EPS存在條件下，細(xì)菌與載體表面的相互作用變強(qiáng)。細(xì)菌粘附在載體表面后，需要高強(qiáng)度的剪切力或者利用酶、去污劑、表面活性劑、消毒劑或者加熱破壞細(xì)胞與載體表面的吸附才能除去生物被膜。被吸附細(xì)菌會產(chǎn)生一種多糖，增強(qiáng)細(xì)胞間的吸附作用。

2.3 微菌落的形成

微生物進(jìn)一步生長繁殖，并聚集形成微菌落，同時(shí)產(chǎn)生EPS，增強(qiáng)細(xì)菌與基質(zhì)間的鍵合作用，提高菌落對環(huán)境壓力的抗性。通過細(xì)胞間化學(xué)信號的相互傳遞，微菌落不斷從周圍介質(zhì)中吸納浮游菌。微菌落的形成對于生物被膜的成熟非常有利，因?yàn)槲⒕湫纬珊螅N群間即能進(jìn)行養(yǎng)分交換，從而促進(jìn)生物被膜的成熟。

2.4 分化成熟

經(jīng)過不斷分化成熟，微菌落依賴于養(yǎng)分的不同最終形成扁平狀或蘑菇狀的高度組織化結(jié)構(gòu)。生物被膜完全達(dá)到成熟通常需要10 d或更長時(shí)間。成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)具有不均質(zhì)性，由微菌落組成，微菌落之間圍繞著水通道，可供運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排泄廢物等。

2.5 播散

外部條件的改變?nèi)缭鰪?qiáng)流體剪切力和生物被膜內(nèi)部環(huán)境的變化如內(nèi)部酶解的發(fā)生、EPS和表面鍵合蛋白的解離都可能導(dǎo)致生物被膜脫離。生物被膜的脫離是一個(gè)主動過程，因?yàn)檫@使得部分細(xì)菌離開菌群，并向遠(yuǎn)處播散繼續(xù)分裂增殖，啟動一個(gè)新的生物被膜形成過程。同時(shí)，饑餓也可能導(dǎo)致生物被膜脫落。脫落后，細(xì)菌可以尋找新的養(yǎng)分充足的環(huán)境。

3 生物被膜的危害

無論是在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家，食品污染成為威脅公眾健康的一個(gè)重要問題。據(jù)疾控中心報(bào)道，1996—2010年，在美國平均每年約1 000例食源性疾病爆發(fā)，導(dǎo)致4 800萬人患病，12.8萬人住院，3 000人死亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)許多病原性疾病的爆發(fā)與生物被膜有很大關(guān)系。在美國，約80%的持續(xù)性細(xì)菌感染案例與生物被膜有關(guān)。

生物被膜是微生物為適應(yīng)自然環(huán)境而特有的生命現(xiàn)象。生物被膜態(tài)微生物與常見的浮游態(tài)微生物相比有著顯著的不同，表現(xiàn)為其抗性更強(qiáng)、危害更大，且更難清除[17]。據(jù)報(bào)道，生物被膜態(tài)菌對各種化學(xué)殺菌劑的敏感程度只是同種浮游菌的1/10～1/1 000。由于生物被膜態(tài)菌對消毒劑的抗性更強(qiáng)，故生物被膜給食品工業(yè)帶來嚴(yán)重的食品安全問題。從食品生產(chǎn)到消費(fèi)的各個(gè)階段均可能感染微生物，特別是腐敗菌和病原菌易粘附于食品表面，在食品加工系統(tǒng)中形成生物被膜。生物被膜一旦形成，不僅會污染食品、增加設(shè)備清洗難度，使就地清洗系統(tǒng)（CIP）失效，成為其他有害微生物的藏身之地，還會腐蝕食品加工和貯運(yùn)設(shè)備，帶來嚴(yán)重危害[16,18]。此外，生物被膜還會促使更多細(xì)菌協(xié)同共生，使設(shè)備內(nèi)外表面成為傳播食源性疾病的隱性生物危害源，導(dǎo)致難以解決的食品質(zhì)量與安全問題[5,19]。

楊公明在主持“十五”國家蘋果汁重大專項(xiàng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)蘋果濃縮汁生產(chǎn)線在開工1個(gè)月后幾乎所有設(shè)定的CIP均不能保證自動清洗的質(zhì)量，因此注意到生物被膜的危害，研究發(fā)現(xiàn)蘋果濃縮汁產(chǎn)品中耐熱菌超標(biāo)是由于在超濾設(shè)備及生產(chǎn)線內(nèi)部形成生物被膜從而大幅增強(qiáng)細(xì)菌對熱及殺菌劑等的抵抗力，使原先設(shè)定的CIP無效；通過對CIP系統(tǒng)改進(jìn)，這一問題才得以解決[7]。2008年加拿大Maple Leaf Foods公司曾因食品加工設(shè)備清洗不徹底，產(chǎn)品被單增李斯特菌污染，導(dǎo)致20余人死亡，直接經(jīng)濟(jì)損失5 000余萬美元[5,20]。因此，食品加工過程中，生物被膜的控制和清除對保障食品安全尤為重要。

4 生物被膜的控制和清除

4.1 抑制生物被膜的形成

被膜態(tài)菌與浮游菌有著顯著的不同，其抗性更強(qiáng)、更難清除且危害更大。因此，在生物被膜尚未形成前采取措施抑制生物被膜的形成是控制生物被膜的首選。生物被膜傳感器可檢測到物體表面的細(xì)菌群落，故可以在生物被膜成熟之前為其控制提供明確的指示。Pereira等[21]發(fā)明一種表面感應(yīng)器，不僅能檢測到形成初期的生物被膜，還能檢測到清洗載體表面所用的試劑，識別出是何種清洗劑（生物或化學(xué)清洗劑），并計(jì)算出清除率。但在食品工業(yè)中，很難通過頻繁消毒抑制生物被膜的形成，故選擇不易形成生物被膜甚至能抑制生物被膜形成的材料作為食品加工接觸表面是抑制被膜形成的重要途徑。Rogers等[22]以自來水為唯一營養(yǎng)物質(zhì)，研究8種不同管道材料上生物被膜的吸附情況，發(fā)現(xiàn)沒有一種材料能完全抑制被膜的形成；其中，不銹鋼片和聚丙烯管道上的生物被膜菌較少，而乳膠和乙丙橡膠管道上的生物被膜菌最多。Fujii等[23]對比研究金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合菌在包被共聚物（由2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸正丁酯組成）的不銹鋼板和對照鋼板上的生物被膜形成情況，發(fā)現(xiàn)包被共聚物的不銹鋼板能抑制生物被膜的產(chǎn)生。近年來，一些含抑菌劑成分的食品包裝材料在抑制食品表面病原菌和腐敗菌的生長方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Knight等[24]發(fā)現(xiàn)含桿菌素的食品材料可有效抑制肉類加工中單核細(xì)胞增生性李斯特菌的吸附。Donlan[25]報(bào)道單核細(xì)胞增生性李斯特菌在含有尼生素的接觸表面的污染概率遠(yuǎn)低于對照組。Davies等[26]發(fā)現(xiàn)抗生素和低電流聯(lián)合作用產(chǎn)生的生物電效應(yīng)可有效抑制生物被膜形成。

研究發(fā)現(xiàn)，某些化學(xué)試劑可顯著抑制生物被膜的形成。Shanks等[27]研究檸檬酸鈉濃度對抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)濃度大于0.5%時(shí)，可有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成；相反，濃度低于0.5%時(shí)，會促進(jìn)大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株生物被膜的形成。Furukawa等[28]考察33種常用食品添加劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生物被膜的抑制作用，發(fā)現(xiàn)21種食品添加劑具有抑制生物被膜活性，其中蔗糖酯的抑制效果最好，且抑制效果隨糖酯中脂肪酸碳鏈的增長而增強(qiáng)。但還沒有一種方法能完全有效抑制生物被膜的形成[16]。

4.2 生物被膜的清除和殺滅

成熟生物被膜的清除通常是指利用物理或化學(xué)的方法破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)，使其從附著物表面脫落。在食品工業(yè)中，清洗和消毒對產(chǎn)品的品質(zhì)極為關(guān)鍵[29-30]。Gibson等[31]發(fā)現(xiàn)高壓噴射和機(jī)械地板洗滌器是清除生物被膜最有效的方法之一。表面活性劑或堿性化合物等化學(xué)試劑常用于清洗，它們通過減小表面張力、乳化脂肪、使蛋白質(zhì)變性來懸浮或溶解食物殘?jiān)黐32]。清洗過程必須能夠有效破壞或溶解生物被膜的胞外多糖，從而為消毒劑提供接觸深層菌的通道[16]。好的清洗工序盡管能去除90%甚至更多的微生物，但不能完全被殺滅。假以時(shí)日，微生物會重新吸附于載體表面，在富含水和營養(yǎng)物的條件下重新形成生物被膜。因此，清洗以后必須進(jìn)行消毒[33]。

消毒即用消毒劑殺滅生物被膜中的微生物，目的是殺滅清洗后殘留在載體表面的微生物，阻止其再次形成被膜。通常在缺乏有機(jī)物（如脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)等）條件下，消毒劑的滅菌效果更好。此外，有機(jī)物種類、pH、溫度、水的硬度、化學(xué)抑制劑、消毒劑濃度及接觸時(shí)間也是影響消毒效果的重要因素[34]。陳秋云等[35]研究二氧化氯對不銹鋼表面的金黃色葡萄球菌生物被膜的滅菌效果，發(fā)現(xiàn)有效氯質(zhì)量濃度100 mg/L時(shí)，作用15 min后，殺菌率100%；但是，有機(jī)營養(yǎng)物的存在會極大地降低二氧化氯的滅菌效果。Saitou等[36]研究酒精、冼必太、10%聚維酮碘、0.1%苯扎氯銨、0.1%烷基二甲基乙酸安泰樂和0.2%苯扎氯銨對銅綠假單胞菌生物被膜的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)除0.1%烷基二甲基乙酸安泰樂外，其余5種殺菌劑對浮游菌的殺滅率幾乎為100%；而對被膜態(tài)菌，只有0.1%苯扎氯銨的殺滅率不變，其余殺菌劑的殺菌效果均下降顯著。

食品工業(yè)對殺菌劑的使用有嚴(yán)格的要求，殺菌劑必須安全、有效、使用方便、用完后能從載體表面去除、無毒性殘留。但傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑只在高濃度、大劑量時(shí)才對生物被膜有較顯著的殺滅作用，但高濃度、大劑量化學(xué)殺菌劑的使用對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。另外，一些細(xì)菌可能會通過基因突變等方式對殺菌劑產(chǎn)生一定抗性及生理塑性[16,37]。

近年來，植物來源的殺菌劑越來越受到人們的關(guān)注，因?yàn)樘烊粴⒕鷦θ梭w和動物相對安全。Nostro等[38]報(bào)道牛至精油和2種酚類化合物對金黃色葡萄球菌生物被膜的殺滅濃度分別為0.25%～1.00%和0.125%～0.5%，并且亞殺滅濃度的精油能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

酸性電解水是一種無色、透明、無明顯刺激性氣味的安全型消毒液，誕生于20世紀(jì)80年代后半期，用于殺滅耐甲氧四林的金黃色葡萄球菌。與傳統(tǒng)殺菌劑比，酸性電解水具有殺菌效果好、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、畜產(chǎn)、水產(chǎn)等領(lǐng)域[39]。研究表明酸性電解水能有效殺滅生物被膜[40]。

此外，一些生物法如酶法和噬菌體在去除生物被膜中逐漸受到關(guān)注。食品工業(yè)中，酶是一種用來消除生物被膜的綠色制劑。柴子涵[4]發(fā)現(xiàn)利用噬菌體聚糖酶對生物被膜進(jìn)行預(yù)處理能顯著提高二氧化氯對生物被膜的殺死率。酶可以通過降解EPS破壞生物被膜結(jié)構(gòu)，使菌體釋放出來，從而達(dá)到去除生物被膜目的。Orgaz等[41]研究來源于黑曲霉、木霉、青霉的酶去除細(xì)菌生物被膜的效果，發(fā)現(xiàn)以果膠為碳源，黑曲霉和青霉所產(chǎn)的酶可有效降解假單胞菌生物被膜，達(dá)到工業(yè)清洗的要求。如果輔助使用一些簡單的物理或化學(xué)殺菌方法，能顯著增強(qiáng)酶的作用效果。Oulahal-Lagsir等[42]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用紫外照射、蛋白酶及多糖降解酶能有效去除不銹鋼表面的大腸桿菌生物被膜。聯(lián)合使用酶和殺菌劑可顯著提高生物被膜的去除率[43]。蛋白酶和表面活性劑的聯(lián)合使用可增強(qiáng)生物被膜的潤濕性，從而提高清洗效率[44]。多酶聯(lián)合作用或與其他試劑協(xié)同作用是今后利用酶控制生物被膜的主要研究方向。

噬菌體在自然界中廣泛存在，能侵染并破壞細(xì)菌，為生物被膜的控制提供一種專一、天然、靈敏、無毒的方法[45]。接觸到被膜菌是噬菌體有效降解生物被膜的關(guān)鍵。許多噬菌體能產(chǎn)生胞外多糖降解酶或細(xì)胞溶解素，降解被膜菌的保護(hù)屏障，使噬菌體能夠接觸到細(xì)菌，并識別細(xì)菌表面受體，進(jìn)而侵染并裂解被膜菌，從而達(dá)到較高的生物被膜降解率[46]。少量噬菌體在短時(shí)間內(nèi)即可裂解細(xì)菌，并快速繁殖大量子代噬菌體，高效破壞生物被膜[47]。故噬菌體在生物被膜控制中的應(yīng)用表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Sanna等[48]報(bào)道噬菌體phiIBB-PF7A可在短時(shí)間內(nèi)高效破壞并除去熒光假單胞菌生物被膜。

5 展望

展示生物被膜在食品加工中的危害及其防治重要性，盡管抑制生物被膜的形成是食品加工過程中生物被膜控制的首選途徑，但是由于生物被膜在自然界中廣泛存在，并且其具有較強(qiáng)的環(huán)境抗性，故難以完全抑制生物被膜形成。生物被膜一旦形成，就必須使用各種方法清除并殺滅。從分子水平進(jìn)一步研究生物被膜的形成機(jī)制、抗性機(jī)制，為實(shí)際生產(chǎn)中生物被膜的預(yù)防與控制提供理論依據(jù)和參考，從而保證食品安全和人體健康。