劉順字 韓文節(jié) 歐志鵬 華四妹 郭淑貞 廖遠東 林雙娣
摘要:采用液相色譜法檢測蔬菜中殘留的3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥,對方法中的主要不確定度來源進行量化,計算總不確定度和擴展不確定度。結(jié)果表明,液相色譜法檢測3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的相對標準不確定度分量(Urel)均表現(xiàn)出Urel標準品(總)>Urel回收率>Urel樣品>Urel儀器的規(guī)律。研究結(jié)果為檢測蔬菜中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留提供了參考。
關(guān)鍵詞:液相色譜法;氨基甲酸酯類農(nóng)藥;蔬菜;不確定度
中圖分類號:S482.3+4文獻標識碼:A文章編號:1000-4440(2020)06-1569-06
Abstract:Liquid chromatography method was applied to detect the residues of three carbamate pesticides in vegetables, the sources of main uncertainties were quantified, and the total uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the relative standard uncertainty components (Urel) of three carbamate pesticides all presented the rule of UrelStandard sample(total)>UrelRecovery rate>UrelSample>UrelInstrument. The results provide a references for analyzing the residues of carbamate pesticides in vegetables.
Key words:liquid chromatography method;carbamate pesticides;vegetable;uncertainty
在檢測蔬菜中的農(nóng)藥殘留時,實驗室采用的檢測方法會直接影響檢驗、檢測報告的質(zhì)量,因此在實驗室初次選用標準或非標準方法開展檢測時,通常需要對選定的方法進行確認[1]。在使用非標準方法或某些標準方法進行檢測時,還需要進行不確定度的評估[2],通過評估不確定度可以量化主要不確定因子與檢測結(jié)果的范圍[3]。由此可見,評價測量的不確定度是保障實驗室檢測結(jié)果質(zhì)量的重要手段之一[4]。
液相色譜儀在市(縣)級農(nóng)產(chǎn)品檢測機構(gòu)中的應(yīng)用較為廣泛,主要用于測定蔬菜、水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況,是農(nóng)產(chǎn)品檢測機構(gòu)使用的重要檢測儀器之一[5-6]。本研究通過評定不確定度的基本方法,分析不確定度分量的因素與其對檢測結(jié)果的影響程度[7-8],以期為正確評價和使用測量結(jié)果提供試驗依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗材料
本試驗所用材料為四九菜心,購自中振智農(nóng)科技有限公司。
1.2儀器與試劑
1.2.1儀器液相色譜儀(LC-20A, RF-20Axs),產(chǎn)自日本Shimadzu公司;勻漿機(T18DS25),產(chǎn)自德國IKA公司;高速離心機(TDL-5-A),產(chǎn)自上海安亭科學(xué)儀器廠;氮吹儀(N-EVAP-112),產(chǎn)自美國Organomation公司;萬分之一電子分析天平(JJ-124BC),產(chǎn)自常熟市雙杰測試儀器廠;1 000 ml砂芯過濾裝置,產(chǎn)自天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。
1.2.2試劑滅多威、甲萘威、克百威標樣均由原農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供,質(zhì)量濃度均為100μg/ml,溶劑均為甲醇。乙腈(99.99%)、甲醇(99.99%)與二氯甲烷(99.9%)均為色譜純,產(chǎn)自Honeywell;NaOH為優(yōu)級純,產(chǎn)自廣州化學(xué)試劑廠;硼酸為優(yōu)級純,產(chǎn)自廣州化學(xué)試劑廠;99%鄰苯二甲醛,產(chǎn)自PICKERING;巰基乙醇,產(chǎn)自株式會社同仁化學(xué)研究所;SPE-NH2固相萃取小柱,產(chǎn)自Shimadzu。除試驗用水為超純水外,其他試驗試劑均為分析純。
1.3試驗方法
1.3.1提取與凈化用200 ml燒杯稱取25.000 0 g解凍的菜心鮮樣,再向燒杯中倒入50.0 ml乙腈,用勻漿機在燒杯中高速勻漿2 min后,將混合物倒入三角漏斗中進行過濾,濾液用裝有6.0 g氯化鈉的具塞量筒全部收集。過濾后,雙手劇烈搖晃具塞量筒1 min,然后將其靜置30 min,取上清液10.0 ml轉(zhuǎn)移至玻璃試管內(nèi),用氮吹儀在50 ℃恒溫水浴條件下緩慢吹至近干狀態(tài),再用2.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為1∶99)溶解試管內(nèi)的殘渣,將溶解物上樣至固相萃取小柱中進行凈化,用10.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為5∶95)分2次洗脫,將全部洗脫液用液氮吹至近干。用甲醇(99.99%)定容至2.0 ml,再用注射器將溶液緩慢通過孔徑為0.22 μm的濾膜,收集適量過濾后的溶液于樣品瓶內(nèi)待上機檢測[9-10]。
1.3.2色譜條件色譜柱采用WondaSil C18-WR 5 μm(4.6 mm×250.0 mm),流動相為水-甲醇(體積比為4∶1),流速為1.0 ml/min,柱溫為50 ℃。溶劑的梯度洗脫過程:15%甲醇0.01 min→20%甲醇4.00 min→35%甲醇11.00 min→70%甲醇31.00 min→90%甲醇31.01 min→70%甲醇34.00 min→15%甲醇34.01 min→15%甲醇40.00 min,停止。
2結(jié)果與分析
2.1數(shù)學(xué)模型的建立[11]
(1)檢測3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在菜心中的殘留量所用的數(shù)學(xué)模型為:
式中:X為鮮樣中的農(nóng)藥含量(mg/kg),C為由標準曲線校正后試樣中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(mg/L),V為樣品的定容體積(ml),m為鮮樣質(zhì)量(g),f為稀釋因子。
(2)根據(jù)相對標準不確定度分量計算總相對標準不確定度,公式[12]為:
式中:Urelyi為總相對標準不確定度,Urelxi為各分量的相對標準不確定度,N為分量數(shù)。
(3)儀器按最小二乘法擬合工作曲線,計算標準曲線的標準差,公式為:
式中:SA為標準曲線的標準差,yi為第i次測得的色譜峰面積,a為曲線截距,b為曲線斜率,ci為第i次根據(jù)標準曲線計算得到的濃度,n為標準溶液的總測量次數(shù)。
(4)曲線擬合相對標準不確定度(UrelQ)計算公式為:
式中:SA為標準曲線的標準差,p為樣品的測量次數(shù),n為標準溶液的總測量次數(shù),b為標準曲線的斜率,c1為通過標準曲線計算出的樣品溶液濃度均值, c-為各標準系列溶液濃度的平均值,ci為第i次根據(jù)標準曲線計算得到的濃度。
2.2平行試驗結(jié)果
在菜心基質(zhì)對照中分別按1.00 mg/kg的質(zhì)量分數(shù)加入滅多威、甲萘威、克百威3種標樣,共設(shè)6個重復(fù)。由表1可以看出,基質(zhì)中滅多威、甲萘威、克百威的平均測定值(最佳估計值)分別為0.952 mg/kg、0.885 mg/kg、0.920 mg/kg。
2.3不確定度評價
在實驗室數(shù)學(xué)模型的建立與分類過程中,檢測樣品(菜心)中農(nóng)藥殘留量所用的主要不確定度來源見表2。
2.3.1由標準品引起的不確定度
2.3.1.1由標準物質(zhì)本身引起的不確定度滅多威、甲萘威、克百威3種農(nóng)藥標準溶液的偏差統(tǒng)一為±0.5%。根據(jù)均勻分布分析得出,置信因子(k)=3=1.732,3種農(nóng)殘標準品的Urel標=0.5%/1.732=0.002 89。
2.3.1.2在標準品與標準曲線制作過程中由玻璃器皿產(chǎn)生的不確定度(1)容量瓶與移液管自身產(chǎn)生的不確定度。由檢定證書可知容量瓶(容積為10 ml)的最大誤差是±0.10 ml,移液管(容積為1 ml)的最大誤差是±0.007 ml,根據(jù)均勻分布計算得到相對標準不確定度[13]:
U容量瓶=0.1/3=0.057 7 ml,Urel容量瓶=0.057 7 ml/10 ml=0.005 77(自由度為∞);
U移液管=0.007/3=0.004 04 ml,Urel移液管=0.004 04 ml/1 ml=0.004 04(自由度為∞)。
(2)環(huán)境溫度對容量瓶與移液管量取溶液時產(chǎn)生的不確定度。實驗室的溫度一般控制在(20±5) ℃[14]。乙腈膨脹系數(shù)為1 ℃ 1.36×10-3,玻璃器皿膨脹系數(shù)為1 ℃ 2.50×10-5,由于乙腈膨脹系遠遠大于玻璃器皿,因此忽略溫度對玻璃器皿產(chǎn)生的膨脹影響,僅以溫度造成的乙腈體積變化進行計算[15]。溫度對容量瓶與移液管2個玻璃器皿量取溶液時的不確定度分別為:
Ut-容量瓶=10×5×1.36×0.001/3=0.039 3 ml,Urel t-容量瓶=0.039 3 ml/10 ml=0.003 93 (自由度為∞);
U t-移液管=1×5×1.36×0.001/3=0.003 93 ml,Urel t-移液管=0.003 93 ml/1 ml=0.003 93 (自由度為∞)。
根據(jù)矩形分布[16]和公式(2)可得玻璃器皿總相對標準不確定度(Urelgla)為0.008 97。
2.3.1.3標準曲線擬合的不確定度對不同質(zhì)量濃度的標準溶液系列做6個水平的檢測,采取最小二乘法擬合標準溶液質(zhì)量濃度-色譜峰面積曲線[17],相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。由最小二乘法擬合標準溶液質(zhì)量濃度-色譜峰面積可得,滅多威、甲萘威、克百威的線性回歸方程分別為Y1=4 970.2x1+5 105.4 (R2=0.999 9)、Y2=4 255.6x2+6 399.5 (R2=0.999 9)、Y3=2 606.2x3+2 696.8 (R2=0.999 8)。根據(jù)公式(3)可得滅多威、甲萘威、克百威的標準偏差分別為11 524.45、7 989.27、6 718.38。根據(jù)公式(4)可得滅多威、甲萘威、克百威的相對標準不確定度(Urelcur)分別為0.017 6、0.015 7、0.020 2。
由標準物質(zhì)本身引起的不確定度,在標準品與標準曲線制作過程中由玻璃器皿產(chǎn)生的不確定度(Urelgla),由標準曲線擬合造成的不確定度是標準品物質(zhì)產(chǎn)生總相對不確定度Urel標(總)的來源[18],依據(jù)公式(2)(Urel標(總)=Urel2標+Urel2gla+Urel2cur),由滅多威、甲萘威、克百威的3種標準品產(chǎn)生的總相對不確定度(Urel標(總))依次是0.021 6、0.020 2、0.023 8。
2.3.2重復(fù)檢測引起的不確定度樣品的質(zhì)量濃度通過儀器讀數(shù)獲取,由于用儀器重復(fù)檢測樣品時的峰面積存在差異,因此采用標準不確定度的A類評定法,即根據(jù)重復(fù)次數(shù)獲得不確定度[19]。將3種農(nóng)藥標準品配成合適的質(zhì)量濃度后重復(fù)檢測6次,測定結(jié)果見表4。
根據(jù)JJF 1059-1999《測量不確定度評定與表示》,本試驗僅檢測6次,并根據(jù)極差法開展不確定度的評定[20]。查閱《極差系數(shù)及自由度表》可得:測量次數(shù)(n)=6,極差系數(shù)(C)=2.53,A-為6次檢測峰面積的平均值。滅多威的標準不確定度(U儀)=R/C=65/2.53=25.69,重復(fù)檢測滅多威的相對標準不確定度(Urel儀)= U儀/A-=25.69/93 638=0.000 274。同理,重復(fù)檢測甲萘威、克百威的相對標準不確定度(Urel儀)分別為0.000 313、0.000 515。
2.3.3樣品處理產(chǎn)生的不確定度稱取樣品用的天平與凈化定容的玻璃器皿是制備樣品過程中產(chǎn)生不確定度的2個主要因素[21]。本研究中精度為0.000 1 g的天平最大誤差范圍是±0.01 mg,置信區(qū)間為99%。在方法1.3.1中,樣品的稱取質(zhì)量為25.000 0 g,根據(jù)正態(tài)分布分析可知,置信因子(k)為2.576[22]。移液管的不確定度參照方法2.3.1.2測定[23],樣品處理過程中的不確定度見表5。根據(jù)公式(2),3種樣品處理過程中引起的總相對標準不確定度(Urel樣)為0.004 294。
2.3.4結(jié)果分析產(chǎn)生的不確定度回收率是結(jié)果分析中產(chǎn)生不確定度的重要來源[24],本試驗采取0.010 mg/kg、0.050mg/kg、0.100 mg/kg 3個質(zhì)量濃度檢測滅多威、甲萘威、克百威3種農(nóng)藥的殘留回收率的相對標準不確定度(Urel回),每個濃度設(shè)6次重復(fù),結(jié)果見表6 [25]。采用標準不確定度的A類評定法檢測本試驗的回收率[26],得到滅多威的U回=3.9/18=0.92,Urel回=0.92/87.5=0.010 5;同理,甲萘威、克百威的Urel回分別為0.011 6、0.011 3。
2.4總相對標準不確定度
試驗全程產(chǎn)生的方法不確定度因子有4個,即標準品、儀器、樣品與回收率[27]。根據(jù)表7中的分量與公式(2) [28],得到總相對標準不確定度(UrelT)的計算公式:UrelT=Urel2標(總)+Urel2儀+Urel2樣+Urel2回,其中滅多威的UrelT= 0.024 4,甲萘威的UrelT=0.023 7,克百威的UrelT=0.026 7。
2.5總擴展不確定度
在95%置信水平下,包含因子(k)=2,可得相對擴展不確定度(u)=UrelT×k[29]。根據(jù)2.2節(jié)中3種農(nóng)藥的最佳估計值,計算得到的擴展不確定度見表8。
3討論
根據(jù)上述分析可知,滅多威、甲萘威、克百威3種殘留量的擴展不確定度(置信水平為95%)分別為0.004 6 mg/kg、0.004 2 mg/kg、0.004 9 mg/kg。在本方法中,滅多威、甲萘威、克百威3種農(nóng)藥殘留量的相對標準不確定度分量呈現(xiàn)的趨勢為Urel標>Urel回>Urel樣> Urel儀。分析相對標準不確定度分量對總相對標準不確定度的影響,有利于今后在檢測過程中有針對性地降低結(jié)果的不確定度。
參考文獻:
[1]陳凌云. 檢測和校準實驗室非標準方法的確認與證實[J].中國纖檢,2015(9):63-65.
[2]王慶慶,高剛,呂茹,等. 淺談社會環(huán)境監(jiān)測機構(gòu)方法確認的過程及方法[J].環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展,2017(5):68-69.
[3]陳婷. 點型感溫火災(zāi)探測器基本功能測試中的不確定度研究[D].廣州:廣東工業(yè)大學(xué),2017.
[4]安平,劉浩峰,華廣勝. 檢測實驗室測量不確定度評定與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國檢驗檢測,2018,26(6):60-63.
[5]王小蘭. 新型多孔有機聚合物的制備及其在高效液相色譜法測定一些農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用[D].天津:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2019.
[6]劉向陽,席玉強,尹新明,等. 河南省大宗水果中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析[J].華中昆蟲研究,2017,13:243.
[7]胡寧,韓淑杰. 測量不確定度評定的應(yīng)用分析[J].中國計量,2017(5):87-88.
[8]汪志威,周思齊,李非里,等. 實驗室農(nóng)藥殘留檢測的測量不確定度評定——以GB 23200.8-2016測定草莓中4種農(nóng)藥殘留為例[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2020,22(1):105-114.
[9]吳定芳,王磊,何茫茫,等. 高效液相色譜法測定蔬菜中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量[J].理化檢驗(化學(xué)分冊),2020,56(2):142-147.
[10]王敏,李廣益,宋豐江,等. 高效液相色譜法測定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥[J].食品研究與開發(fā),2018,39(1):122-125.
[11]洪澤淳,熊含鴻,劉瑩瑩,等. 氣相色譜法測定蔬菜中16種有機磷農(nóng)藥殘留量的測量不確定度評定[J].食品工業(yè)科技,2020,41(3):239-245.
[12]石攀. QuEChERS法在食品中農(nóng)獸藥多殘留檢測中的應(yīng)用[D].鄭州:鄭州大學(xué),2016.
[13]蘇煥斌,張燕,吳勝澤,等. 氣相色譜法測定雞蛋中七氯的不確定度評定[J].廣東化工,2018,45(11):242-243,251.
[14]趙宇明. 黃酒氨基酸態(tài)氮含量測定結(jié)果的不確定度評定[J].釀酒科技,2018(1):80-86.
[15]楊德毅,劉莉,李依嵐,等. 高效液相色譜測定柑橘中松脂酸銅殘留量的不確定度評定[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2018(5):74-79.
[16]顧瑞榮,魯學(xué)正. 淺析容量分析法測量結(jié)果不確定度的計算[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用,2016(3):34.
[17]李永麗,潘中喬亞,肖 宇. 高效液相色譜法測定食醋中丙酸含量的測量不確定度評定[J].食品安全導(dǎo)刊,2019(24):126-127.
[18]湯麗華. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中地塞米松殘留量的不確定度評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2018,9(13):3258-3262.
[19]李英杰,鄭玉山,周晉堯,等. 高效液相色譜法測定奶粉質(zhì)控樣品中三聚氰胺的含量及其不確定度分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2020,11(3):950-954.
[20]楊消亭. 頻率法索力測試的不確定度研究[D].重慶:重慶交通大學(xué),2018.
[21]李煜婷,唐丹,牛翰林,等. 固相萃取-高效液相色譜法測定土壤中苯并(a)芘不確定度分析[J].油氣田環(huán)境保護,2017,27(5):41-44.
[22]鄢星,魏惠珍,吳柳瑾,等. UV法測定益母草總生物堿含量及其不確定度評價[J].食品研究與開發(fā),2018,39(11):115-120.
[23]程春霞. 火焰原子吸收法偏轉(zhuǎn)與不偏轉(zhuǎn)燃燒頭測定高濃度鈉的不確定度分析[J].廣東微量元素科學(xué),2015,22(11):16-22.
[24]謝莊擎,黃翠莉. 氣相色譜法檢測蔬菜和水果中3種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的不確定度評定[J].廣東化工,2016,43(9):225-228.
[25]王樹奇. 蔬菜中有機磷類農(nóng)藥多殘留分析方法的建立[D].哈爾濱:黑龍江大學(xué),2018.
[26]魏維杰,王麗芳. 液相色譜法測定辣椒中克百威農(nóng)藥殘留量的不確定度評定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(8):89-91.
[27]林飛影. 王水消解-原子熒光光度法測定土壤中總汞的含量[J].廣東化工,2018,45(11):250-251.
[28]謝文輝,田麗妍,劉媛媛. 頂空氣相色譜外標法測定血液中乙醇含量的不確定度評定[J].計量與測試技術(shù),2016,43(3):88-89.
[29]董曉杰,董兵,劉鋒平,等. 氣相色譜內(nèi)標法測定消毒劑中乙醇含量的不確定度評定[J].中國消毒學(xué)雜志,2017,34(12):1096-1099.
(責任編輯:徐艷)