施天元 程玉祥

摘要：小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme，簡稱BBE）是一類典型的黃素雙共價氧化酶家族，參與植物生長發(fā)育的多個生物過程。PtBBE9a是筆者所在課題組前期從楊樹發(fā)育木質(zhì)部分離、鑒定的糖蛋白。PtBBE9a基因表達在楊樹木質(zhì)部呈現(xiàn)高豐度水平，并且隨著莖木質(zhì)化程度的增強而升高。組織β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性染色結果顯示，PtBBE9a啟動子活性集中在ProPtBBE9a：：GUS轉基因擬南芥幼苗的頂端分生組織、成熟果莢皮及根組織。通過構建PtBBE9a-GFP過表達載體發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a過表達擬南芥比野生型擬南芥早開花。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥的葉片數(shù)少于野生型擬南芥，而其莖木質(zhì)素含量高于野生型擬南芥。推測PtBBE9a可能通過調(diào)控擬南芥生長發(fā)育周期而產(chǎn)生早花表型。

關鍵詞：楊樹;PtBBE9a基因;異源過表達;啟動子;轉基因擬南芥;BBE

中圖分類號： S718.43 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0066-05

小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme，簡稱BBE）是一類典型的黃素雙共價氧化酶家族[1]。BBE家族的所有成員均有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結構域和底物結合域（a/b結合域）[2]。BBE最先被報道參與生物堿合成[3-4]，隨后人們發(fā)現(xiàn)了BBE的不同功能，如參與免疫反應與脅迫響應[5-6]、受激素調(diào)控[7-9]、參與雌雄配子體發(fā)育和花粉管伸長等[10-12]。Daniel等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的BBE蛋白具有木質(zhì)素氧化酶特性，可氧化松柏醇、β-糖苷松柏醇等木質(zhì)素單體，參與木質(zhì)素生物合成[13]。

楊樹BBE家族有69個成員，分為A～F 6個亞型[14]。筆者在前期研究并鑒定楊樹發(fā)育過程中的木質(zhì)部糖蛋白組時，識別到11個PtBBEs（未發(fā)表），PtBBE9a是其中之一。經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a與擬南芥單木質(zhì)素氧化酶AtBBE-like 13是對應基因。本研究通過分析PtBBE9a在組織內(nèi)的表達水平和其啟動子活性，旨在著重解析PtBBE9a在模式植物擬南芥中的異源過表達功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在2018年10月取生長于東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室溫室內(nèi)的毛果楊（Populus trichocarpa）幼樹（6月齡）的各個組織和莖節(jié)，用于轉錄水平的基因表達分析。將溫室栽培45 d的苗期、開花盛期的擬南芥用于農(nóng)桿菌浸花法遺傳轉化。

1.2 主要試劑

pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent（Bioflux）;cDNA反轉錄試劑盒[PrimeScript RT reagent Kitt with gDNA eraser（購自Takara公司）];pENTR/SD/D-TOPO、Gateway LR酶（購自Invitrogen公司）;膠回收試劑盒[Silica Bead DNA Gel Extrction Kit（購自Thermo Scientific公司）];KOD-Plus高保真酶（購自Toyobo公司）;X-Gluc、乙酰溴（購自Sigma公司）。GUS染液配方：1 mg/mL X-Gluc，10 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），100 mmol/L Na3PO4（磷酸鈉），2 mmol/L K3Fe（CN）6（鐵氰化鉀），2 mmol/L K4Fe（CN）6（亞鐵氰化鉀），0.1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物RNA的提取和cDNA的合成 在液氮條件下把毛果楊各個組織、莖節(jié)及擬南芥葉片材料研磨成粉末，加入pBIOZOL植物RNA提取試劑，提取具體操作參照pBIOZOL Plant Total RNA Kit說明書。cDNA的合成參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser操作說明書進行。

1.3.2 PCR擴增 20 μL RT-PCR反應體系：13.5 μL 去離子無菌水，2.0 μL dNTP，2.0 μL 10×Buffer，0.5 μL Taq DNA聚合酶，各0.5 μL引物，1.0 μL cDNA模板。RT-PCR反應程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24～35個循環(huán);72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測。50 μL全長基因和啟動子擴增體系：32.0 μL去離子無菌水，5.0 μL dNTP Mix（2 mmol/L），5.0 μL 10×PCR buffer，2.0 μL MgSO4（25 mmol/L），1.0 μL KOD-plus，各1.5 μL引物，2.0 μL模板。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 ProPtBBE9a：：GUS 和35S：：PtBBE植物表達載體的構建 用PtBBE9a-Pro-up/down引物擴增PtBBE9a基因啟動子片段;回收后連接至pENTR/SD/D-TOPO載體上，再用該載體轉化TOP10;挑選出陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)LR交換連接到pGWB3上，將后者轉化入GV3101農(nóng)桿菌中。用PtBBE9a-up/down引物擴增PtBBE9a基因片段，再將其連接至pENTR/SD/D-TOPO載體上，提取陽性菌落質(zhì)粒，經(jīng)LR交換構建到pGWB5植物過表達載體上。

1.3.4 擬南芥遺傳轉化及轉基因植株的分子鑒定 擬南芥遺傳轉化采用農(nóng)桿菌浸花法[15]。轉基因擬南芥的分子鑒定包括2個方面：用RT-PCR檢測轉入PtBBE9a基因的轉錄水平;用Western Blot檢測轉入PtBBE9a基因的蛋白質(zhì)水平，一抗為anti-GFP抗體，具體操作方法參考Liu等的報道[16]。

1.3.5 GUS染色檢測 將ProPtBBE9a：：GUS各組織材料放入離心管中，加入GUS染液使其沒過植物材料，放入真空干燥器里抽氣，重復數(shù)次至植物材料沉至管底。取出植物材料后于37 ℃過夜反應，再分別用100%、90%、70%乙醇逐級脫去葉綠素。

1.3.6 擬南芥開花時間及葉片數(shù)統(tǒng)計 當擬南芥莖抽出1 cm時，統(tǒng)計時間和蓮座葉數(shù)量。每個轉基因株系統(tǒng)計15個植株，重復3次，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.3.7 木質(zhì)素含量的測定 稱取1 mg擬南芥莖組織粉末，木質(zhì)素含量的測定參照Foster等的改良測定方法[17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用IBM SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。對開花時間、開花時葉片數(shù)和莖組織木質(zhì)素含量等數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（ANOVA）。

1.3.9 引物序列 本研究所用引物及其序列見表1。

2 結果與分析

2.1 PtBBE9a基因的表達分析

提取毛果楊木質(zhì)部、形成層、韌皮部、頂芽、幼葉、老葉、葉柄和第1～6、9、12莖節(jié)總RNA后，反轉錄合成cDNA。用PtActin2內(nèi)標基因對各組織內(nèi)的cDNA進行定量，RT-PCR分析結果顯示，PtBBE9a能在木質(zhì)部特異性表達且轉錄水平較高，在形成層和老葉中也有少量轉錄（圖1-a）。第1、2莖節(jié)中PtBBE9a的轉錄水平極低，第3、4、5、6、9莖節(jié)中的轉錄水平逐漸增加，第12莖節(jié)中的轉錄水平極高（圖1-b）。這表明隨著毛果楊莖逐步木質(zhì)化，PtBBE9a的轉錄水平逐漸升高。

2.2 ProPtBBE9a：：GUS植物表達載體的構建

為了鑒定PtBBE9a基因啟動子的活性，構建其驅動表達GUS報告基因的pGWB3植物表達載體。經(jīng)PCR擴增，得到3 287bp的PtBBE9a啟動子片段（圖2-a），將其連接到pENTR/SD/D-TOPO載體上（圖2-b），通過LR交換反應，將PtBBE9a啟動子片段同源重組到pGWB3載體上，得到ProPtBBE9a：：GUS融合質(zhì)粒（圖2-c），將其轉化GV3101農(nóng)桿菌，用于擬南芥的遺傳轉化。

2.3 ProPtBBE9a：：GUS轉基因擬南芥組織GUS活性染色

通過對擬南芥進行轉化，獲得12個ProPtBBE9a∷GUS轉基因株系。苗齡為5、10 d的幼苗染色結果顯示，GUS活性出現(xiàn)在頂端分生組織（圖3-a～圖3-c）。在開花的ProPtBBE9a∷GUS轉基因植株中，在果莢基部、成熟果莢皮上均檢測到GUS染色（圖3-d～圖3-e）。另外，在成熟的植株根部也檢測到GUS染色（圖3-f）。這些結果提示，ProPtBBE9a啟動子活性集中在擬南芥幼苗的頂端分生區(qū)和維管系統(tǒng)較發(fā)達的根組織。

2.4 PtBBE9a過表達載體的構建及其在擬南芥中的異源過表達

為了鑒定PtBBE9a的功能，筆者構建了pGWB5-PtBBE9a植物過表達載體。以毛果楊木質(zhì)部組織cDNA為模板，擴增出了PtBBE9a基因的全長片段（圖4-a），將該基因片段連接到pENTR/SD/D-TOPO載體上（圖4-b），采用LR交換反應得到 35S∷PtBBE9a-GFP 融合質(zhì)粒（圖4-c），再用該質(zhì)粒轉化GV3101農(nóng)桿菌，用于擬南芥過表達轉化。

采用農(nóng)桿菌浸花法將35S∷PtBBE9a-GFP轉化入擬南芥中，獲得12個獨立的轉基因株系（編號為1#～12#）。提取野生型和12個轉基因擬南芥株系的總RNA并合成cDNA，用RT-PCR檢測各株系PtBBE9a-GFP的轉錄水平（圖5-a）。與內(nèi)參基因AtActin2相比，2#、5#、10#、12#株系中PtBBE9a的轉錄水平極高，表明這4個株系達到了PtBBE9a的過表達水平。隨后，通過Western檢測分析轉基因株系的PtBBE9a-GFP蛋白質(zhì)水平（圖5-b）。以Actin蛋白量為參照的分析結果顯示，2#、5#、10#、12# 株系中的PtBBE9a-GFP蛋白質(zhì)含量非常高，表明這4個株系的PtBBE9a蛋白質(zhì)量達到了過表達水平。

2.5 過表達PtBBE9a擬南芥早開花

筆者選取PtBBE9a過表達量最高的3個轉基因株系（2#、5#、12#）的鑒定表型，發(fā)現(xiàn)3個過表達株系擬南芥均比野生型擬南芥呈現(xiàn)出早開花表型（圖6-a），野生型擬南芥生長至抽薹的平均時間為23.87 d，3個過表達株系生長至抽薹的平均時間分別是21.53、21.00、19.07 d。進一步觀察過表達株系發(fā)育狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，抽薹時野生型擬南芥蓮座葉數(shù)量平均為12.87張，3個過表達株系的蓮座葉數(shù)量分別為11.40、10.93、9.73張（圖6-b），表明PtBBE9a過表達導致擬南芥植株的生長發(fā)育周期縮短。為了探究PtBBE9a過表達帶來的早開花功能，筆者測定了3個轉基因株系的莖部木質(zhì)素含量，結果顯示，轉基因植株莖部木質(zhì)素含量均高于野生型植株（圖6-c）。

3 討論

早期被報道的BBE家族功能是參與生物堿合成，最新的研究發(fā)現(xiàn)，BBE有木質(zhì)素單體氧化酶活性[13]。PtBBE9a是筆者在前期研究中從楊樹木質(zhì)部糖蛋白組中分離出來的（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本研究發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a在毛果楊木質(zhì)部呈現(xiàn)出特異性轉錄水平，在ProPtBBE9a∷GUS轉基因擬南芥中，PtBBE9a啟動子的活性主要體現(xiàn)在頂端分生組織和成熟根部，這些組織是植物次生維管系統(tǒng)較發(fā)達的組織，暗示PtBBE9a很可能與細胞壁的木質(zhì)素代謝相關。

過表達PtBBE9a擬南芥出現(xiàn)早花表型，該發(fā)現(xiàn)在植物BBE功能研究中尚未報道。研究還發(fā)現(xiàn)，轉基因PtBBE9a擬南芥的連座葉數(shù)量變少，表明轉基因縮短了擬南芥的生長周期，使其比野生型早開花。另外，過表達PtBBE9a的擬南芥莖部木質(zhì)素含量明顯高于野生型。木質(zhì)素水平升高很可能會加速植物維管組織系統(tǒng)成熟，可能增強了葉片成花素（FT）的運輸。過表達糖苷轉移酶基因的煙草會早花，木質(zhì)素含量會升高[18]，而過表達細胞壁擴張蛋白也會導致植物早花[19]。推測植物維管系統(tǒng)細胞壁狀態(tài)可能與早開花密切相關，而木質(zhì)素是次生細胞壁的關鍵成分，它影響次生維管系統(tǒng)的發(fā)育成熟。今后，筆者將利用過表達PtBBE9a擬南芥早花材料進行深入探究。

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