朱道仙 陸江 趙學剛 劉莉 吳雙

摘要：為研究大黃素對犬慢性腎衰竭（CRF）的治療效果與對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用之間的關系，探究大黃素延緩CRF的作用機制，采用34例犬慢性腎衰竭病例，其中大黃素治療組（RT）22例，常規(guī)治療組（UT）12例。UT組患犬口服復方α-酮酸片+腎臟處方糧;RT組在UT組基礎上按100 mg/（kg·d）口服大黃素，治療期為45 d。定時采集患犬血液，檢測尿毒素水平并無菌收集患犬糞便，用于腸道菌群16S rDNA測序及其代謝物檢測。將2組治療前后的患犬糞菌液移植給慢性腎衰竭模型無菌小鼠，驗證患犬腸道菌群對CRF的影響。結果顯示：RT組患犬的血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、硫酸吲哚酚（IS）和硫酸對甲酚（PCS）含量逐漸降低，腸道菌群豐度增加，與試驗前及UT組有顯著差異;菌群結構也發(fā)生改變，表現(xiàn)為腸桿菌科、假單胞菌科等細菌豐度逐漸降低，而普氏桿菌屬、乳桿菌屬、丁酸梭菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌逐漸成為優(yōu)勢菌群，與UT組有差異。RT組腸道菌群在遺傳信息處理、核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝等代謝途徑方面表現(xiàn)活躍，患犬糞中代謝物丁酸含量升高，吲哚與H2S含量逐漸降低，與試驗前及UT組有顯著差異，這些代謝物含量的變化趨勢與其生產(chǎn)菌群的變化趨勢相一致。慢性腎衰竭無菌小鼠糞菌移植結果表明，RT組試驗后的糞菌可以顯著降低小鼠血中Scr和BUN含量。以上結果說明，大黃素可以使CRF犬紊亂的腸道菌群重建平衡，改變細菌代謝物水平，從而減少腸道菌群對犬慢性腎衰竭的不良影響。

關鍵詞：大黃素;犬;慢性腎衰竭;腸道菌群;16S rDNA測序

中圖分類號：S858.292.659文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1489-09

Abstract：To study the relationship between the therapeutic effect of emodin on chronic renal failure （CRF） and the regulating effect of emodin on gut microbiota in dogs， so as to explore the mechanism of emodin in alleviating CRF， 34 cases of CRF dogs were used， among which emodin treatment group （RT） contained 22 cases and usual treatment group （UT） contained 12 cases. The dogs in the UT group were given prescription diet containing compound α-ketoacid tablets plus kidney， while the dogs in the RT group were given 100 mg/（kg·d） emodin by oral on the basis of the prescription in the UT group， the treatment period was 45 days. Blood of the dogs was collected regularly to detect the level of urotoxin and feces of the dogs were collected aseptically for 16S rDNA sequencing of gut microbiota and related metabolites detection. The fecal bacterial solution of the two groups before and after treatment were transplanted into germ-less CRF mice respectively to verify the effect of gut microbiota on CRF. The results showed that the contents of serum creatinine （Scr）， blood urea nitrogen （BUN）， indole sulfate （IS） and p-cresol sulfate （PCS） of dogs in RT group decreased gradually and the abundance of gut microbiota increased， which showed significant difference with the group before test and UT group. The microflora structure also changed， presented as the abundance of Enterobacteriaceae， Pseudomonadaceae decreased gradually， while the beneficial bacteria such as Proteus， Lactobacillus， Butyricicoccus and Bifidobacterium gradually became the dominant microflora， which was different from UT group. The gut microbiota of RT group was active in metabolic pathways such as genetic information processing， nucleotide metabolism， cofactor and vitamin metabolism. The content of butyric acid in feces of the dogs from RT group increased， while the content of indole and H2S decreased gradually， which showed significant difference with the group before test and UT group. The change trend of these metabolites was consistent with the change trend of the productional flora. The result of fecal bacteria transplanting of the aseptic CRF mice showed that fecal bacteria from the RT group after experiment could significantly reduce the contents of Scr and BUN. In summary， emodin can restore the disarranged gut microbiota and change the levels of bacterial metabolites in CRF dogs， thus reduce the adverse effects of gut microbiota on CRF.

Key words：emodin;dog;chronic renal failure;gut microbiota;16S rRNA sequencing

近年來，犬的慢性腎衰竭（CRF）發(fā)病率逐年上升，治愈率低、成本高，對寵物診療業(yè)產(chǎn)生了嚴峻的挑戰(zhàn)。慢性腎衰竭與腸道菌群間關系密切，前者可以導致后者發(fā)生紊亂，后者紊亂又可加劇CRF的發(fā)展，最終惡化病情[1-2]。因此，腸道菌群是一個復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，增加有益菌豐度對動物健康至關重要[3-5]，調(diào)節(jié)腸道菌群有望成為治療犬慢性腎衰竭的新方式。

大黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[6]，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療多種疾病[7-9]。雖然有報道發(fā)現(xiàn)大黃素對CRF具有療效[10]，但是否與調(diào)節(jié)腸道菌群有關卻鮮有報道，而且也有研究結果表明大黃素對貓CRF無治療價值[11]。大黃素對犬CRF是否具有治療作用以及是否與調(diào)節(jié)腸道菌群有關，是一項值得研究的課題。因此，本試驗給CRF患犬口服大黃素后，觀察尿毒素指標和腸道菌群的動態(tài)變化，探討二者間的因果關系，從腸道菌群調(diào)控角度闡釋大黃素治療犬慢性腎衰竭的作用機制，為臨床應用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1病例資料

選取2017年7月至2019年7月期間，到江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物醫(yī)學院教學寵物醫(yī)院就診的診斷為慢性腎衰竭的患犬45例，按照納入標準剔除11例，剩余病例用于研究。研究納入標準為：①符合國際腎病研究協(xié)會（IRIS）犬貓慢性腎病診斷標準[12];②就診前1個月內(nèi)未使用抗生素、益生菌或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等;③未伴有其他疾病，如胃腸道疾病，尿路感染、急性腎炎、尿結石等泌尿道疾病，心臟病、糖尿病、肥胖癥等可導致腎功能障礙的疾病以及各種感染性疾病。所有研究病例的主人均對本研究計劃有詳細的了解，并簽署知情同意書。

1.2臨床治療試驗

按隨機數(shù)字表法將34例病例隨機分成大黃素治療組（RT組，n=22）和常規(guī)治療組（UT組，n=12）。UT組患犬治療方案為口服復方α-酮酸片（摩登狗生物科技有限公司產(chǎn)品，1片/次，2次/d）+自由采食腎臟處方糧（上海信元動物藥品有限公司生產(chǎn)），RT組在UT組治療的基礎上按100 mg/（kg·d）口服大黃素，自由飲食，治療期為45 d。并分別于治療前（0 d）與治療后15 d、30 d、45 d早晨，空腹采集血液，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、硫酸吲哚酚（IS）和硫酸對甲酚（PCS）含量。同時，經(jīng)無菌直腸采集糞便后平分成4份，分別用于短鏈脂肪酸（SCFA）含量檢測（氣相色譜/質譜法）、H2S含量檢測（亞甲基藍法）、吲哚含量檢測（分光光度計法）和腸道菌群16S rDNA測序。

1.3慢性腎衰竭無菌小鼠糞菌移植試驗

1.3.1糞菌液制備試驗前收集3例RT組患犬糞便并充分混勻，結束后再次收集相同病例糞便并充分混勻，UT組糞便收集方法同RT組。最終制成4種糞便樣本，分別為UT組試驗前（U-pre）和試驗后（U-post）、RT組試驗前（R-pre）和試驗后（R-post）。在無氧室中，分別取各個糞便樣本0.5 g，加入25 ml無菌Ringers緩沖液稀釋，充分攪勻后靜置5 min，然后將上清液轉移到干凈的試管中，并添加等量20%（質量體積比）無菌脫脂乳溶液，制成糞菌液。試驗當天制備新鮮糞菌液，其余的保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2慢性腎衰竭無菌小鼠糞菌移植將32只斷奶的無菌C57BL/6J雄性小鼠在12 h（日）/12 h（夜）光周期下飼養(yǎng)于柔性薄膜塑料隔離器中，喂食經(jīng)過消毒的正常食物與水，在糞菌移植前定期收集糞便、食物、水和填料等樣本進行細菌學檢查來監(jiān)測細菌污染情況。在7周齡時，隨機將小鼠等分為4組（每組單獨隔離），參考Michael等[13]的方法，第1周給各組小鼠按250 mg/kg體質量隔天灌服腺嘌呤，后3周按150 mg/kg體質量隔天灌服腺嘌呤。建模成功后，4組小鼠分別口服100 μl下列糞菌液：U-pre、U-post、R-pre和R-post，并于第2 d加強1次。分別于口服糞菌液前和口服后30 d，空腹收集各組小鼠血液用于Scr、BUN、IS和PCS的檢測，檢測方法同方法1.2，同時采集糞便進行16S rDNA測序。

1.4腸道菌群16S rDNA高通量測序

稱取無菌糞便樣100 mg，采用Qiagen DNA試劑盒按說明書提取總DNA。再以獲得的細菌DNA為模板進行細菌16S rDNA的V3、V4可變區(qū)PCR擴增，上游引物（F）序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物（R）序列為5′-GGACTGCACGGGTATCTAAT-3′。擴增程序為：95 ℃預變性 10 min，92 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，6個循環(huán);92 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán);然后72 ℃擴展延伸10 min，4 ℃保存。采用生工生物工程（上海）股份有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對所得PCR產(chǎn)物進行純化后，用NEB Next UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫構建， 使用Illumina Miseq PE 300平臺進行Paired-end測序。

1.5生物信息學分析

將測序數(shù)據(jù)經(jīng)QIIME（version 1.9.1）進行去除接頭序列、低復雜度序列和低質量序列的處理，得到高通量原始堿基序列。用貝葉斯分類器將相似性大于97%的序列劃分為1個分類操作單元（OTU），與GreenGene數(shù)據(jù)庫進行比對，得到OTU注釋結果及豐度。OTU數(shù)量差異用Kruskal-Wallis檢驗，將各樣本OTU豐度標準化后進行主成分分析（PCA）。通過LEfSe分析[14]組間差異菌群，并繪制聚類熱圖，運用PICRUSt軟件[15]預測菌群基因組功能，與京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）比對，獲得KEGG直系同源基因簇（KO）注釋信息及豐度，進而進行KEGG代謝通路的差異分析。

1.6數(shù)據(jù)處理

血液指標及糞代謝物數(shù)據(jù)結果用平均值±標準差表示， 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件方差分析（ANOVA）程序單因素方差分析進行組間比較，組內(nèi)比較采用重復測量資料方差分析，分類資料用Pearson卡方檢驗。腸道菌群數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果與分析

2.1研究對象的基本特征

本試驗所用犬CRF病例共有34例，其中RT組22例，UT組12例（表1）。與UT組比較，RT組Scr及BUN水平、性別構成、年齡分布、體質量情況、飼養(yǎng)方式和生活環(huán)境等均無顯著差異（P>0.05）。

2.2大黃素對CRF患犬腎功能的影響

由圖1可知：與0 d比較，RT組患犬的Scr、BUN含量呈降低趨勢，從15 d開始有顯著差異（P<0.05），30 d時差異極顯著（P<0.01），45 d時分別降低了48.39%、72.53%;與UT組比較，RT組患犬在15 d、30 d和45 d時的Scr、BUN含量顯著降低（P<0.05）。RT組患犬的IS、PCS含量從15 d開始極顯著低于0 d時的含量（P<0.01），45 d時達到了最低值（分別為5.26 μg/ml、11.98 μg/ml），并且低于UT組（P<0.05）。

2.3大黃素對CRF患犬腸道菌群的影響

研究發(fā)現(xiàn)，RT組患犬腸道菌群OTUs數(shù)量隨時間推移明顯升高，UT組患犬腸道菌群OTUs數(shù)量變化不大（圖2a）。PCA結果顯示，PCA1可解釋35.52%樣本差異，各樣本隨著試驗時間有沿PCA1軸右移的趨勢，試驗后RT組樣本主要集中于右側，與其他樣本的離散程度較高（圖2b）。在比較不同時間點OTUs的差異性時發(fā)現(xiàn)，與0 d比較，RT組15 d時患犬腸道菌群有106個OTUs下調(diào)，84個OTUs上調(diào)（圖2c）;30 d時有183個OTUs下調(diào)，137個OTUs上調(diào)（圖2d）;45 d時共有211個OTUs下調(diào)，158個OTUs上調(diào)（圖2e）。與UT組比較，RT組有74個OTUs下調(diào)，54個OTUs上調(diào)（圖2f）。

2.4CRF患犬腸道菌群的LEfSe差異分析

通過LESfe分析發(fā)現(xiàn)，RT組患犬腸道在0 d時富集的細菌主要有腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、埃希氏菌屬（Escherichia）和變形桿菌屬（Proteus）等;給予大黃素后45 d，優(yōu)勢菌群發(fā)生了顯著變化，乳桿菌科（Lactobacillaceae）、普氏桿菌屬（Prevotella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、丁酸梭菌屬（Butyricicoccus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等有益菌數(shù)量顯著增加，而瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）和優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）等則富集在UT組（圖3a）。將上述各差異菌群不同時期的豐度進行標準化后繪制了聚類熱圖（圖3b）?？梢钥闯?，RT組的患犬腸道菌群呈現(xiàn)動態(tài)變化過程，表現(xiàn)為原富集的菌群豐度逐漸降低，乳桿菌科等有益菌豐度逐漸升高。

2.5CRF患犬腸道菌群基因功能PICRUSt預測分析

PICRUSt分析結果（圖4）顯示，與0 d時（pre-RT）比較，45 d時RT組的患犬腸道菌群在遺傳信息處理過程中轉錄（Transcription）、翻譯（Translation）、折疊、分類和降解（Folding， sorting and degradation）、復制和修復（Replication and repair）等方面以及核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）與細胞運動（Cell motility）等代謝途徑方面較活躍，而在碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、糖生物合成和代謝（Glycan biosynthesis and metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）等方面參與度較低，與UT組比較也得到了相似的結果。

2.6大黃素對CRF患犬腸道菌群代謝產(chǎn)物的影響

RT組和UT組患犬糞便的乙酸含量在試驗過程中無顯著變化，但RT組的產(chǎn)乙酸菌群的比例卻從15 d開始顯著（P<0.05）高于0 d（圖5a、圖5e）;RT組丁酸含量和產(chǎn)丁酸菌群豐度在15 d、30 d及45 d時均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于0 d和UT組同時間點（圖5b、圖5f）。RT組患犬糞便吲哚含量（圖5c）、H2S含量（圖5d）均呈降低趨勢，15 d、30 d及45 d時均極顯著低于0 d（P<0.01）并顯著低于同期UT組（P<0.05）;RT組產(chǎn)吲哚菌群OTUs相對豐度逐漸降低，與0 d比較，15 d時有顯著差異（P<0.05），30 d、45d時有極顯著差異（P<0.01，圖5g），試驗15 d、30 d及45 d時產(chǎn)H2S菌群OTUs相對豐度也顯著低于0 d（P<0.05，圖5h）。

2.7CRF患犬糞菌移植對慢性腎衰竭無菌小鼠腎功能的影響

將RT組、UT組治療前與治療后的患犬腸道菌群分別移植給慢性腎衰竭無菌小鼠后發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的Scr、BUN含量均低于灌服糞菌液前，IS與PCS含量均高于灌服糞菌液前，R-Post組IS及PCS含量均低于其他3組（P<0.05或P<0.01，圖6a）。R-Post組Scr、BUN含量降低幅度較大，低于其他3組（P<0.05，圖6b、圖6c）。PCA結果顯示，各組小鼠樣本與供給糞菌液的犬樣本較為聚集，與其他犬樣本較為分散（圖6d），菌群結構也與糞菌液供體相似（圖6e）。

3討論

發(fā)生慢性腎衰竭時，由于腎小球濾過能力降低，導致肌酐、尿素氮等物質不能順利經(jīng)腎排泄而聚積于血液形成氮質血癥。本研究結果表明，大黃素可以降低CTF患犬的Scr和BUN含量，效果優(yōu)于常規(guī)治療組，證實了大黃素對犬CRF具有治療價值。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，16S rDNA測序技術已被廣泛用于腸道微生物的多樣性、物種組成及細菌基因功能預測等方面的定性與定量研究[16-19]。倫恒忠[20]通過16S rDNA測序技術研究了慢性腎病進展中腸道菌群的變化情況，尋找到慢性腎病腸道菌群的生物標記物（Biomarker）。Ye等[21]也利用16S rDNA測序技術找到了腎移植、慢性腎病與健康人的差異菌群。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以提高CRF犬腸道菌群的豐度，改變菌群結構，說明大黃素對CRF犬腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用;通過LEfSe和PICRUSt分析發(fā)現(xiàn)，給予大黃素后，乳桿菌科、普氏桿菌屬、乳桿菌屬、丁酸梭菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌數(shù)量顯著增加，菌群基因在遺傳信息處理過程、核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝等代謝途徑方面也較為活躍。進一步分析菌群結構與功能的關系，發(fā)現(xiàn)大黃素可以提高細菌代謝物丁酸的水平，且與產(chǎn)丁酸細菌豐度增加有關。而有研究結果表明，腸道菌群產(chǎn)丁酸能力降低，引起腸道黏膜通透性增加，導致代謝性內(nèi)毒素血癥和慢性炎癥，從而加劇CRF進展[22]。由此可以推測，產(chǎn)丁酸菌增加可能是大黃素作用機制之一。

IS和PCS是慢性腎臟病及其并發(fā)癥的獨立危險因素，與腎小球濾過率呈負相關[23]。IS可介導腎小管纖維化相關基因的表達，加速腎損傷，PCS是一種促氧化劑，可使腎的抗氧化能力降低，加重腎組織損傷。而這2種物質是某些腸道細菌的代謝產(chǎn)物，經(jīng)腸道吸收入血后由腎排泄。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大黃素后，患犬糞便中吲哚含量及產(chǎn)吲哚菌減少，血液中IS和PCS含量也隨之降低。慢性腎衰竭無菌小鼠糞菌移植前的Scr、BUN含量均高于移植后，說明腸道菌群對Scr、BUN含量有調(diào)節(jié)作用，但移植糞菌液后IS、PCS含量急劇升高，可能是由于可以產(chǎn)生吲哚等前體物的菌群增多有關，而給予大黃素后的糞菌液可明顯降低IS、PCS水平。研究結果也為大黃素通過選擇性調(diào)節(jié)腸道菌群改善犬CRF提供了有力證據(jù)。

由于樣本量較少，本研究僅從時間梯度研究了大黃素選擇性調(diào)節(jié)患犬腸道菌群作用的動態(tài)過程，未研究大黃素濃度梯度對患犬腸道菌群的影響，今后將進一步擴增樣本量，為本研究提供更多的數(shù)據(jù)資料。此外，由于16S rDNA測序技術對屬以上水平的測試精確度較高，而對細菌種水平的測試精確度較低，所以本研究未涉及細菌種水平的研究。

4結論

綜上所述，大黃素可以通過提高CRF患犬腸道中乳桿菌科、普氏桿菌屬、乳桿菌屬、丁酸梭菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌的豐度，降低腸桿菌科和假單胞菌科等細菌數(shù)量，從而使腸道菌群代謝物丁酸的含量升高，IS和PCS等有害物質含量降低，最終改善CRF癥狀。這種對菌群的調(diào)節(jié)作用，可為治療犬及其他動物的CRF提供一種新的生態(tài)途徑。

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（責任編輯：張震林）