荊玲俠 卜朝陽 崔學強 狄清琳 盧家仕

摘要：為了確定素馨屬植物ISSR-PCR反應的最佳體系，以素馨屬植物葉片為材料，采用單因素試驗和正交試驗設計2種方法對影響素馨屬ISSR-PCR反應中的dNTPs 、Taq DNA聚合酶、引物、模板 DNA以及Mg2+ 5個因素進行4個水平的優(yōu)化試驗，通過試驗建立了素馨屬25 μL最佳反應體系：dNTPs濃度為0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度為0.7 μmol/L、模板 DNA用量為2.5 ng、Mg2+濃度為1.0 mmol/L。在最佳反應體系下，從100條ISSR引物中篩選出了8條ISSR引物，并確定了各引物的最佳退火溫度。利用29份素馨屬材料進行最佳反應體系的驗證，結(jié)果表明，該優(yōu)化體系擴增條帶清晰，穩(wěn)定性高，重復性好，表明該反應體系適用于素馨屬植物ISSR分子標記的研究。本研究可為素馨屬植物遺傳多樣性以及親緣關系等方面的研究提供參考依據(jù)。

關鍵詞：素馨屬;ISSR-PCR;單因素試驗;正交設計

中圖分類號： S684.01;S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0071-08

素馨屬（Jasminum）隸屬于木樨科（Oleaceae）素馨亞科（Jasminoideae），該屬植物枝葉繁茂，花形優(yōu)美，且多具芳香性，不乏觀賞價值較高的植物[1]。目前，素馨屬在我國有47種、1個亞種、4個變種，該屬植物主要包括多種素馨、毛茉莉和茉莉花[2-3]。

目前，有關素馨屬植物分子方面的研究仍然比較欠缺。劉忠等利用TRAP技術對采自廣西周邊地區(qū)的28份茉莉種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性研究，并利用聚類分析將這28份茉莉材料聚為5個類群[4]。邱長玉等從100個ISSR隨機引物中篩選出10個多態(tài)性引物對廣西橫縣境內(nèi)的30份茉莉花材料進行了研究[5]。此外，陳笛等利用RT-PCR和RACE技術對茉莉花萜類香氣物質(zhì)合成途徑中的關鍵酶進行擴增，以研究其在茉莉花開放過程中的表達情況[6-7]。胥愛麗等對扭肚藤進行了UPLC指紋圖譜的建立[8]?？傮w來說，素馨屬植物在分子方面的研究還不夠深入。

ISSR 標記技術結(jié)合了SSR和RAPD 2種標記技術的優(yōu)點，但其最關鍵的步驟是要針對不同的物種建立相應的PCR反應體系[9]。目前，ISSR分子標記已被廣泛應用于郁金香[10]以及荷花[11]等觀賞性園藝植物的品種鑒定以及遺傳多樣性分析中。ISSR技術是基于PCR的一種分子標記技術，其擴增結(jié)果易受dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA濃度等因子的影響[12]。本研究通過單因素試驗和正交試驗設計的方法來優(yōu)化 ISSR-PCR 反應中的各項因子，建立適用于素馨屬ISSR-PCR的最佳反應體系，為進一步開展素馨屬植物的親緣關系和遺傳多樣性分析等方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試素馨屬材料采自廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所資源圃。8條擴增條帶清晰、多態(tài)性好的引物均來自于哥倫比亞大學（University of British Columbia， UBC）公布的100條ISSR通用引物。這8條引物分別為807（AGAGAGAGAGAGAGAGT）、811（DAGAGAGAGAGAGAGAC）、822（TCTCTCTCTCTCTCTCA）、834（AGAGAGAGAGAGAGAGYT）、835（AGAGAGAGAGAGAGAGYC）、841（GAGAGAGAGAGAGAGAYC）、873（GACAGACAGACAGACAGACA）、881（GGGTGGGGTGGGGTG），均用于后續(xù)PCR反應體系的構(gòu)建。本研究所用引物由上海生物工程股份有限公司合成，所用試劑dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、Marker等均采自東盛生物科技有限公司，其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試材料DNA 提取與檢測 以供試材料的葉片為材料，使用天根植物快速DNA提取試劑盒法，對供試材料的葉片進行DNA提取。DNA提取后用1.00%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測提取的DNA質(zhì)量，后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR-PCR反應體系單因素篩選試驗 對ISSR-PCR反應體系中的dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+ 濃度5個因素進行試驗。在單因素試驗中，在對某一因素進行梯度優(yōu)化時，保持其他4個因素不變。20個處理（表1）的PCR反應體系的總體積均為25 μL，每個處理重復2次。PCR擴增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 4 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共計35個循環(huán); 最后 72 ℃ 10 min。 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 ISSR-PCR反應體系正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，對影響ISSR-PCR反應體系的dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+ 濃度進行進一步的細化處理。針對上述因素采用5因素4水平L16（45）的正交試驗設計（表2、表3）。試驗按照表3中的16個處理水平進行試驗，各個處理水平PCR反應體系的總體積均為25 μL，每個處理水平重復2次。PCR擴增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 4 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán);最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 引物及其退火溫度的篩選 本研究在已確定的最佳素馨屬ISSR-PCR反應體系的基礎上，對引物退火溫度進行篩選，以各引物的Tm值為中間溫度，使用溫度梯度PCR儀自動形成的12個溫度梯度來篩選不同引物的最佳退火溫度。

1.2.5 ISSR-PCR最佳體系的驗證 ISSR-PCR 反應體系及擴增程序的優(yōu)化結(jié)果應經(jīng)過不同供試材料的反復驗證以確定該擴增體系的可重復性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 dNTPs濃度對ISSR-PCR擴增體系的影響 根據(jù)需求本研究設置了4個dNTPs濃度梯度，分別為0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L，每個濃度梯度重復試驗2次，具體擴增結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在dNTPs濃度為0.10～0.15 mmol/L時，擴增條帶基本一致且清晰，并可以看出，在濃度為 0.10 mmol/L 時，擴增條帶最亮最清晰。在dNTPs濃度為0.20～0.25 mmol/L時，擴增條帶較暗且不完全。因此，在本研究ISSR-PCR擴增體系單因素篩選中dNTPs的最適濃度為0.10 mmol/L。

2.1.2 Taq DNA聚合酶用量對ISSR-PCR擴增體系的影響 根據(jù)需求本研究設置了4個Taq DNA聚合酶用量梯度，分別為1.0、1.5、2.0、2.5 U，每個用量梯度重復2次，具體擴增結(jié)果見圖2。其中，在Taq DNA聚合酶的用量為1.0 U時，沒有擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在Taq DNA聚合酶的用量為 1.5 U 時，擴增條帶較暗且不完全。在Taq DNA聚合酶的用量為2.0～2.5 U時，擴增條帶清晰且基本一致，擴增產(chǎn)物間沒有明顯差異。基于成本考慮，本研究ISSR-PCR擴增體系單因素篩選中Taq DNA聚合酶的最適用量為2.0 U。

2.1.3 引物濃度對ISSR-PCR擴增體系的影響 根據(jù)需求本研究設置了4個引物濃度梯度，分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，每個濃度梯度重復2次，具體擴增結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當引物濃度為0.2 μmol/L時，擴增條帶較暗且不完全。隨著引物濃度的增加，擴增條帶逐漸清晰，在引物濃度為0.8 μmol/L時，擴增條帶最為清晰。因此，本研究ISSR-PCR擴增體系單因素篩選中引物的最適濃度為0.8 μmol/L。

2.1.4 模板DNA用量對ISSR-PCR擴增體系的影響 根據(jù)需求本研究設置了4個用量梯度，分別為2.0、2.5、3.0、3.5 ng，每個用量梯度重復2次，具體擴增結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，當模板DNA用量在2.0～3.0 ng之間時，擴增條帶間沒有明顯差異。當模板DNA濃度為 3.5 ng 時，產(chǎn)生了非特異性擴增條帶。因此，本研究ISSR-PCR擴增體系單因素篩選中模板DNA用量的最適范圍為2.0～3.0 ng。

2.1.5 Mg2+濃度對ISSR-PCR擴增體系的影響 根據(jù)需求本研究設置了4個濃度梯度，分別為0.9、1.2、1.5、1.8 mmol/L，每個濃度梯度重復2次，具體擴增結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，當Mg2+濃度在0.9～1.2 mmol/L之間時，擴增條帶較暗且數(shù)量比較少。當Mg2+ 濃度為1.5 mmol/L時，擴增條帶比較清晰。當Mg2+濃度為1.8 mmol/L時，非特異性擴增數(shù)量增加。因此，本研究ISSR-PCR擴增體系單因素篩選中Mg2+ 濃度的最適濃度為1.5 mmol/L。

2.2 正交試驗設計瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)表3的16個處理組合，每個處理組合重復試驗2次，具體擴增結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，16個正交處理組合中的第8個處理組合為最佳處理組合。該處理組合比其他處理組合擴增條帶更加清晰，擴增數(shù)量也更加豐富。因此本研究中 25 μL 最佳素馨屬植物基因組ISSR-PCR擴增體系為dNTPs濃度0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度0.7 μmol/L、模板DNA用量2.5 ng、Mg2+ 濃度1.0 mmol/L。

2.3 正交試驗設計瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖直觀評分

根據(jù)圖6的電泳結(jié)果，根據(jù)擴增條帶的數(shù)量、強弱和清晰度采用直觀評分的方式對16個正交設計處理水平的電泳結(jié)果從高到低進行打分，條帶數(shù)量豐富、亮度和清晰度高的處理記為16分，相反，最差的記為1分[13]。針對16個正交處理水平的2次重復試驗的結(jié)果進行統(tǒng)計評分，評分的結(jié)果分別為9、10、15、7、3、9、14、15、7、10、2、9、4、6、12、11;10、9、15、6、3、10、13、16、8、9、1、8、3、6、11、11。

利用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對16個正交處理水平的2次重復結(jié)果的評分進行方差分析（表4）。從表4中可以看出，各因素水平的影響均達到了極顯著水平，且從大到小依次為Mg2+濃度>Taq DNA 聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA用量。

2.4 正交設計試驗因素內(nèi)各處理水平對PCR擴增結(jié)果的影響

由于各因素水平間的差異均達到了極顯著水平，所以需要進一步對各因素內(nèi)不同處理水平作多重比較分析。

2.4.1 dNTPs濃度對PCR擴增體系的影響 對dNTPs各處理水平梯度的多重比較分析結(jié)果表明，各處理水平梯度間均差異不顯著。從圖7可以看出，隨著dNTPs濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增大后降低再增大的趨勢。當dNTPs濃度在0.05～0.10 mmol/L時，反應結(jié)果均值隨著dNTPs濃度的增加而增大，在0.10 mmol/L時，達最大值;當dNTPs濃度繼續(xù)增加時，結(jié)果均值逐漸降低，在0.15 mmol/L時最小;隨著dNTPs濃度繼續(xù)的增加，結(jié)果均值繼續(xù)增大。因此，在25 μL反應體系中選擇0.10 mmol/L水平作為該研究PCR反應體系中dNTPs的最佳濃度。

2.4.2 Taq DNA聚合酶用量對PCR擴增體系的影響 對Taq DNA聚合酶用量各處理水平梯度的多重比較分析結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶用量梯度1.0 U與2.0 U和2.5 U之間差異顯著，P值均達到0.024，其他各處理水平梯度間差異不顯著。從圖8可以看出，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增大后降低再增大的趨勢。當Taq DNA聚合酶用量在1.0～1.5 U時，結(jié)果均值隨著Taq DNA聚合酶用量的增加而增大;當Taq DNA聚合酶用量繼續(xù)增加時，結(jié)果均值逐漸降低，在2.0 U時最小;隨著Taq DNA聚合酶用量的繼續(xù)增加，結(jié)果均值增大，在2.5 U時結(jié)果均值為最大。因此，在 25 μL 反應體系中選擇2.5 U水平作為該研究PCR反應體系中Taq DNA聚合酶的最佳用量。

2.4.3 引物濃度對PCR擴增體系的影響 通過對引物各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出各處理水平梯度間均差異不顯著。從圖9可以看出，隨著引物濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當引物濃度在0.3～0.7 μmol/L時，反應結(jié)果均值隨著引物濃度的增加而增大，在 0.7 μmol/L 時最大;當引物濃度繼續(xù)增加時，結(jié)果均值逐漸降低。因此，在25 μL反應體系中選擇0.7 μmol/L水平作為該研究PCR反應體系中引物的最佳濃度。

2.4.4 Mg2+濃度對PCR擴增體系的影響 通過對因素Mg2+ 各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出1.0、1.5、2.0 mmol/L水平間差異不顯著，三者均與2.5 mmol/L水平間呈現(xiàn)出差異顯著的關系。從圖10可以看出，隨著Mg2+ 濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。當Mg2+ 濃度在1.0 mmol/L時，反應結(jié)果均值最大。因此，在25 μL反應體系中選擇最大值1.0 mmol/L水平作為該研究PCR反應體系中Mg2+ 的最佳濃度。

2.4.5 模板DNA用量對PCR擴增體系的影響 通過對模板DNA各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出各處理水平梯度間差異均不顯著。從圖11可以看出，隨著DNA用量的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先降低后增加再降低的趨勢，但總體呈現(xiàn)比較平穩(wěn)的狀態(tài)，這一結(jié)論與謝運海等研究結(jié)果[14]類似。因此，在25 μL反應體系中選擇2.0～3.5 ng模板DNA用量均可。

2.5 引物及其退火溫度的篩選

引物的退火溫度是影響PCR擴增結(jié)果的一個重要因子。本研究利用已確定的最佳素馨屬 ISSR-PCR 反應體系，從100條ISSR引物中篩選出8條擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物。以引物的Tm值作為中間溫度，使用溫度梯度PCR儀自動形成的12個溫度梯度來篩選不同引物的最佳退火溫度，每個溫度梯度設置2個重復（圖12）。各引物的溫度梯度、Tm值和篩選后的最適溫度見表5。

2.6 優(yōu)化后ISSR-PCR反應體系穩(wěn)定性檢測

以29份素馨屬材料DNA為樣本，用引物822和引物807來檢測最佳PCR反應體系組合8（表3）穩(wěn)定性（圖13、圖14）。結(jié)果表明，該擴增體系是穩(wěn)定可靠的，適用于素馨屬植物基因組ISSR分子標記的擴增，可為素馨屬植物的進一步研究提供依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標記技術因具有高多態(tài)性、穩(wěn)定性、操作簡單和重復性好等優(yōu)點已被廣泛應用于許多物種的遺傳鑒定研究中。但由于物種或試驗條件的差異，PCR擴增結(jié)果也會存在一定程度的差異。本研究利用單因素試驗和正交試驗設計相結(jié)合的方法，針對影響ISSR-PCR反應體系的dNTPs濃度、Taq DNA 聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+濃度5個因素建立了適用于素馨屬植物的最佳ISSR-PCR反應體系（25 μL）：dNTPs濃度為0.10 mmol/L、Taq DNA 聚合酶用量為2.5 U、引物濃度為0.7 μmol/L、模板DNA含量為2.5 ng、Mg2+ 濃度為1.0 mmol/L。

通過對正交設計試驗瓊脂糖凝膠電泳圖的直觀評分，可知各因素對PCR擴增體系的影響程度從大到小依次為Mg2+ 濃度>Taq DNA 聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA用量，并且各因素對擴增結(jié)果的影響均達到了極顯著水平（P<0.01）。

研究發(fā)現(xiàn)，Taq DNA聚合酶的用量過多或者過少都不利于PCR擴增程序的進行。用量過少會導致PCR擴展產(chǎn)物不足，用量過多不僅易導致非特異性擴增產(chǎn)物的增加還會增加試驗成本[15]。本研究中Taq DNA聚合酶最適用量與王佳等的研究結(jié)果[16-17]一致，均為2.5 U。

dNTPs濃度過低影響擴增效率，濃度過高可能導致PCR錯配甚至產(chǎn)生非特異性擴增。本研究中確定dNTPs最適濃度為0.10 mmol/L，本研究dNTPs濃度與盧莉等的研究結(jié)果[18-19]是相近的。

引物濃度與DNA模板用量的結(jié)合緊密程度存在相關性。當模板DNA用量一定時，引物濃度過高，可能引起堿基間的錯配和非特異性擴增的產(chǎn)生，從而導致擴增產(chǎn)物產(chǎn)量的下降，并可能出現(xiàn)Smear現(xiàn)象[20]。本研究中確定引物最適濃度為 0.7 μmol/L。本研究結(jié)果與朱頂紅等物種研究中確定的最適引物濃度[21-22]相近。

DNA 模板質(zhì)量是確保ISSR-PCR順利有效擴增的重要因素之一。模板用量的最適范圍取決于所研究的物種和模板的純度。本研究確定模板用量是對PCR擴增結(jié)果影響最小的一個因素，并確定了DNA模板最適用量為2.5 ng。本結(jié)果與謝運海等的研究結(jié)果[14，23]存在一致性。

Mg2+ 濃度對PCR擴增的特異性和擴增產(chǎn)量有顯著的影響。Mg2+濃度過高，會產(chǎn)生非特異性擴增，濃度過低，會降低Taq DNA聚合酶的活性，從而降低了擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究Mg2+濃度是對擴增結(jié)果影響最大的一個因素，這與錢志瑤等的研究結(jié)果[24-25]存在一致性;并確定了Mg2+最適濃度為1.0 mmol/L，這與肖琳等的研究結(jié)果[26]一致。

從正交設計試驗瓊脂糖凝膠電泳圖的結(jié)果中可以看出，16個正交處理水平的第8個處理組合為最佳處理組合。該組合（25 μL）各因素濃度或用量分別為dNTPs濃度0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度0.7 μmol/L、模板DNA用量2.5 ng、Mg2+ 濃度1.0 mmol/L，與正交試驗瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖直觀評分結(jié)果的方差分析和多重比較分析得到的各因素最佳用量一致。綜上所述，不同物種ISSR-PCR反應體系的擴增結(jié)果具有不同程度的差異。本研究通過單因素試驗和正交設計優(yōu)化ISSR-PCR反應體系中的5個影響因子，建立了適用于素馨屬植物ISSR-PCR反應的最佳體系，通過對該體系的驗證，結(jié)果表明該體系具有很好的穩(wěn)定性、可重復性，可為素馨屬種質(zhì)遺傳多樣性分析和親緣關系的研究鑒定等方面提供參考依據(jù)。

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