劉雅麗 榮玉靜 胡深強(qiáng) 李亮 劉賀賀 何樺 夏露 胡繼偉 胡博 王繼文

摘要：為了揭示miR-199a-5p在鵝卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中的作用及調(diào)控機(jī)制，本研究分離培養(yǎng)鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞并轉(zhuǎn)染miR-199a-5p相似物（mimic）和抑制物（inhibitor），采用qPCR法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量;為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，結(jié)合RNAhybrid和Targetscan 7.0預(yù)測miR-199a-5p靶基因，然后在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）中采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-199a-5p對血管生成因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）3′UTR熒光素酶活性的影響，最后采用qPCR檢測miR-199a-5p對鵝顆粒細(xì)胞VEGFA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-199a-5p能顯著升高BCL2/BAX比值（P<0.05），顯著下調(diào)Caspase3 mRNA表達(dá)量（P<0.05）;抑制miR-199a-5p則顯著下調(diào)BCL2/BAX值（P<0.05），對Caspase3 mRNA表達(dá)量無影響（P>0.05）。雙熒光素酶報告載體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p能極顯著抑制VEGFA-WT報告載體熒光素酶活性（P<0.01），但對VEGFA mRNA表達(dá)量無顯著性影響（P>0.05）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-199a-5p可能通過抑制BAX和Caspase3表達(dá)量來抑制鵝顆粒細(xì)胞凋亡，但在鵝顆粒細(xì)胞中miR-199a-5p是否通過VEGFA調(diào)控細(xì)胞凋亡需要進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：miR-199a-5p;VEGFA;顆粒細(xì)胞凋亡;鵝;mimic;inhibitor

中圖分類號：S858.33 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0060-06

卵巢卵泡發(fā)育狀況影響家禽繁殖性能和產(chǎn)蛋率，而影響卵泡正常發(fā)育的因素眾多，其中顆粒細(xì)胞增殖分化或凋亡對卵泡發(fā)育具有重要作用[1]。顆粒細(xì)胞能合成多種活性肽，不僅可以調(diào)節(jié)垂體釋放促卵泡素（FSH）影響卵泡發(fā)育，還能作為局部調(diào)節(jié)因子調(diào)控類固醇激素生成和細(xì)胞增殖，為卵泡生長發(fā)育所必需。禽類卵泡發(fā)育過程中大量發(fā)生閉鎖，這個過程主要受顆粒細(xì)胞凋亡率調(diào)控。Johnson等發(fā)現(xiàn)，雞卵泡閉鎖起始于顆粒層并受顆粒細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)[2-3]。

miRNA是一類長約18～25 nt具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼蛋白RNA[4]。目前在顆粒細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多miRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡。對豬健康卵泡和閉鎖卵泡測序后發(fā)現(xiàn)，miR-26b在閉鎖卵泡中表達(dá)量顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其通過靶向ATM（共濟(jì)失凋突變基因）促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[5]。對水牛健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡測序后發(fā)現(xiàn)，包括 miR-21-5p 在內(nèi)多個miRNA表達(dá)量隨著卵泡閉鎖程度增加先升高后下降，表明miR-21-5p可能參與了調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡[6]。FSH處理雞顆粒細(xì)胞后能抑制細(xì)胞凋亡，對處理樣品測序后發(fā)現(xiàn)包括let-7家族和miR-130/301家族在內(nèi)的miRNA差異表達(dá)，表明它們可能在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了作用[7]。表皮生長因子（EGF）處理鵝等級前顆粒細(xì)胞后，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，miRNA測序后發(fā)現(xiàn)包括miR-26b、miR-27a、miR-27b等多個miRNA表達(dá)量顯著上調(diào)[8]。筆者所在課題組通過對不同發(fā)育階段卵泡顆粒層測序得到許多差異表達(dá)的miRNA，包括miR-199a-5p[9]。Donadeu等測序發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在牛閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在健康卵泡顆粒細(xì)胞中[10]。對牛發(fā)情期第3天次級卵泡和優(yōu)勢卵泡的顆粒層測序后發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在次級卵泡顆粒層中表達(dá)量顯著高于在優(yōu)勢卵泡中，但在發(fā)情期第7天miR-199a-5p表達(dá)量趨勢與之相反，說明miR-199a-5p在顆粒細(xì)胞中的作用可能與卵泡發(fā)育階段有關(guān)[11]。目前miR-199a-5p在顆粒細(xì)胞中的研究只停留在測序水平，關(guān)于其在顆粒細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制尚未報道。

目前，miR-199a-5p在禽類顆粒細(xì)胞中的作用尚未有報道，而顆粒細(xì)胞的凋亡率影響卵泡正常發(fā)育，因此本試驗(yàn)通過在鵝顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-5p相似物（mimic）或抑制物（inhibitor）來過表達(dá)或抑制內(nèi)源性miR-199a-5p表達(dá)。qPCR法檢測細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)量，使用生物信息學(xué)預(yù)測 miR-199a-5p靶基因并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證，最后qPCR法檢測miR-199a-5p對靶基因表達(dá)量的影響。本研究結(jié)論旨在為進(jìn)一步闡明miR-199a-5p在禽類顆粒細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和細(xì)胞系

本試驗(yàn)動物材料選用在相同條件下飼養(yǎng)的健康、開產(chǎn)時間和體質(zhì)量基本一致并處于產(chǎn)蛋高峰期的天府肉鵝母系母鵝。試驗(yàn)動物來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場，使用程序按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物護(hù)理與使用指南進(jìn)行;中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。試驗(yàn)于2018—2019年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 鵝顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)

將鵝頸部放血處死后取出卵泡，按照Gilbert等的方法分離F2～F4等級階段卵泡顆粒層：在超凈臺中剪碎后加入0.05% Ⅱ型膠原酶（美國MPbio公司），在37 ℃水浴鍋中消化，無明顯塊狀物后終止消化[12]。離心后棄去上清，加入含10% FBS（胎牛血清，美國Gibco公司）和1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12（杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基，美國HyClone公司）培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于12孔板，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染

顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按照 Lipofectamine3000（美國英杰生命技術(shù)有限公司）說明書操作轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-199a-5p的相似物（mimic）和抑制物（inhibitor）。筆者所在課題組前期對鵝顆粒細(xì)胞miRNA進(jìn)行測序，得到miR-199a-5p序列（5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3′），根據(jù)其序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成鵝miR-199a-5p的mimic和inhibitor，詳見表1。每個試驗(yàn)組共設(shè)3個重復(fù)孔，24 h后使用RNAiso Plus[寶生物工程（大連）有限公司]收集RNA樣品。

1.4 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)量

用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA后，使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成的miRNA&U6反轉(zhuǎn)錄與定量試劑盒檢測miR-199a-5p的表達(dá)量。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ[寶生物工程（大連）有限公司]檢測mRNA表達(dá)量。每個樣本重復(fù)3次，miRNA和mRNA表達(dá)量計(jì)算分別以U6和β-actin為內(nèi)參，本試驗(yàn)所用定量引物序列見表2。

1.5 靶基因預(yù)測與載體構(gòu)建

根據(jù)靶基因預(yù)測網(wǎng)站Targetscan 7.0（http：//www.targetscan.org/vert_71/）和RNAHybrid（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid）預(yù)測到鵝VEGFA（XM_013200060.1）可能是miR-199a-5p的靶基因，在3′UTR處存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)鵝VEGFA 3′UTR設(shè)計(jì)如下引物擴(kuò)增包括潛在結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的片段：F：5′-cgagctcTCAGTACGGACGA-3′;R：5′-ctctagaGGCGAAGGTTGG-3′，引物5′端小寫字母分別代表SacⅠ、XbaⅠ 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后和pmirGLO質(zhì)粒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]使用SacⅠ、XbaⅠ內(nèi)切酶（英國New England Biolabs公司）進(jìn)行雙酶切，再次膠回收后將擴(kuò)增片段連接到pmirGLO質(zhì)粒上得到野生型重組載體即VEGFA-WT。將野生型載體的潛在結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)槠浠パa(bǔ)序列，得到突變型重組載體即VEGFA-MUT，點(diǎn)突變由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.6 雙熒光素酶報告載體試驗(yàn)

CHO細(xì)胞系復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后用胰酶消化，然后用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×106～4×106個/mL的密度接種于96孔板。待細(xì)胞密度達(dá)到約70%～80%時，按照Lipofectamine 3000（美國英杰生命技術(shù)有限公司）說明書將miR-199a-5p mimic/NC分別與VEGFA-WT/MUT兩兩共轉(zhuǎn)染，試驗(yàn)共設(shè)4個試驗(yàn)組，每組3孔重復(fù)值。

1.7 雙熒光素酶活性檢測

使用Dual-Luciferase Reporter試劑盒（Promega）檢測熒光活性，檢測前先將luciferase底物按要求溶解分裝，-80 ℃?zhèn)溆谩０丛囼?yàn)需要量稀釋1×裂解液，并按stop & Glo buffer ∶ stop & Glo底物=50 ∶ 1的比例現(xiàn)配stop & Glo底物備用。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入裂解液充分裂解細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)移到小EP管中。檢測時先加入20 μL細(xì)胞裂解液和100 μL luciferase底物反應(yīng)并讀取A值，繼續(xù)加入100 μL stop & Glo底物反應(yīng)讀取B值，A/B比值即為最終檢測結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)量[13]，使用GraphPad Prism 7.0軟件的t-test檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-199a-5p過表達(dá)和抑制效果檢測

本試驗(yàn)中miR-199a-5p mimic設(shè)置30、90、150 nmol/L 3個轉(zhuǎn)染濃度，檢測miR-199a-5p過表達(dá)效果，結(jié)果見圖1-A。miR-199a-5p mimic轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞24 h后，與各自對照組相比，90、150 nmol/L 濃度時miR-199a-5p表達(dá)量顯著增加（P<0.05）。miR-199a-5p inhibitor設(shè)置50、100、150 nmol/L 3個轉(zhuǎn)染濃度，結(jié)果見圖1-B，100、150 nmol/L時，miR-199a-5p表達(dá)量均極顯著減少（P<0.01或P<0.001），因此后續(xù)試驗(yàn)過表達(dá)組和抑制組定量樣品轉(zhuǎn)染濃度均選擇150 nmol/L。

2.2 miR-199a-5p對顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

由圖2可知，過表達(dá)miR-199a-5p后，抗凋亡基因B-Cell CLL/Lymphoma 2（BCL2）與促凋亡因子BCL2 Associated X Protein（BAX）的比值（BCL2/BAX）上升，促凋亡基因Caspase3 mRNA表達(dá)量均下

降，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。抑制miR-199a-5p后，BCL2/BAX比值顯著下降，但Caspase3表達(dá)量沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3 miR-199a-5p靶基因預(yù)測與載體構(gòu)建

通過Targetscan網(wǎng)站預(yù)測miR-199a-5p靶基因，從中挑選與顆粒細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因，最終選擇VEGFA作為候選靶基因。將鵝VEGFA 3′UTR序列和鵝miR-199a-5p序列導(dǎo)入RNAhybrid網(wǎng)站中尋找二者的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見圖3。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到677 bp的VEGFA 3′UTR片段，包含潛在的結(jié)合位點(diǎn)。最終構(gòu)建得到的野生型和突變型載體序列見圖4。

2.4 miR-199a-5p靶基因鑒定

CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后檢測熒光活性，結(jié)果見圖5。當(dāng)過表達(dá)miR-199a-5p時，和對照組相比VEGFA-WT熒光活性被極顯著抑制（P<0.01），說明二者之間存在結(jié)合位點(diǎn);過表達(dá)miR-199a-5p對VEGFA-MUT熒光活性沒有顯著變化（P>0.05），說明二者不存在結(jié)合位點(diǎn)，即預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)正確，鵝VEGFA是 miR-199a-5p的靶基因。進(jìn)一步在鵝顆粒細(xì)胞中檢測VEGFA mRNA表達(dá)量（圖6）發(fā)現(xiàn)，無論是過表達(dá)還是抑制miR-199a-5p表達(dá)，VEGFA mRNA表達(dá)量均沒有顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

已知BCL2和BAX是通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的，二者比值降低促進(jìn)凋亡，反之則抗凋亡[14]。本研究中過表達(dá)miR-199a-5p后BCL2/BAX比值顯著升高，而抑制后比值顯著下降，促凋亡基因Caspase3表達(dá)量也在過表達(dá) miR-199a-5p 后顯著下降，說明miR-199a-5p在鵝顆粒細(xì)胞中可能起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。miR-199a-5p在顆粒細(xì)胞中的功能研究尚未有報道。Zhu等發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[15-16]。在小鼠肝細(xì)胞中刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，抑制miR-199a-5p表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明 miR-199a-5p在肝細(xì)胞中起到抗凋亡的作用，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[17]。此外miR-199a-5p還可以調(diào)控細(xì)胞增殖。在肝癌細(xì)胞中，miR-199a-5p調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1A）和VEGFA抑制細(xì)胞增殖[18]。Ye等發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-199a-5p通過HIF1A/VEGFA 途徑抑制細(xì)胞增殖，但不影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期[19]。

miRNAs的經(jīng)典作用方式是通過與靶基因mRNA 3′UTR結(jié)合抑制靶基因表達(dá)，繼而發(fā)揮不同功能。本研究使用Targetscan網(wǎng)站共預(yù)測到621個miR-199a-5p靶基因，從中篩選與顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，最終選擇VEGFA基因作為候選基因。VEGFA基因編碼肝素結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對于血管生成必不可少[20]。在小鼠顆粒細(xì)胞中慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)VEGFA后，BAX和Caspase3表達(dá)量顯著下降，抑制顆粒細(xì)胞凋亡[21]。在綿羊顆粒細(xì)胞中直接添加VEGFA可促進(jìn)細(xì)胞增殖[22-23]。卵泡發(fā)育需要血管提供氧氣，因此VEGFA還影響卵泡正常發(fā)育，直接向小鼠卵巢中注射VEGFA后，可促進(jìn)卵泡數(shù)量增加和血管生成[24]。Hsu等發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-199a-5p可以通過靶向VEGFA的3′UTR抑制子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，驗(yàn)證了二者之間的靶向關(guān)系[25]。

由于Targetscan網(wǎng)站中預(yù)測靶基因與miRNA結(jié)合位點(diǎn)時不包含鵝，為了確定miR-199a-5p與鵝VEGFA基因潛在的結(jié)合位點(diǎn)，使用RNAHybrid網(wǎng)站導(dǎo)入鵝VEGFA 3′UTR與miR-199a-5p序列，預(yù)測二者可能的結(jié)合位點(diǎn)并構(gòu)建野生型和突變型載體。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-199a-5p后，VEGFA-WT報告載體熒光素酶活性顯著下降，說明VEGFA是miR-199a-5p的靶基因。當(dāng)突變二者的潛在結(jié)合位點(diǎn)后過表達(dá)miR-199a-5p對VEGFA-MUT報告載體熒光素酶活性無影響，證明預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)正確。本研究進(jìn)一步檢測miR-199a-5p對VEGFA表達(dá)量的影響時發(fā)現(xiàn)，無論是過表達(dá)還是抑制miR-199a-5p表達(dá)，都不影響顆粒細(xì)胞中VEGFA mRNA的表達(dá)量，表明miR-199a-5p是在翻譯水平調(diào)控VEGFA蛋白表達(dá)。在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，miR-199a-5p通過與VEGFA 3′UTR結(jié)合抑制其蛋白表達(dá)量，但不影響mRNA表達(dá)量[26]。

miRNA靶基因眾多，在不同發(fā)育階段或組織細(xì)胞中起主效作用的靶基因可能存在差異，而單個靶基因又會同時受到多個miRNA調(diào)控，共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27-28]。目前眾多研究表明，VEGFA在顆粒細(xì)胞中行使促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用，而本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在鵝顆粒細(xì)胞中可能發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，因此推測miR-199a-5p在鵝顆粒細(xì)胞中抗凋亡功能可能不是通過靶基因VEGFA實(shí)現(xiàn)的，或者說VEGFA在此過程中作用很小，不是主效靶基因，仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p可能抑制鵝顆粒細(xì)胞凋亡，并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證了VEGFA是miR-199a-5p的靶基因，但是 miR-199a-5p抑制鵝顆粒細(xì)胞凋亡的功能是否通過VEGFA通路實(shí)現(xiàn)需要進(jìn)一步研究。本研究初步探討miR-199a-5p在禽類顆粒細(xì)胞中的功能及可能機(jī)制，為深入探究miRNA在禽類卵巢顆粒細(xì)胞中的功能提供理論依據(jù)。

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