許建蘭 馬瑞娟 俞明亮 張妤艷 丁輝

摘要：以早紅2號(hào)桃種胚為試材，研究不同赤霉素濃度和低溫處理時(shí)間對桃種胚萌發(fā)和植株生長的影響，并比較蓮座狀苗與正常苗體內(nèi)激素差異。結(jié)果表明，在同樣的低溫處理?xiàng)l件下，隨著赤霉素濃度的提高，子葉開張比例不斷增加。當(dāng)培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素濃度時(shí)，低溫培養(yǎng)30 d和60 d畸形苗即可消失;當(dāng)培養(yǎng)基中加入 0.5 mg/L 及以上赤霉素濃度時(shí)，低溫培養(yǎng)90 d畸形苗即可消失，且發(fā)現(xiàn)同樣條件下赤霉素濃度越高，畸形苗率越低。對種胚發(fā)芽后正常苗與蓮座狀苗進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)IAA含量正常苗高于蓮座狀苗，GA和ZA含量則相反。綜上，在早紅2號(hào)種胚處理時(shí)加入適量的赤霉素可減少蓮座狀苗的比例，進(jìn)而提高胚培種子成苗率，對提高早熟桃種子育苗效率具有重要意義。

關(guān)鍵詞：桃;低溫時(shí)間;激素;赤霉素;種胚;植株生長

中圖分類號(hào)： S662.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0121-03

目前桃新品種選育主要通過常規(guī)雜交授粉進(jìn)行，通常果實(shí)生育期100 d以內(nèi)的桃，生長時(shí)間短，種子在常規(guī)處理?xiàng)l件下不能萌發(fā)或萌發(fā)率極低，即使長成實(shí)生苗，早期生長也比較弱小[1-2]。因此需接種在培養(yǎng)基中，經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)后才能萌發(fā)成苗。種子休眠是高等植物的普遍現(xiàn)象，在生產(chǎn)上，桃種子需要經(jīng)過一段時(shí)間低溫處理才能正常生長，若休眠未能及時(shí)解除，往往出現(xiàn)發(fā)芽率低甚至隔年發(fā)芽的現(xiàn)象[3]，有些即使發(fā)芽生長仍會(huì)出現(xiàn)不良狀況，嚴(yán)重影響正常育苗工作?？s短低溫處理時(shí)間、增加溫室過渡生長時(shí)間是一種提高實(shí)生苗壯實(shí)度的有效方法。但不經(jīng)過足夠低溫處理的胚發(fā)芽后葉片會(huì)長成蓮座狀，不能正常生長，嚴(yán)重的最終導(dǎo)致死亡。

有研究表明，赤霉素（GA3）是一種生長調(diào)節(jié)劑，在休眠方面已有大量報(bào)道[4-7]，但多集中于晚熟桃種子處理，而關(guān)于早熟胚打破休眠方面報(bào)道較少。劉艷萍[8]和孫紅梅[9]先后研究了低溫解除休眠的生理生化變化，表明休眠主要依靠GA3和ABA含量控制。高效液相色譜（HPLC）是常用的植物內(nèi)源激素分析方法，但HPLC存在流程繁瑣、費(fèi)時(shí)長、不能同時(shí)聯(lián)合測定等問題[10]。而液質(zhì)聯(lián)用（LS-MS）解決了HPLC的不足，在激素檢測中達(dá)到了很好的效果。為此，筆者在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，樣品一次處理，分時(shí)出峰，從而更方便快捷測定植株激素含量。

本試驗(yàn)通過探索不同赤霉素濃度對解除早熟桃種子休眠和促進(jìn)實(shí)生苗生長的影響，并比較正常苗與蓮座狀苗在激素水平上的差異，為后期種子處理、實(shí)生苗健壯生長提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年進(jìn)行，桃試驗(yàn)材料取自國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃，品種為早紅2號(hào)，果實(shí)生育期94 d。樹體生長健壯，株行距3 m×5 m，自然開心形，按常規(guī)栽培措施管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 果實(shí)近成熟時(shí)采收，經(jīng)70%乙醇和20%NaOCl溶液消毒，取出種仁接種到5種不同培養(yǎng)基中，對照，WPM;處理1～4為WPM培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的GA3（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），蔗糖20 g/L，瓊脂粉4.8 g/L，pH值5.7。每處理接種30個(gè)，3次重復(fù)。接種后分別置于4 ℃低溫環(huán)境中處理30、60、90 d，比較不同低溫處理時(shí)間對子葉張開比例、胚根生長的影響。后置于組培室（24 ℃）進(jìn)行光照培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)不同處理株高、葉片數(shù)、蓮座狀苗比例。

1.2.2 激素含量測定 分別取蓮座狀苗和正常苗新鮮植株，采用液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)（LC-MS）測定IAA、GA3、ZA等激素的含量。樣品制備時(shí)各稱取約0.5 g，于液氮研磨至粉碎，加入5 mL異丙醇/鹽酸提取緩沖液，4 ℃振蕩30 min，加入10 mL二氯甲烷，4 ℃振蕩30 min，于4 ℃、13 000 r/min離心 5 min，取下層有機(jī)相;避光以氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)相，以200 μL甲醇（0.1%甲酸）溶解，過0.45 μm濾膜，進(jìn)HPLC-MS/MS檢測。每處理10個(gè)植株，重復(fù)3次。液相條件：色譜柱采用安捷倫ZORBAXSB-C18反相色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相A ∶ B=（甲醇/0.1%甲酸） ∶ （水/0.1%甲酸），洗脫梯度：0～2 min，A=20%;2～14 min，A遞增至80%;14～15 min，A=80%;15.1 min，A遞減至20%;15.1～20 min，A=20%，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL;質(zhì)譜條件：氣簾氣：15 psi;噴霧電壓：4 500 V;霧化氣壓力：65 psi;輔助氣壓力：70 psi;霧化溫度400 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理時(shí)間對種胚生長的影響

從表1可以看出，在同樣的低溫處理?xiàng)l件下，隨著赤霉素濃度的提高，子葉開張比例不斷增加。在低溫處理30 d時(shí)，所有處理的子葉均未變化，保持閉合狀態(tài)，隨著低溫處理時(shí)間的延長，子葉不同程度開展，表明種胚即將發(fā)芽生長。低溫處理60 d時(shí)，以處理4子葉開張比例最高，為85.7%，與其他處理達(dá)顯著差異;胚根最長，為0.8 cm，與對照和處理1、處理2達(dá)顯著差異水平。低溫處理90 d時(shí)，處理3和處理4子葉全部張開，胚根長度分別為 1.6 cm 和1.5 cm，處理3和處理4差異不顯著，與其他處理達(dá)顯著差異水平。

2.2 不同赤霉素濃度下低溫處理30 d對試管苗生長的影響

從表2可以看出，低溫處理30 d后，處理2平均株高最高，為7.25 cm，與其他處理達(dá)顯著差異水平;平均葉片數(shù)以處理3最多，為10.27片，其次是處理4，為9.27片，處理3和處理4差異不顯著，與對照、處理1、處理2達(dá)顯著差異水平;以不加赤霉素的對照處理畸形苗率最高，為53.83%，與其他處理達(dá)顯著差異水平，其次是處理1畸形苗率，為21.33%，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素，在低溫培養(yǎng)30 d時(shí)畸形苗即可消失。

2.3 不同赤霉素濃度下低溫處理60 d對試管苗生長的影響

從表3可以看出，低溫處理60 d后，處理2平均株高最高，為7.38 cm，與其他處理達(dá)顯著差異水平;平均葉片數(shù)以處理2最多，為11.25片，其次是處理3，為11.17片，處理2和處理3差異不顯著，與對照、處理1、處理4達(dá)顯著差異水平;以不加赤霉素的對照畸形苗率最高，為30%，與其他處理達(dá)顯著差異水平，其次是處理1畸形苗率，為9.12%，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素，在低溫培養(yǎng)60 d時(shí)無畸形苗。

2.4 不同赤霉素濃度下低溫處理90 d對試管苗生長的影響

從表4可以看出， 低溫處理90 d后， 處理4平均株高最高，為5.16 cm，其次為處理3，平均株高4.87 cm，處理3和處理4與其他處理達(dá)顯著差異水平;平均葉片數(shù)以處理4最多，為11.60張，其次是處理3，為11.26張，與處理1、處理2差異顯著;以不加赤霉素的對照畸形苗率最高，為11.13%，與其他處理達(dá)顯著差異水平，比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L及以上赤霉素，在低溫培養(yǎng)90 d時(shí)無畸形苗。

2.5 正常苗與蓮座狀苗體內(nèi)激素含量差異

通過對正常苗與蓮座狀苗的比較，看出正常生長的苗IAA含量顯著高于蓮座狀苗，正常苗和蓮座狀苗IAA含量分別為5.98 ng/g和2.93 ng/g;而GA3和ZA含量以蓮座狀苗較高，正常苗和蓮座狀苗GA3含量分別為0.028 ng/g和0.116 ng/g，正常苗和蓮座狀苗ZA含量分別為0.05 ng/g和2.23 ng/g，且正常苗與蓮座狀苗間達(dá)顯著差異水平（表5）。

3 討論與結(jié)論

植物激素是指由植物細(xì)胞接受一定的信號(hào)誘導(dǎo)，在植物特定組織代謝合成的，并通過與特定的蛋白質(zhì)受體結(jié)合來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的微量生理活性有機(jī)物質(zhì)[11]。植物激素的研究也一直是植物科學(xué)熱點(diǎn)和前沿的領(lǐng)域之一，隨著科技的發(fā)展，植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控植物生長發(fā)育的重要作用越來越受人們重視。植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)和控制作物生長發(fā)育的方法，既能協(xié)調(diào)植株的生長發(fā)育又能協(xié)調(diào)植株與外界條件的關(guān)系[12]。赤霉素除可以打破種子休眠外，在促進(jìn)植株生長方面也具有一定作用[13]。

桃種子需要經(jīng)過一定的低溫層積才能正常發(fā)芽生長，低溫層積所需時(shí)間也因品種不同而存在差異[3]，而同一品種隨著層積時(shí)間的延長，蓮座狀苗比例明顯降低。本試驗(yàn)中早紅2號(hào)加入0.5 mg/L赤霉素低溫處理30、60、90 d，蓮座狀苗比例分別為21.35%、9.11%和0，與前人報(bào)道的隨層積時(shí)間越長，非正常苗比例越少的結(jié)論[14]一致。對照中不加赤霉素在低溫培養(yǎng)90 d時(shí)仍有一定比例的蓮座狀苗，而加入赤霉素的處理，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/L低溫培養(yǎng)90 d時(shí)均無畸形苗，說明培養(yǎng)基中加入赤霉素一定程度上刺激了種子發(fā)芽，有助于提高正常苗的比例。比較發(fā)現(xiàn)，不同處理中加入赤霉素苗的高度均高于對照，與前人報(bào)道的赤霉素可以促進(jìn)莖的伸長結(jié)果[12]一致。將正常苗與蓮座狀苗比較，發(fā)現(xiàn)正常苗IAA含量高于蓮座狀苗，可能是由于正常苗生長健壯，更有利于分泌生長素類物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)實(shí)生苗的生長。

本試驗(yàn)中早熟桃種子處理時(shí)加入一定量的赤霉素，有效減少了早紅2號(hào)蓮座狀苗的比例，進(jìn)而提高胚培種子成苗率，研究結(jié)果可為解除早熟桃種子休眠提供參考，對提高早熟桃種子育苗效率具有重要意義。

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