宋文，單春會，寧明，張琴，周發(fā)科，唐鳳仙

石河子大學食品學院（石河子 832000）

冷脅迫是限制植物生長、發(fā)育以及部分地區(qū)經濟作物產量的主要非生物因素之一[1]。當植物遭受到低溫脅迫時，質膜首先受到傷害，金屬離子、代謝物、營養(yǎng)交換及調節(jié)細胞過程等生理代謝功能發(fā)生紊亂，葉綠體、線粒體膜上的酶活力降低，光合作用和呼吸作用受到抑制，影響相關蛋白質的合成，進而影響植物的正常生長代謝[2-4]。受到冷脅迫的植物體內ROS、MDA、H2O2等聚集積累，含量增加，活性氧的產生與清除動態(tài)平衡被打破，致使細胞內的代謝水平失常，從而導致細胞及組織的凋亡，影響植物正常生長[5-8]。為了克服這一障礙，植物在進化過程中產生了各種適應性機制，通過調控相關基因的特異性表達，在植物體內誘導一系列復雜的生理生化變化來應對外界的低溫環(huán)境，其反應主要包括：誘導Ca2+和ABA的瞬時增加，脂質組成的改變，抗氧化活性的增加和滲透保護劑的積累[9-12]。在抗氧化活性增加的過程中，植物體內活性氧清除系統(tǒng)包括抗氧化酶防御系統(tǒng)和非酶抗氧化防御系統(tǒng)兩種自我防護體系[13-14]。其中抗壞血酸（Aseorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（Redueed glutathione，GSH）、類胡蘿卜素（Carotenoids，car）等抗氧化劑屬于非酶促系統(tǒng)中的主要抗氧化物[15-17]。

谷胱甘肽轉移酶（Glutathione S-transferase，GST，EC2.5.1.18）是一種多功能酶，可以催化還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和疏水、親電底物的共價結合，形成共軛物，隔離在液泡或轉移到質外體，從而對內源和外來有害物質進行降解，以達到降低細胞損害的作用[18-21]。GSTs的功能主要體現(xiàn)在3個方面：（1）催化與自身代謝物的結合反應；（2）結合植物化合物，使其在細胞之間穿梭運輸；（3）催化依賴GSH的生物轉化反應[22-23]。GST在真核生物和原核生物中普遍存在，國內外有許多學者在植物、動物、真菌和細菌中對其進行了研究。在高等植物中，GST被分為八類，包括Phi（GSTF），Tau（GSTU），Lambda（GSTL），脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR），Theta（GSTT），Zeta（GSTZ），EF1Bγ和四氯氫醌脫鹵素酶（TCHQD）[24]。在最近報道的植物GST分類中，新增了蚯蚓血紅蛋白和Ⅰ兩類[25-28]。在這些亞家族中，Phi，Tau，Lambda和DHAR在植物中特異性表達。典型的GST蛋白含有兩個保守的活性位點：一個是N-末端結構域中的GSH結合位點（G-位點），另一個是C-末端共底物結合結構域（H-位點）。G位點特異于GSH并且主要影響催化功能，而H位點有助于特定底物的結合[29-30]。對GST在抵御低溫脅迫中的作用進行綜述，為進一步研究植物抵御冷脅迫的分子機制提供重要思路。

1 玉米中GST的研究進展

Kósa等[31]對三葉期的玉米幼苗進行0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）處理，室溫下培育1 d后轉入冷庫中。冷脅迫下，經過0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）處理的樣品中谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性均高于對照組，而ROS（活性氧）水平低于對照組。結果表明，經過S-甲基蛋氨酸（SMM）處理的玉米幼苗可通過可誘導谷胱甘肽-S-轉移酶、谷胱甘肽還原酶及愈創(chuàng)木酚過氧化物酶等酶的大量表達來維持細胞的ROS平衡，增強玉米對冷脅迫的耐受性。

Mahfuzur等[32]將耐冷型玉米BARI hybrid maize-7幼苗培育至兩葉期，隨后將其置于4 ℃環(huán)境中進行培育。與對照組相比，隨著應激時間的延長，GST的活性增加，而過氧化氫酶（CAT）的活性相對降低。隨后免疫印跡分析（Western blot analysis）表明在冷脅迫期間，GST在幼苗體內顯著積累。H2O2含量在冷脅迫初期先增加，隨著GST活性的增加，H2O2含量趨于穩(wěn)定狀態(tài)，表明GST在耐冷型玉米中的表達可減輕H2O2對玉米細胞結構造成的氧化損傷，維持植物在冷脅迫下的生長。

Gábor等[33]對發(fā)芽期的玉米（Zea maysL.）進行羥胺衍生物BRX-156處理，隨后置于低溫環(huán)境中（5℃）培育一周。待樣品生長至三葉期后通過復合脅迫活力試驗（CSVT）確定幼苗中BRX-156對冷脅迫耐受性最大時的有效濃度。結果表明，與未經處理的樣本相比，玉米中的谷胱甘肽還原酶在50 mg·L?1BRX-156的誘導下活性增加了150%，幼苗的根、莖、鮮重分別高于對照組，表明經過BRX-156處理的玉米可通過誘導GST的大量表達，從而提高植物的抗寒性。

2 薯類GST的研究進展

Liu等[34]取生長旺盛的甘薯（Ipomoea batatsL.）植株的莖尖或尚未分化的腋芽，經消毒后，切成段，接種到瓊脂含量為1.8%的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27±2 ℃，光照約2 000 Lux。待無菌苗生長到約3 cm高時，選取生長旺盛的健康無菌苗，置于4 ℃冰箱，低溫誘導24 h后提取總RNA，同時提取常溫生長對照組的總RNA，隨后利用RT-PCR擴增IBGSTU1基因的編碼區(qū)片段，并對產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Western blotting的分析結果顯示，經過冷脅迫，甘薯組織在蛋白質水平上也能檢測到IBGSTU1基因的表達，說明甘薯IBGSTU1基因是誘導型表達，并且具有組織表達差異性，冷脅迫能夠在轉錄和翻譯水平上誘導IBGSTU1的響應，協(xié)助保護組織免受傷害。

Sepp?nen等[35]從耐冷型的馬鈴薯S.commersonii中克隆并鑒定了一種新型低溫調節(jié)GST——Solanum commersonii谷胱甘肽S-轉移酶（Scgst1），并在轉錄組學水平研究了Scgst1的耐冷機制。在經過過氧化氫和水楊酸處理的樣品中檢測到較強的mRNA信號，因此得出結論：Scgst1與早期活性氧物質（AOS）的調節(jié)相關。隨后在快速形成AOS的試驗條件下發(fā)現(xiàn)Scgst1在S.commersonii中顯著積累。在同一條件下，盡管在不耐冷型S.tuberosum中發(fā)現(xiàn)了Scgst1序列，然而并沒有檢測到Scgst1的積累。推斷：相比于不耐冷型的S.tuberosum，耐冷型的S.commersonii中Scgst1的大量積累與表達可以降低低溫對馬鈴薯細胞的損害，從而提高S.commersonii品種的耐冷性。

在后續(xù)研究中，Sepp?nen等[36]在低溫下對不耐冷型的S.tuberosum與耐冷型的S.commersonii中的glutathione S-transferase（ScgstF1）、heat shock cognate 70 kDa（Schsc70）以及dehydrin2（Scdnh2）等耐冷因子進行深入研究。熒光定量試驗結果（q-PCR）顯示S.commersonii和S.tuberosum的光合作用在霜凍期間均有所下降，而在S.tuberosum中，光合作用的下降程度更大并且表現(xiàn)為不可逆型。與此同時，相比于S.tuberosum，在S.commersonii中檢測到ScgstF1和Scdhn2的大量積累。進一步發(fā)現(xiàn)，在經過冷馴化和H2O2處理的樣本中，ScgstF1和Scdhn2在S.commersonii中均有大量積累，而在S.tuberosum中，只有Schsc70有所積累。結果表明，ScgstF1等耐冷因子可通過影響馬鈴薯的光合作用從而改變其耐冷性，H2O2預處理對ScgstF1等耐冷因子的表達與積累有積極作用。

3 水稻中GST的研究進展

作為人類的主要糧食作物，水稻在自然環(huán)境下容易受到冷脅迫的侵襲。為了解水稻對冷脅迫的響應機制，Zhao等[37]對耐寒型麗江新源河谷粳稻品種（LTH）進行低溫（8 ℃）處理，隨后進行全基因組表達分析，分別選取6，12，24和48 h四個時間點的樣品進行RNA提取及生信分析。qRT-PCR分析結果顯示，在抗氧化酶基因中發(fā)現(xiàn)了19種谷胱甘肽S-轉移酶（GST），其中有14種GST基因上調表達。在響應冷脅迫期間，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因（Os04g0556300）也有類似的特異性表達，這表明谷胱甘肽酶可以作為LTH中的活性氧物質（ROS）清除劑。

Takesawa等[38]從玉米中提取了zeta-glutathione-S-transferase基因，隨后通過土壤桿菌（Agrobacterium）將其導入到87株水稻中。在后期驗證試驗中，轉基因品系的幼苗在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強的萌發(fā)和生長速率。結果表明，低溫脅迫下，轉zeta-glutathione-S-transferase植物GST活性的增強可能調節(jié)與冷脅迫相關基因的表達以降低活性氧水平，增強植物耐低溫能力，提高植物的存活率。

Wang等[39]培育了野生型（對照組）、OsSPX1轉基因系植株與反OsSPX1轉基因系植株，并發(fā)現(xiàn)OsSPX1表達的下調與水稻幼苗對冷脅迫的高度敏感性密切相關。在冷脅迫下，與野生型和OsSPX1轉基因株系相比，反OsSPX1基因株系幼苗葉片中積累了大量的過氧化氫。水稻全基因組GeneChip分析顯示，OsSPX1可通過促進谷胱甘肽S-轉移酶、P450s等氧化應激標記基因以及Pi-信號傳導途徑及相關基因（OsPHO2）的上調表達，從而提高轉基因株系的耐冷性。

目前GST中有關Lambda家族蛋白的相關研究較少，Kumar等[40]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsGSTL2屬于GST中Lambda類成員，在抵御冷脅迫方面有積極作用。隨后將OsGSTL2導入到擬南芥中在不同脅迫條件下培養(yǎng)，分析表明OsGSTL2對冷脅迫和其他非生物脅迫（如重金屬、滲透脅迫和鹽）具有耐受性，與野生型相比，轉基因系植株的發(fā)芽率、根長、GST活性更高。結果表明，OsGSTL2通過增強擬南芥體內的抗氧化系統(tǒng)從而提高植物對冷脅迫的耐受能力。

4 其他植物中GST的研究進展

南瓜（Cucurbita maxima）營養(yǎng)豐富，是一種重要的經濟作物，然而低溫會影響它們的生長，嚴重影響其產量。Abdul等[41]將耐冷型的C.maxima（CP-1）和冷敏感型的C.moschata（EP-1）南瓜幼苗分別置于5，10和15 ℃環(huán)境中進行培養(yǎng)，在0，6，24，48和72 h五個時間點對樣品的葉片進行RNA提取，同時對根部、莖、花朵進行采樣，后期用作器官特異性表達分析。分析結果顯示，在冷脅迫下總共鑒定到32個GST基因，所有CmaGST基因在CP-1（C.maxima）和EP-1（Cucurbita moschata）中均特異性表達，其中7個（CmaGSTU3，CmaGSTU7，CmaGSTU8，CmaGSTU9，CmaGSTU11，CmaGSTU12和CmaGSTU14）在CP-1中均上調表達，其中18個CmaGST屬于tau類。在CP-1的20條染色體中，CmaGSTs分別在其中13條上有所表達，4號和6號染色體上的數(shù)量最多。CmaGST的上調表達緩解了冷脅迫對細胞的損傷，表明南瓜CmaGST在抵御冷脅迫過程中發(fā)揮著重要意義。

Yang等[42]研究了核桃（J.regia）中的tau亞家族谷胱甘肽S-轉移酶（GST）基因JrGSTTau1（Gene Bank No.：KT351091）。分別在16，12，10，8和6 ℃的條件下，發(fā)現(xiàn)JrGSTTau1在樣品中被應激誘導。與野生型prokII（空載體對照）相比，瞬時轉化表明JrGSTTau1的核桃中GST、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）表達量較高，而過氧化物酶（POD）活性、H2O2、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和電解質流失率（EL）相對較低。為了進一步證實JrGSTTau1的作用，將JrGSTTau1導入煙草中進行異源表達，分別選擇轉基因系Line5，Line9和Line12進行分析。結果表明常溫下野生型植株，Line5，Line9和Line12的萌發(fā)狀態(tài)相似，但在冷脅迫下，轉基因株系的鮮重、初生根長和總葉綠素含量顯著高于野生型植株。在后期培養(yǎng)過程中，轉基因煙草的GST和SOD活性顯著高于野生型。

馬建輝等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，AEGTA19581、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578和AEGTA07316在山羊草（Aegilops tanschii）的根中顯著上調表達，而AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA32578和AEGTA07316在葉中也顯著上調表達，這表明GST基因在響應低溫脅迫時，可能同時在根和葉中發(fā)揮著調控作用。

有研究表明花青素在植物響應冷脅迫過程中具有調節(jié)作用，在此過程中，GST起到了運輸花青素的作用[44-45]。Carmona等[46]在Pa與Ma兩種血橙（C.sinensisL. Osbeck）4 ℃與9 ℃的低溫貯藏分別發(fā)現(xiàn)了8與4個GST，它們屬于Phi與Tau類。與4 ℃相比，GST-F12、GST-F9、GST-F6、GST-U1在9 ℃的條件下上調表達，與花青素的濃度表達趨勢一致，花青素含量越高，血橙耐冷性越好。結果表明，GST通過參與花青素的轉運從而調節(jié)血橙的耐冷性。

5 結語與展望

低溫脅迫是限制植物生長的主要環(huán)境因素之一[47-51]。在受到冷脅迫侵襲時，植物體內會積累大量的ROS、MDA、H2O2等物質，這些物質的積累會破壞植物細胞中各種細胞器、蛋白質等生物分子，破壞膜的完整性和功能，影響植物的正常代謝[52-53]。植物自身在抵御脅迫的過程中，酶促防御系統(tǒng)中GST可將GSH與H2O2催化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O，也可將有機氫過氧化物分解為醇類、水和GSSG，GSSG隨后被谷胱甘肽還原酶還原為GSH，然后通過GSH與過氧化物反應，減少低溫脅迫對細胞膜結構的損傷[54-55]。

之前的研究證實GST在抵御冷脅迫及其他非生物脅迫方面扮演著重要的角色[56-59]。然而，在抵抗冷脅迫過程中植物GST的調節(jié)功能還是未知的，冷脅迫條件下GST是如何參與初級和次級代謝以及細胞信號傳導和調節(jié)功能、不同種類GST是如何發(fā)揮各自的作用、GST種類的差異性是否會對調節(jié)作用有影響以及這些GST具體是如何調控基因的表達及其與其它蛋白之間的關系等都有待于深入研究。在實際應用方面，現(xiàn)在主要通過基因工程技術將GST相關基因導入目的作物，培育出新型高產抗逆品種，用于對冷脅迫及其他脅迫具有增強抗性的轉基因作物的開發(fā)。但是當前轉基因技術還處于發(fā)展階段，其研究的安全性、轉基因相關的事例都還缺乏同時符合權威、科學、可信標準的渠道來解讀[60-61]。盡管植物抗脅迫基因工程的研究已經取得了很多方面的進展，但是抗脅迫轉基因植物作為轉基因植物的一種，也會引發(fā)人們對其安全性的思考[62]。因此在未來的研究中，如何更加多元化、安全快捷地將GST應用于作物抗逆性的研發(fā)將變得非常有必要。隨著轉錄組學、蛋白質組學等研究方法的不斷發(fā)展，GST在冷脅迫條件下的調節(jié)功能和分子機制將得到進一步的研究，在農業(yè)生產過程中的實際應用也將得到發(fā)展，這也將對作物在冷脅迫下提高其耐冷性有重要意義。