張瓅方， 李夢(mèng)華， 劉 暖， 楊 雷， 毛秉豫*

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南陽(yáng) 473004；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,南陽(yáng) 473061)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)以心肌缺血、缺氧為主要特征,其發(fā)病率和致死率均較高。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),缺血性心臟病占到死亡總數(shù)的13%,其中MI死亡率又居首位[1]。在中國(guó)因MI致死的心臟病已排在成人死亡率的第1位,因此深入研究MI防治具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。目前臨床治療MI采用的方法有口服藥物控制、外科手術(shù)以及近些年出現(xiàn)的介入治療,但不論是藥物還是外科干預(yù)都存有副作用或并發(fā)癥等弊端。治療性血管新生在心肌血管的再生作用被研究者稱(chēng)為“分子搭橋”,鑒于MI發(fā)病機(jī)制以循環(huán)障礙為主,因此有效建立側(cè)支循環(huán)通路改善心肌供血已成為防治MI的熱門(mén)方向[2—4]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前公認(rèn)最強(qiáng)大的促血管生成因子,由VEGF介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。血管生成素(Ang)是目前已知所有血管生成因子中獨(dú)具核糖核酸酶活性的因子,貫穿于血管生成全部過(guò)程,促血管生成能力非常強(qiáng)。血管穩(wěn)定因子Ang1是受體酪氨酸激酶Tie2主要激動(dòng)劑,Ang1/Tie2信號(hào)通路具有維持血管完整性和促進(jìn)血管新生的作用[5]。有研究顯示,小鼠體內(nèi)缺失Ang1或Tie2基因,在胚胎期的血管系統(tǒng)發(fā)育就出現(xiàn)異常,小鼠壽命縮短。如Ang1不能有效激活Tie2,則血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞無(wú)法緊密連接[6]。由此可見(jiàn)Ang1/Tie2信號(hào)通路在一定程度上彌補(bǔ)了VEGF的不足,尤其在促進(jìn)早期小血管發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著比VEGF更加完善的作用。前期經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了以“益氣化瘀,通絡(luò)生脈”的黃芪、丹參配伍提取物在促進(jìn)MI大鼠心肌組織血管新生的作用與上調(diào)VEGF表達(dá)相關(guān)[7-8]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察MI大鼠心肌組織中VEGF和Ang1/Tie2信號(hào)通路的病理變化,為中藥黃芪、丹參在促進(jìn)血管新生治療MI提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠,體重200～230 g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(豫)2015-0005；動(dòng)物質(zhì)量合格證:1001297)。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)方式,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作已通過(guò)南陽(yáng)理工學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2018DW-021)。

1.2 藥物、試劑、儀器

黃芪、丹參提取物在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“黃芪丹參配伍提取物對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的研究(71173372)”基礎(chǔ)上,由南陽(yáng)理工學(xué)院方藥研究所經(jīng)水提、大孔吸附樹(shù)脂純化所得(黃芪總苷含量66.9%,丹參總酚酸含量63.7%)。VEGF單克隆抗體(上海滬鼎生物科技有限公司,批號(hào):F324458)、Ang1抗體(上海譽(yù)博生物科技有限公司,批號(hào):K72452)、Tie2抗體(上海藍(lán)木化工有限公司,批號(hào):S157701)、羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):TC1378)、DAB顯色液(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):DD1660)、其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。HX-100E型動(dòng)物呼吸機(jī)(泰盟科技有限公司)、Tis型光學(xué)顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 MI模型建立

參照MI大鼠模型復(fù)制過(guò)程[8],SD大鼠以10%水合氯醛3 mL·kg-1行腹部注射麻醉后,仰臥位固定手術(shù)臺(tái)上接入呼吸機(jī)和心電監(jiān)護(hù),觀察心肌梗死后心率和心電圖變化。在大鼠左側(cè)第4肋間縱切5 mm,鈍性分離肌層置開(kāi)胸器,剪開(kāi)心包層暴露心臟。在大鼠心臟冠狀動(dòng)脈根部約3 mm處用眼科5-0型縫合線(xiàn)穿線(xiàn)結(jié)扎。肉眼可見(jiàn)附近心肌顏色變暗,心電圖II導(dǎo)連ST段弓背太高、QRS波增寬顯示模型復(fù)制成功。逐層縫合胸腔待大鼠恢復(fù)自主呼吸后撤去呼吸機(jī)和心電監(jiān)護(hù),術(shù)后行腹腔注射青霉素80萬(wàn)U 3 d預(yù)防感染。正常、MI大鼠心電圖見(jiàn)圖1、圖2。

心率:385次/min；電壓最大值:0.25 mV；電壓最小值:-0.35 mV；電壓峰峰值0.6 mV圖1 正常大鼠心電圖Fig.1 Electrocardiogram of normal rats

心率:378次/min；電壓最大值:0.32 mV；電壓最小值:-0.1 mV；電壓峰峰值:0.43 mV圖2 MI大鼠心電圖Fig.2 Electrocardiogram of MI rats

2.2 分組、用藥

實(shí)驗(yàn)分為:假手術(shù)對(duì)照組(A組,開(kāi)胸穿線(xiàn)后不接扎)、模型組(B組,給予等量生理鹽水)、黃芪、丹參配伍提取物低、中、高劑量組(C組、D組、E組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1。持續(xù)用藥4周。

2.3 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、體重變化、身體情況、死亡情況等。

2.4 HE染色

采集大鼠心尖部組織后以10%甲醛固定24 h。裝入包埋盒中脫水并依次石蠟包埋。包埋好的組織塊以4 μm厚度切片,45 ℃烤片后標(biāo)記備用,分別用于HE染色和免疫組化檢測(cè)。

HE染色步驟:先將石蠟片60 ℃加熱30 min,浸泡二甲苯內(nèi)脫蠟5 min反復(fù)3次,依酒精濃度梯度遞減100%、95%、85%、75%依次脫水。用蘇木素染色5 min后水洗,鹽酸酒精分化30 s后水洗,氨水返藍(lán)30 s后水洗,轉(zhuǎn)伊紅染色10 min水洗。再次將切片依酒精濃度梯度遞增75%、85%、95%、100%依次脫水后晾干,采用中性樹(shù)膠封片。400倍光學(xué)顯微鏡拍照。

2.5 免疫組織化學(xué)染色

心肌取材部分同HE染色步驟烤片和脫蠟。抗原熱修復(fù)把切片放入枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)95 ℃計(jì)時(shí)5 min后取出冷卻至室溫。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)反復(fù)清洗3次,每次5 min。滴加3%過(guò)氧化氫室溫?fù)嵊?0 min后,PBS緩沖液再次重復(fù)清洗3次(5 min/次),甩干后加入5% 牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。去除BSA溶液后,加入一抗(1∶100稀釋的VEGF、Ang1、Tie2)覆蓋組織,置于4 ℃冷藏12 h。取出保溫盒復(fù)至常溫后清洗3次(5 min/次),加入二抗羊抗兔IgG(1∶200稀釋)37 ℃孵育60 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。蘇木素復(fù)染后蒸餾水洗滌,二甲苯脫水透明,采用中性樹(shù)膠封片。400倍光學(xué)顯微鏡下,取6個(gè)不重疊視野拍照分析,NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)計(jì)算VEGF、Ang1和Tie2蛋白的平均吸光度,對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

在4周的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,A組大鼠飲食和體重均有所增加、二便正常、精神狀態(tài)穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏、皮毛有光澤度；B組大鼠飲食減少、體重下降、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲緩；C組、D組和E組大鼠整體情況與B組比較有不同程度改善。40只大鼠除B組死亡1只外,其余各組均存活,大鼠資料收集完整。

3.2 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果如圖3所示。A組心肌細(xì)胞完整、色澤鮮紅,各組織排列有序,細(xì)胞邊緣規(guī)則,周?chē)芮煌暾?顯微鏡視野下整體形態(tài)分布較完整。B組心肌組織排列紊亂,出現(xiàn)大片壞死并伴有周?chē)仔苑磻?yīng),細(xì)胞邊緣伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),成纖維組織機(jī)化,整體形態(tài)模糊不清。C組、D組和E組心肌細(xì)胞色澤逐漸鮮亮轉(zhuǎn)紅,組織間隙規(guī)則,其中C組還伴有部分炎性反應(yīng)和增生的成纖維組織,D組和E組的心肌細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)清晰,周?chē)芮煌暾?。提示黃芪、丹參配伍提取物有維持細(xì)胞完整、促進(jìn)血管新生的作用。

圖3 MI大鼠各組心肌組織HE染色結(jié)果(×400)Fig.3 Results of HE staining of myocardial tissue in each group of MI rats(×400)

3.3 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達(dá)影響

MI大鼠各組心肌組織切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后,VEGF、Ang1、Tie2陽(yáng)性細(xì)胞在心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)深淺不一的棕褐色顆粒。經(jīng)NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)顯示:與A組相比,B組胞漿中VEGF、Ang1和Tie2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高,兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與B組相比,C組、D組和E組胞漿中VEGF、Ang1和Tie2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)隨藥物濃度增高逐漸上升(P<0.05或P<0.01)。提示黃芪、丹參配伍提取物可提高VEGF、Ang1和Tie2蛋白的表達(dá)水平。見(jiàn)表1、圖4。

圖4 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達(dá)結(jié)果(×200)Fig.4 Results of VEGF, Ang1, Tie2 proteinexpression in myocardialtissue of MI rats (×200)

4 討論

“痹”,乃閉塞不通之義,早在《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·痹論》篇中就記載“心痹者,脈不通……痹在與脈,則血凝而不流[9]?！敝袊?guó)醫(yī)學(xué)中以胸部悶痛或胸痛徹背為主癥的癥候群歸為胸痹范疇診治,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中以心肌缺血、缺氧為主要特征的心肌梗死亦可納入治療。引起胸痹的原因有寒凝、氣滯、血瘀、痰濁、陽(yáng)虛、氣虛等多種,總結(jié)病機(jī)不外乎虛、實(shí)兩種；治療方法有通陽(yáng)散寒、行氣散結(jié)、活血化瘀等多樣,始終圍繞“不通則痛、通則不痛”的“通”法。中藥黃芪性溫味甘,有補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒生肌等功效,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載此藥:“可治一切氣衰血虛之證”,是臨床常用補(bǔ)氣藥?！耙晃兜?功同四物湯”中的丹參性微寒味苦,有活血化瘀,行氣止痛等功效,是臨床常用活血化瘀藥。黃芪、丹參合用體現(xiàn)中醫(yī)在胸痹病中“氣行血生”的治療特色,項(xiàng)目組前期觀察黃芪、丹參配伍治療能有效緩解心絞痛、心肌梗死等氣滯血瘀型患者疼痛感,改善心肌供血,臨床療效較好[10-11]。心肌梗死后的修復(fù)及預(yù)后與心肌細(xì)胞、血管功能密切相關(guān),因此有效建立側(cè)支循環(huán)通路對(duì)改善心肌梗死區(qū)有著至關(guān)重要的意義。這種誘導(dǎo)心肌自我搭橋的“治療性血管新生”方法已成為現(xiàn)代治療心腦血管疾病的攻克方向,促進(jìn)血液循環(huán),增加血管新生的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論恰巧與中醫(yī)學(xué)中“氣為血之帥、血為氣之母”氣行則血生的氣血并治理論相同,因此項(xiàng)目組繼續(xù)以從益氣化瘀、通絡(luò)生脈的黃芪、丹參配伍提取物為組合藥對(duì),探討其促血管新生的作用機(jī)制。

表1 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)對(duì)照組相比,*P<0.05；與模型組相比,#P<0.05、##P<0.01。

血管新生是一個(gè)復(fù)雜的系列過(guò)程,在發(fā)生過(guò)程中需要募集各種細(xì)胞因子參與。VEGF在血管新生過(guò)程中可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增值、分化,對(duì)抗炎性細(xì)胞等各種損傷因子[12]。Ang1/Tie2信號(hào)通路是近些年發(fā)現(xiàn)除VEGF/VEGFR信號(hào)通路之外新的血管生成通路,在血管生成的生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[13,14]。Ang1可維持新生血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定,限制異常血管的新生；Ang2對(duì)Ang1有拮抗作用,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中絲分裂信號(hào)敏感性強(qiáng),促使異常血管形成。Ang1和Ang2共同作用與受體Tie2發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性的作用。血管新生的早期階段因細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解伴隨著血管通透性增加,刺激一系列血管生成因子從而激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增殖遷移,是生出肉芽組織方式逐漸形成新生血管[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組在HE染色和免疫組織化學(xué)染色中均呈現(xiàn)出心肌纖維化結(jié)構(gòu)、組織排列紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重并伴有胞核溶解現(xiàn)象。

在這些受損的不利因素刺激下,模型組VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子雖有所增加,但卻未形成成熟的新生血管,并容易出現(xiàn)瘢痕組織,可見(jiàn)這是機(jī)體自我防御保護(hù)中采取的一種應(yīng)急性措施。經(jīng)過(guò)黃芪、丹參配伍提取物干預(yù)后,各組隨著藥物濃度的提高,原有受損的心肌組織逐漸被出現(xiàn)的新生血管代替,炎性侵潤(rùn)減少,肉芽組織良性生成較多,心肌細(xì)胞色澤鮮紅且排列有序。VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子呈藥物濃度依賴(lài)性增加,HE染色光學(xué)顯微鏡下心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化和免疫組織化學(xué)結(jié)果高度一致。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞在缺血、缺氧條件下,經(jīng)黃芪、丹參配伍提取物干預(yù)后作用明顯,VEGF保護(hù)性表達(dá)增加,有效地減少了內(nèi)皮細(xì)胞損傷,增加血管壁通透性,促進(jìn)參與血管生成因子的增殖和分化。Ang1/Tie2信號(hào)通路加速內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖和遷移,出芽生成新的血管腔結(jié)構(gòu)并維持血管腔結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。VEGF和Ang1/Tie2信號(hào)通路在血管新生過(guò)程中相互協(xié)同,有效改善心肌再灌注狀態(tài)。