薛金燕 吳雋香 劉益勇 徐照璨 趙恩鵬 張杰 成玉富 楊旭

摘要：以L106、L108、L51、L171、L81為母本，赤茄（Solanum integrifolium Pro.）為父本，采用重復(fù)授粉、花柱短截及混合授粉3種授粉方式進行雜交，利用熒光顯微鏡觀察授粉后花粉管生長動態(tài);利用田間表型鑒定及SSR分子標(biāo)記鑒定，鑒定雜交種，以結(jié)果率、種子數(shù)及種子發(fā)芽率為判斷指標(biāo)研究不同雜交組合的親和性及授粉方式的可行性。結(jié)果表明，雜交組合親和性越高，花粉管生長越好;授粉后48 h花粉管基本進入子房的品種具有雜交結(jié)果能力;在5個雜交組合中，L81與赤茄雜交親和性最高，結(jié)果率為63.33%，種子發(fā)芽率為94.54%，其他雜交組合種子不能發(fā)芽;3種授粉方式中，重復(fù)授粉處理后雜交結(jié)果率及種子發(fā)芽率最高，花柱短截及混合授粉不能提高其坐果率及發(fā)芽率;雜交獲得了L81與赤茄的雜交植株，田間表型偏向父本性狀;篩選的17對SSR引物中，Q17能夠作為特異性引物鑒定雜交種，結(jié)果表明雜交植株為L81×赤茄的雜交種。

關(guān)鍵詞：栽培茄;赤茄;雜交;花粉管生長;SSR分子鑒定

中圖分類號：S641.103.6 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0140-06

茄子（Solanum melongena L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，具有很高的食用價值及藥用價值，具有豐富的茄堿、維生素P、花青素等物質(zhì)[1]。隨著集約化生產(chǎn)及設(shè)施栽培的不斷推廣，在茄子生產(chǎn)栽培中連作障礙、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，因此開發(fā)抗性強的茄子新品種，是解決這些生產(chǎn)問題的關(guān)鍵。雜交是新品種創(chuàng)制常用手段，雜交可將不同親本中的基因進行重組，人工篩選符合育種目標(biāo)的材料。

赤茄（Solanum integrifolium Pro.）中具有抵抗青枯病[2]、褐紋病[3]、枯萎病[4]、根結(jié)線蟲[5]、低溫[6]等生物脅迫及非生物脅迫的基因。通過赤茄及栽培茄之間的雜交可以將赤茄中優(yōu)良的抗性基因轉(zhuǎn)移到栽培茄中，豐富栽培茄的遺傳多樣性，為育種工作創(chuàng)造新的優(yōu)良種質(zhì)資源。

赤茄與栽培茄雜交存在生殖隔離，在前人的研究中，赤茄與栽培茄雜交后結(jié)果率低，種子數(shù)少，其F1代沒有育性[7]。為解決生殖隔離，雜交種的培育技術(shù)在不斷地發(fā)展完善，Iwamoto等通過細(xì)胞融合獲得了四倍體雜交種[8-11];Verba等利用雜交及胚拯救獲得了雜交種[12]。

此外，通過不同的雜交技術(shù)處理可以提高遠(yuǎn)緣雜交的成功率，景士西提出在同一母本花的花蕾期、開放期、即將凋謝期進行多次重復(fù)授粉，可以提高受精結(jié)實率[13];李潤根利用花柱短截提高了百合種間雜交坐果率[14];劉青林利用無活力的花粉作為蒙導(dǎo)花粉，摻入有活力的花粉進行雜交，發(fā)現(xiàn)花粉蒙導(dǎo)提高了雜交結(jié)實率[15]。本研究通過5種栽培茄作母本與赤茄進行雜交，運用不同的雜交方式，比較不同雜交方式對赤茄與栽培茄雜交親和性的影響;得到的雜交植株通過田間表型鑒定及SSR分子標(biāo)記鑒定進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試母本5種栽培茄與父本赤茄均由揚州大學(xué)園藝植物保護學(xué)院課題組收集純化而來，于2019年春季栽植于揚州大學(xué)試驗苗圃基地（118.19°E、33.916°N）（表1）。

1.2 雜交方法

以5份栽培茄為母本、赤茄為父本進行雜交試驗。開花前1 d去雄，并進行綁線處理，開花當(dāng)天 08：00—10：00進行授粉，授粉前柱頭涂抹453 mg/L槲皮素溶液，用鑷子挑取剛采下的花藥中的花粉進行授粉。授粉后20 d統(tǒng)計結(jié)果率，授粉后70 d統(tǒng)計種子數(shù)。

不同授粉處理方式：重復(fù)授粉（連續(xù)授粉3 d）、花粉管短截（第1天正常授粉，第2、3天每天截去1/2柱頭后授粉）、混合授粉（將失活的母本花粉與正常的赤茄花粉1 ∶ 1混合后進行授粉，連續(xù) 3 d）。授粉前均先使用453 mg/L槲皮素溶液涂抹柱頭。

1.3 花粉管生長觀察

摘取一次授粉后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、96 h 的花，快速放入卡諾氏固定液（95%乙醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1（V/V））固定12 h，于4 ℃冰箱保存過夜后放入320 g/L NaOH溶液中軟化1 h 后用蒸餾水重洗干凈，隨后放入0.1%苯胺藍(lán)磷酸溶液（pH值為8.5）中染色12 h，甘油壓片，用Olympus熒光顯微鏡紫外觀察并拍照。

1.4 雜種真實性鑒定

1.4.1 田間表型鑒定 參照李錫香等《茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[16]，對雜種植株與其父母本的葉色、葉刺、花、果實等田間表型進行對比，確定雜交植株的真實性。

1.4.2 SSR分子鑒定 茄子全基因組DNA采用北京全式金植物基因組DNA抽提試劑盒進行提取，具體步驟參照說明書。所提DNA檢測采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法。在前期研究的基礎(chǔ)上選取17對引物進行SSR分子鑒定，引物序列見表2。SSR反應(yīng)體系參照楊旭等的方法[17]，采用10 μL反應(yīng)體系：6.7 μL ddH2O+1.0 μL 10×Buffer+1.0 μL DNA模板+1.0 μL 引物+0.2 μL dNTPs+0.1 μL rTaq聚合酶。擴增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min;95 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。取擴增后產(chǎn)物2 μL和0.4 μL 6×Loading Buffer混合點樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，進行電泳檢測，以DL700 DNA Maker為對照。電泳條件：150 V恒壓1.5 h。使用銀染法進行膠片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交組合花粉管生長狀態(tài)

由圖1、 圖2可知， 5個雜交組合雜交后其花粉管生長狀態(tài)不同，除L108外，其他4個品種的柱頭授粉后，在4 h 時能看到明顯的花粉附著，8 h 時萌發(fā)出花粉管扎入花柱，48 h 時基本到達(dá)花柱基部進入子房，96 h 時全部到達(dá)子房。L108柱頭授粉后在8 h 時發(fā)現(xiàn)花粉附著，但全程未有扎入花柱的花粉管。L106、L51、L171及L81花柱授粉后，花粉管生長速度不同，L81花柱中花粉管生長速度最快，L106次之，L51最慢，花粉在花柱中的生長速度與雜交組合雜交親和性分析一致。由此可見，花粉管在花柱中的發(fā)育狀態(tài)是判斷雜交組合親和性的指標(biāo)之一。

2.2 不同授粉方式下雜交親和性

由表3可知，不同雜交組合親和性不同，L81×C雜交結(jié)果率最高，為63.33%，獲得的165粒種子中94.54%能正常發(fā)芽，因此L81×C雜交親和性最高;L106×C雜交結(jié)果率較高，為26.67%，獲得的27粒種子不能正常發(fā)芽;L51×C雜交結(jié)果率為13.33%，僅獲得7粒種子且不能正常發(fā)芽;L171×C結(jié)果率為6.67%，但獲得29粒種子，種子不能正常發(fā)芽;L108×C雜交親和性最低，沒有獲得果實。由此可見，栽培茄與赤茄雜交可能存在2個階段的雜交障礙，第1階段為受精階段，此階段的受精效果決定最終的雜交結(jié)果率;第2階段為胚胎發(fā)育階段，此階段胚胎發(fā)育的效果決定了雜交的結(jié)子數(shù)及發(fā)芽率?；蛐褪菦Q定雜交成功率的決定因素。

由表4可知，花柱短截不能提高雜交的親和性，其雜交結(jié)果率最低，為18.00%，結(jié)籽數(shù)為67粒，種子發(fā)芽率僅為40.30%;混合授粉與重復(fù)授粉結(jié)果率一致，但混合授粉后種子數(shù)比重復(fù)授粉少49粒，發(fā)芽率降低1.57百分點。由此可見，3個雜交處理方式中，重復(fù)授粉為最適宜栽培茄與赤茄的雜交處理方式，混合授粉的效果低于重復(fù)授粉，可能由于混合授粉降低了赤茄花粉濃度，花柱短截效果不佳，可能由于花柱短截對柱頭造成傷害，導(dǎo)致花柱產(chǎn)生抵抗物質(zhì)，降低了授粉效率。

由表5可知，不同授粉處理方式對同一雜交組合的作用效果不同。在L106×C中，重復(fù)授粉作用效果最好，授粉后雜交結(jié)果率及結(jié)籽數(shù)均為3種處理方式中最高，結(jié)果率為33.33%，獲得16粒種子;混合授粉后結(jié)果率較重復(fù)授粉后結(jié)果率下降6.66百分點，未獲得種子;花柱短截后較重復(fù)授粉后結(jié)果率下降13.33百分點，獲得種子數(shù)少5粒;此雜交組合未能獲得可育種子。在L108×C中，3種授粉處理方式均不能正常結(jié)果。在L51×C中，花柱短截后結(jié)果率最高，為30.00%，比重復(fù)授粉后高26.67百分點;花柱短截后此雜交組合結(jié)果率比混合授粉后高23.33百分點，混合授粉后獲得7粒種子，但種子不能發(fā)芽。在L171×C中，混合授粉后雜交結(jié)果率最高，為16.67%，但未獲得種子，雜交結(jié)果率比花柱短截高13.34百分點，花柱短截后獲得了29粒種子，但種子未能發(fā)芽;重復(fù)授粉后未能結(jié)果。在L81×C中，重復(fù)授粉作用效果最好，授粉后結(jié)果率為66.67%，獲得84粒種子，種子發(fā)芽率為95.24%;混合授粉后結(jié)果率、種子數(shù)及種子發(fā)芽率均下降，結(jié)果率下降13.34百分點，獲得種子數(shù)下降40粒，種子發(fā)芽率下降4.34百分點;花柱短截后結(jié)果率及種子數(shù)均為3種授粉處理方式下最低，結(jié)果率為36.67%、種子數(shù)為27粒，但種子發(fā)芽率為100.00%。

相同授粉處理方式對不同雜交組合的作用效果不同。使用重復(fù)授粉后，L81×C雜交結(jié)果率、種子數(shù)及發(fā)芽率均最高;L106×C雜交后結(jié)果率、結(jié)籽數(shù)次之;L51×C雜交后能夠結(jié)果，但結(jié)果率低，授粉后只獲得1個果實，未獲得種子;L108×C、L171×C雜交后沒有結(jié)果。使用花柱短截后，L81×C雜交結(jié)果率為36.67%，獲得27?？捎N子;L51×C雜交結(jié)果率為30.00%，但未獲得種子;L106×C雜交結(jié)果率為20.00%，卻獲得11粒種子;L171×C結(jié)果率為3.33%，但獲得29粒種子，為5種雜交組合中最多，種子未能發(fā)芽。使用混合授粉方式下，L81×C雜交結(jié)果率最高，為53.33%，獲得的44粒種子中90.90%可育;L106×C及L171×C雜交結(jié)果率次之，結(jié)果率分別為26.67%、16.67%，但未能獲得種子;L51雜交結(jié)果率為6.67%，但獲得7粒形態(tài)完整的種子，種子未能發(fā)芽。

綜上所述，基因型為影響栽培茄與赤茄雜交親和性的重要因素，改變授粉處理方式不能克服不親和組合的雜交障礙，僅能在某種程度上改變較親和組合的結(jié)果率及種子獲得數(shù)。

2.3 雜交植株鑒定

2.3.1 田間表型鑒定 將L81×C獲得的F1與其父母本進行田間表型對比，結(jié)果表明：F1植株田間表型具有雙親特征，葉面積大于父母本，葉色、葉脈色、葉刺、花冠色、花序及商品果色偏向父本赤茄，花瓣色及果形為中間值，該雜交組合能夠正常結(jié)果，但未獲得種子。根據(jù)田間表型鑒定該雜交植株為L81×C的雜交種（表6、圖3）。

2.3.2 SSR分子鑒定 為檢測獲得的L81×C雜交植株的真實性，選取17對隨機引物對獲得的3株雜種幼苗進行PCR擴增。根據(jù)凝膠電泳銀染結(jié)果，能夠?qū)﹄s交種真實性鑒定的引物是Q17，Q17在L81及赤茄中存在特異性。圖4為引物Q17對雙親、F1雜種植株擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物電泳銀染檢測結(jié)果，可以看出，F(xiàn)1植株繼承了赤茄的特征譜帶，L81植株在該引物下未產(chǎn)生條帶，說明再生植株不是由栽培茄自交產(chǎn)生，為L81×C的雜交種，由此可知，本試驗所鑒定的雜種植株為L81×C雜交種。

3 結(jié)論與討論

雜交能夠?qū)⒊嗲训目剐曰蜣D(zhuǎn)移至栽培茄中，豐富栽培茄的遺傳多樣性，為茄子育種提供重要的研究材料。當(dāng)使用栽培茄作父本、野生茄作母本時不能正常結(jié)果，而當(dāng)野生茄作父本時，能夠獲得正常果實[18]。本試驗以5種栽培茄作母本、赤茄作父本進行雜交親和性分析及雜交種鑒定，研究結(jié)果如下：（1）基因型是影響雜交親和性的決定因素，需要篩選大量的雜交組合來創(chuàng)制遠(yuǎn)緣雜交種，此結(jié)果與ürük等的結(jié)論[19-20]一致。（2）授粉后，父本花粉在L81、L51、L106及L171 4個栽培種柱頭上萌發(fā)良好，伸長速度快，48 h基本進入子房，在L108栽培種柱頭上無法萌發(fā)。此現(xiàn)象可能是由于不親和品種母本柱頭抑制類分泌物的產(chǎn)生阻止了花粉管的萌發(fā)[21]。（3）3種雜交處理方式的作用效果為重復(fù)授粉>混合授粉>花柱短截，此結(jié)果與賀丹等的研究結(jié)果[22]一致。但是也有人認(rèn)為，花柱短截能夠提高雜交的親和性[14，21]，造成結(jié)果差異的原因可能是基因型差異。（4）獲得了L81與赤茄的雜交植株，其余雜交植株沒有獲得可育種子，此結(jié)果與Devi等的研究結(jié)果[7]一致，其獲得的雜交果實也沒有可育種子，而Verba等則獲得了未發(fā)育完全的種子，通過胚挽救獲得了雜交種植株[12]。（5）雜交種進行田間表型鑒定及SSR分子鑒定結(jié)果表明，L81與赤茄的雜種田間表型偏向父本赤茄，主要表現(xiàn)在葉色、葉脈色、葉刺、花冠色、花序、商品果色上;在花色、果形上表現(xiàn)出中間特征，此結(jié)果可能與野生茄中的性狀多由顯性基因控制有關(guān)，與柳李旺等在茄子遠(yuǎn)緣雜交研究中獲得的結(jié)論[23-24]相似。從17對引物中篩選出Q17，Q17在赤茄與L81上具有特異性，并且通過鑒定證實所得雜交種為赤茄與L81雜交種。

參考文獻(xiàn)：

[1]San José R，Sánchez-Mata M C，Cámara M，et al. Eggplant fruit composition as affected by the cultivation environment and genetic constitution[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94（13）：2774-2784.

[2]趙曾菁. 茄子砧木種質(zhì)資源對青枯病的抗性及雄性不育特性的研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2016.

[3]謝艷華，蘇志強，曹學(xué)文. 不同砧木嫁接對茄子生長及抗褐紋病的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（15）：29-32.

[4]吳麗艷，郭志祥，曾 莉，等. 云南野生茄資源黃萎病苗期人工接種抗性鑒定分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2017，18（6）：1046-1054.

[5]徐小明，于 芹，徐 坤，等. 南方根結(jié)線蟲侵染對茄子砧木幼苗根系活性氧代謝及相關(guān)酶活性的影響[J]. 園藝學(xué)報，2008，35（12）：1767-1772.

[6]張曉艷，徐 坤. 低溫弱光條件下砧穗互作對茄子嫁接苗抗冷性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（10）：3734-3740.

[7]Devi C P，Munshi A D，Behera T K，et al. Cross compatibility in interspecific hybridization of eggplant，Solanum melongena，with its wild relatives[J]. Scientia Horticulturae，2015，193：353-358.

[8]Iwamoto Y，Hirai M，Ohmido N，et al. Fertile somatic hybrids between Solanum integrifolium and S. sanitwongsei （syn. S. kurzii） as candidates for bacterial wilt-resistant rootstock of eggplant[J]. Plant Biotechnology，2007，24（2）：179-184.

[9]Rotino G L，Sihachakr D，Rizza F，et al. Current status in production and utilization of dihaploids from somatic hybrids between eggplant （Solanum melongena L.） and its wild relatives[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2005，27（4）：723-733.

[10]Tamura N，Murata Y，Mukaihara T. A somatic hybrid between Solanum integrifolium and Solanum violaceum that is resistant to bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum[J]. Plant Cell Reports，2002，21（4）：353-358.

[11]Isshiki S，Okubo H，F(xiàn)ujieda K. Segregation of isozymes in selfed progenies of a synthetic amphidiploid between Solanum integrifolium and S.melongena[J]. Euphytica，2000，112（1）：9-14.

[12]Verba V M，Mamedov M I，Pyshnaya O N，et al. Isolation of eggplant interspecific hybrids by the method of embryo culture [J]. Sel skokhozyaistvennaya Biologiya[Agricultural Biology]，2010（5）：66-71.

[13]景士西. 園藝植物育種學(xué)總論[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[14]李潤根. 不同授粉方式對食用百合種間雜交結(jié)實的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（21）：140-142.

[15]劉青林. 梅花遠(yuǎn)緣雜交與雜種無性系的研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，1996：1-5.

[16]李錫香，朱德蔚. 茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[17]楊 旭，劉 飛，霍秋月，等. SSR分子標(biāo)記鑒定栽培茄與野生茄雜種F1研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017，48（10）：20-27.

[18]Rattan P，Kumar S，Salgotra R K，et al. Development of interspecific F1 hybrids （Solanum melongena×Solanum khasianum） in eggplant through embryo rescue technique[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，120（1）：379-386.

[19]ürük S，Dayan A. Production of diploid and amphidiploid interspecific hybrids of eggplant and Solanum torvum，and pollen fertility[J]. Journal of Animal & Plant Sciences，2018，28（5）：1485-1492.

[20]霍秋月. 茄子種間雜交及其F1代花藥培養(yǎng)[D]. 揚州：揚州大學(xué)，2017.

[21]郭玉潔，楊會娟，曹 宇，等. 山丹與幾種百合的雜交及花粉管生長熒光觀察[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（14）：116-120.

[22]賀 丹，張佼蕊，何松林，等. 授粉方式對牡丹和芍藥遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，48（3）：99-106.

[23]柳李旺，龔義琴，汪隆植，等. 栽培茄與紅茄種間雜交及其雜種的特性分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27（1）：6-10.

[24]謝文剛，張新全，陳永霞. 鴨茅雜交種的SSR分子標(biāo)記鑒定及其遺傳變異分析[J]. 草業(yè)學(xué)報，2010，19（2）：212-217.左李娜，王 容，劉 丹，等. 多頭切花菊瓶內(nèi)開花技術(shù)的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（23）：146-149.