李麗娟 馬貴平 夏文靜

摘要：纖維素酶在環(huán)保型燃料乙醇的生產(chǎn)、中藥成分提取、食品、飼料、釀酒、石油開采、環(huán)境保護等行業(yè)都具有一定的應用前景，但由于纖維素酶的生產(chǎn)成本較高、生物活力較低，使得纖維素酶的應用受到了局限。然而，固定化酶技術(shù)可以使酶重復利用，降低生產(chǎn)成本，克服這一技術(shù)瓶頸。研究了多壁碳納米管固定化纖維素酶的酶學性質(zhì)和重復使用性，并與游離酶的酶學性質(zhì)做比較。結(jié)果表明，固定化纖維素酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為3.0，60 ℃放置120 min仍保持70%以上的原酶活力;通過動力學模型研究發(fā)現(xiàn)，固定化酶的米氏常數(shù)（Km）值為0.588 mmol/L，較游離酶稍有增加;固定化酶于4 ℃下放置1個月，酶活力仍保持原酶活力的68%以上;固定化酶用于連續(xù)水解羧甲基纖維素，經(jīng)過6輪重復使用，固定化酶活力仍保持50%以上。與游離酶相比，固定化纖維素酶具有更寬的溫度范圍，更好的熱穩(wěn)定性及耐酸堿性，良好的儲存穩(wěn)定性及重復利用性。

關(guān)鍵詞：碳納米管;固定化;纖維素酶;固定化酶;酶學性質(zhì);酶活力

中圖分類號： S188+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0275-04

碳納米管自1991年被發(fā)現(xiàn)以來，由于性質(zhì)獨特[1]吸引人們的關(guān)注。碳納米管是由石墨片卷曲而成的圓柱狀結(jié)構(gòu)，報道較多的有單壁碳納米管和多壁碳納米管[2]，單壁碳納米管僅由1層石墨片圍繞中心軸卷曲而成，而多壁碳納米管由許多石墨片圍繞中心軸卷取形成[3]。相比于單壁碳納米管，多壁碳納米管具有優(yōu)良的物理化學穩(wěn)定性，且價格低廉、容易獲得、毒性較低、研究應用較多[4-5]。

碳納米管固定化酶具有比表面積大、載酶量高、分散性好等特點[6-7]，并且碳納米管與酶長度相似尺寸，有利于二者相互反應[8]。此外，對碳納米管進行功能化，有利于改變碳納米管的疏水結(jié)構(gòu)，便于酶的結(jié)合，因此表面功能化后的碳納米管，可為酶提供更加合適的微環(huán)境[4]。目前，研究者主要通過共價交聯(lián)和非共價交聯(lián)2種方式固定化酶，共價交聯(lián)方式固定化酶與載體通過共價鍵進行結(jié)合，這種結(jié)合較為牢固，但酶的結(jié)構(gòu)容易受到破壞[9];非共價交聯(lián)方式主要通過π-π堆積作用力、疏水作用力、靜電作用力等方式與酶結(jié)合，結(jié)合力較弱，但對酶的結(jié)構(gòu)影響較小[10]。碳納米管固定化酶，易于從反應體系中分離，可重復使用，便于運送和儲存，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低，有利于工業(yè)化應用[11-13]。

微生物產(chǎn)纖維素酶活力較低，而且纖維素酶的生產(chǎn)技術(shù)較低，是限制纖維素酶在工業(yè)上大量使用的瓶頸之一[14]。本試驗通過多壁碳納米管非共價交聯(lián)方式固定化纖維素酶，研究了多壁碳納米管固定化纖維素酶的最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、動力學模型、儲存穩(wěn)定性、重復使用性等酶學性質(zhì)，為纖維素酶廣泛應用提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用綠色木霉纖維素酶，購自上海瑞永生物科技有限公司，10 U/mg。所用多壁碳納米管購自深圳納米港有限公司，外徑15～30 nm，長1.5 μm。

1.2 試驗時間及地點

于2017年12月至2019年6月在烏蘭察布醫(yī)學高等專科學校生物化學實驗室進行試驗。

1.3 多壁碳納米管的功能化

將0.1 g的碳納米管和100 mL硝酸和硫酸的混酸溶液（體積比為1 ∶ 3），放入容積為200 mL的三角瓶中，之后將其放入超聲波清洗器中于40 ℃、40 kHz超聲4 h，待充分冷卻使碳納米管沉淀后，去上清，用蒸餾水對沉淀進行分散。通過4 000 r/min離心去上清，反復操作6～7次，直至pH值接近中性為止，于80 ℃真空干燥48 h，冷卻干燥24 h，獲得功能化的多壁碳納米管[15]。

1.4 多壁碳納米管固定化纖維素酶

將20 mg的纖維素酶加入到5 mL pH值為5.0的50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，再加入 4 mg 的碳納米管，將上述溶液在水浴箱中40 ℃、200 r/min孵化3 h，3 800 r/min離心12 min后，小心移去上清液，重新分散到檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中清洗復合物，重復上述步驟至少4次，移去未結(jié)合的酶，將復合物在空氣中干燥24 h獲得多壁碳納米管纖維素酶固定化酶[16]。

1.5 纖維素酶活的測定

以羧甲基纖維素（CMC）為底物，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定[17]。吸取pH值為4.8的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液1.0 mL和1% CMC 0.5 mL，加入到25 mL試管中，并加入0.5 mL適當稀釋的酶液，在50 ℃水浴箱中反應30 min，然后加入3 mL的DNS煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水定容至25 mL，混勻后在540 nm下比色測定。空白對照以0.5 mL蒸餾水代替酶液。 固定化纖維素酶活力的測定，是將游離酶活力測定中的 0.5 mL 適當稀釋的酶液用0.5 mL蒸餾水和一定質(zhì)量的固定化酶來代替，其余步驟與游離酶酶活力的測定相同。

1.6 溫度對纖維素酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別置于30、40、50 、60、70 ℃的水浴箱中，15 min后取出，待冷卻到室溫進行酶活力測定，以溫度為橫坐標、相對酶活力為縱坐標作圖。

1.7 纖維素酶的熱穩(wěn)定性研究

將固定化酶和游離酶分別置于60 ℃的恒溫水浴箱中，每隔5 min取樣，待其冷卻至室溫測定酶活力。初始酶活力為100%，計算酶活力隨時間延長而變化的趨勢，以時間為橫坐標、相對酶活力為縱坐標作圖。

1.8 pH值對纖維素酶活力的影響

將固定化酶和游離酶分別加入pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，于40 ℃水浴15 min后取出，以pH值為橫坐標、相對酶活力為縱坐標作圖。

參考文獻：

[1]Huang J L，Tsai Y C.Direct electrochemistry and biosensing of hydrogen peroxide of horseradish peroxidase immobilized at multiwalled carbon nanotube/alumina-coated silica nanocomposite modified glassy carbon electrode[J]. Sensors and Actuators B，2009，140（1）：267-272.

[2]Zhang C D，Luo S M，Chen W. Activity of catalase adsorbed to carbon nanotubes：effects of carbon nanotube surface properties[J]. Talanta，2013，13：142-147.

[3]Feng W，Ji P J. Enzymes immobilized on carbon nanotubes[J]. Biotechnology Advances，2011，29（6）：889-895.

[4]Rastian Z，Khodadadi A，Vahabzadehc F，et al. Facile surface functionalization of multiwalled carbon nanotubes bysoft dielectric barrier discharge plasma：generate compatibleinterface for lipase immobilization[J]. Biochemical Engineering Journal，2014，90：16-26.

[5]Yoon-Mee L，Kwon O Y，Yeo-Joon Y，et al. Immobilization of horseradish peroxidase on multi-wall carbon nanotubes and its electrochemical properties[J]. Biotechnology Letters，2006，28：39-43.

[6]Apetrei I，Apetrei C.The biocomposite screen-printed biosensor based on immobilization of tyrosinase onto the carboxyl functionalised carbon nanotube for assaying tyramine in fish products[J]. Journal of Food Engineering，2015，149：1-8.

[7]Pang R，Li M Z，Zhang C D. Degradation of phenolic compounds by laccase immobilized on carbon nanomaterials：diffusional limitation investigation[J]. Talanta，2015，113：38-45.

[8]Janegitz B C，Pauliukaite R，Ghica M E，et al. Direct electron transfer of glucose oxidase at glassy carbon electrode modified with functionalized carbon nanotubes within a dihexadecylphosphate film[J]. Sensors and Actuators B，2011，158（1）：411- 417.

[9]Karimi M，Chaudhury I，Cheng J H，et al. Immobilization of endo-inulinase on non-porous amino functionalized silica nanoparticles[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2014，104：48-55.

[10]Matsuura Koji，Saito Takeshi，Okazaki Toshiya，et al. Selectivity of water-soluble proteins in single-walled carbon nanotube dispersions[J]. Chemical Physics Letters，2006，429 （4/5/6）：497-502.

[11]Nurroyaila M，Noraziah B，Najarafat M，et al. A facile enzymatic synthesis of geranyl propionate by physically adsorbed Candida rugosa lipase onto multi-walled carbon[J]. Enzyme and Microbial Technology，2015，72：49-55.

[12]Ansari S A，Husain Q. Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials：a review[J]. Biotechnology Advances，2012，30（3）：512-523.

[13]萬曉梅，張 川，余定華，等. 碳納米管固定化酶[J]. 化學進展，2015，27（9）：1251-1259.

[14]劉曉晶，李 田，霍增強. 纖維素酶的研究現(xiàn)狀及應用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（4）：1920-1924.

[15]Wang L，Wei L，Chen Y，et al. Specific and reversible immobilization of NADH oxidase on functionalized carbon nanotubes[J]. Journal of Biotechnology，2010，150（1）：57-63.

[16]Zhou H，Qu Y Y，Kong C L，et al. Catalytic performance and molecular dynamic simulation of immobilized C—C bond hydrolase based on carbon nanotube matrix[J]. Colloids and SurfacesB：Biointerfaces，2014，116：365-371.

[17]周 振. 木聚糖酶強化纖維素酶對植物纖維的水解[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2018.

[18]張義芹，王 正，唐愛星，等. 功能化碳納米管固定化脂肪酶的制備及其合成生物柴油研究[J]. 可再生能源，2016，34（9）：1411-1416.

[19]Liu X H，Bu C H，Nan Z H，et al. Enzymes immobilized on amine-terminated ionic liquid-functionalized carbon nanotube for hydrogen peroxide determination[J]. Talanta，2013，105：63-68.

[20]Boncel S，Aurelia Z，Szymańskab K，et al. Alkaline lipase from Pseudomonas fluorescens non-covalently immobilised on pristine versus oxidised multi-wall carbon nanotubes as efficient and recyclable catalytic systems in the synthesis of solketal esters [J]. Enzyme and Microbial Technology，2013，53（4）：263-270.

[21]程 龍. 辣巧過氧化物酶在多壁碳納米管/堇青石復合載體上的固定化及含油污水處理[D]. 北京：北京化工大學，2015.

[22]Hasegawa F，Inoue H，Yano S，et al.Evaluation of reusable cellulase activity in the residue of enzymatic hydrolysis[C]//ETA-Florence Renewable Energies. Abstracts of the 20th European Conference and Exhibition，2012.

[23]Madanl V，Minoo N，Colinj B，et al.Enzyme immobilisation on amion-functionalised muti-walled carbbon naontubes：structural and biocatalytic characterisation[J]. PLoS One，2013，10：1371-1382. 陳帥行，馬浩天，于 杰，等. 基于Fenton氧化法預處理高氨氮廢水培養(yǎng)斜生柵藻[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（23）：279-285.