高衛(wèi)安 黃烈平 吳金華

[摘要] 目的 探討兒童免疫力與維生素D受體基因（Vitamin D receptor，VDR）的相關(guān)性，揭示VDR基因多態(tài)性和兒童免疫力的相關(guān)性，并研究其在免疫力低下發(fā)生發(fā)展中的作用機制。 方法 選取2018年1月～2020年1月在我院進行檢查的0～14歲兒童80例，根據(jù)T淋巴細胞亞群檢測，將兒童分為研究組（免疫力低下）和對照組（健康），每組各40例。收集各組兒童的年齡、身高等臨床資料及外周血標本，運用化學發(fā)光法檢測其血清中維生素D（VD）的濃度。設(shè)計引物用位點阻滯法，進行VDR多態(tài)性位點Apa I、Bsm I、Taq I、Fok I的檢測。 結(jié)果 兩組VDR多態(tài)性位點Bsm I、Taq I、Fok I基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;兩組Apa I基因型的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。研究組外周血清中25-OH VD水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。研究組感冒次數(shù)多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且感冒次數(shù)與VD水平呈負相關(guān)。 結(jié)論 Apa Ⅰ基因多態(tài)性可能在免疫力低下的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，Bsm I、Taq I、Fok I基因多態(tài)性則與其無關(guān)。研究組VD水平低于對照組，提示血清VD水平可能對免疫力有增強作用。

[關(guān)鍵詞] 維生素D受體;基因多態(tài)性;兒童;免疫力

[中圖分類號] R729? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）32-0015-05

[Abstract] Objective To explore the correlation between child immunity and vitamin D receptor gene（vitamin D receptor， VDR）， to reveal the correlation between VDR gene polymorphism and child immunity， and to study its mechanism in development in the development of low immunity. Methods A total of 80 children aged 0-14 were selected from January 2018 to January 2020 in our hospital， according to the detection of T lymphocyte subsets， they were divided into research group（immunocompromised） and control group（healthy） with 40 children in each group. And the clinical data such as age and height， and the peripheral blood samples of children were collected. The concentration of vitamin D（VD） in serum was detected using chemiluminescence method. The VDR polymorphism sites Apa I， Bsm I， Taq I， Fok I were detected by site block method for primer design. Results There were no significant differences in the Bsm I， Taq I and Fok I genotypes of VDR polymorphism sites between the study group and the control group（P>0.05）. The distribution of Apa I genotype in the two groups was statistically different（P<0.01）. The 25-OH VD level in the peripheral serum of the study group was lower than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds in the study group was higher than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds and VD levels had a negative correlation trend. Conclusion The polymorphism of Apa I gene may play a role in the pathogenesis of immunocompromise， but the polymorphism of Bsm I， Taq I， and Fok I genes has nothing to do with it. The level of VD in the study group was lower than that in the control group， suggesting that the level of serum VD may enhance immunity.

[Key words] Vitamin D receptor; Gene polymorphism; Children; Immunity

維生素D（Vitamin D，VD）是一種擁有廣泛生理功能的激素和營養(yǎng)素，不僅影響鈣磷代謝和骨組織礦化，還與糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及腫瘤等密切相關(guān)[1]。大量流行病學研究顯示，VD缺乏在兒童中普遍發(fā)生，30%～40%的兒童存在不同程度的VD缺乏[2-6]。這不僅影響兒童的生長發(fā)育，且可能影響其未來的健康狀況。免疫力是兒童抵御疾病的基本能力，免疫是維持機體免受感染性疾病感染的穩(wěn)定狀態(tài)，它是一套復(fù)雜的生理機制，可讓機體識別、中和、消除異物。其中T淋巴細胞亞群在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，CD4+具有增強吞噬細胞的抗感染免疫功能，CD3+為外周血成熟T細胞，其濃度的降低提示T細胞免疫功能低下。CD8+在細胞調(diào)節(jié)及免疫功能中具有抑制作用。CD4+/CD8+比值是反映機體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個重要指標，CD4+/CD8+比值降低提示機體免疫功能受到抑制，以此作為免疫功能的檢測標準。

學齡前是兒童生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，該時期的兒童免疫功能差，易發(fā)生疾病，而感染是兒童發(fā)病和死亡的主要原因[7-8]。多項研究表明，VD可提高兒童自身免疫功能，減少微生物病原體的感染[9-13]。呼吸系統(tǒng)是兒童最易受到侵犯的系統(tǒng)，江笑文[14]發(fā)現(xiàn)，反復(fù)呼吸道感染患兒存在嚴重的VD缺乏和免疫力低下的情況，表明VD缺乏可能會導致細胞免疫功能異常，從而增加呼吸道反復(fù)感染的風險。李微娜等[15]對呼吸道反復(fù)感染的患兒采用VD聯(lián)合治療，結(jié)果顯示VD可有效改善患兒的臨床癥狀，減少感染次數(shù)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，VD可以通過多種機制影響感染的易感性和嚴重程度，它通過影響抗菌肽Cathelicidin的產(chǎn)生[16-17]，增加機體對病毒和細菌的敏感性，并通過特異性和非特異性免疫系統(tǒng)及NF-κB途徑影響感染過程中的細胞因子譜。VD的作用由胞質(zhì)維生素D受體（VDR）介導，25-羥維生素D3經(jīng)肝腎代謝產(chǎn)生后結(jié)合VDR，進入細胞核，作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子并激活基因表達。VDR基因位于12q13.1號染色體上，具有多個多態(tài)性區(qū)域，其中一些與某些疾病的易感性有關(guān)[18]。這意味著VD敏感性存在巨大的個體間差異，且VD缺乏還會導致患病風險增加。因此，本研究通過探討兒童免疫力低下與VD水平及VDR基因多態(tài)性表達的相關(guān)性，以揭示VD在免疫力低下發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2020年1月在我院進行系統(tǒng)保健和正常體檢的寧波地區(qū)0～14歲兒童80例作為研究對象。納入標準：根據(jù)T淋巴細胞亞群檢測[19]的正常值參考范圍[CD4+：（410～1590）/μL，CD8+：（190～1140）/μL]，將兒童分為研究組（免疫力低下）和對照組（健康），每組各40例。采集兩組兒童的外周血標本，并收集其年齡、身高等臨床資料。研究組中，男22例，女18例;平均年齡（6.41±2.02）歲。對照組中，男21例，女19例;平均年齡（6.03±1.89）歲。兩組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。排除標準[20]：排除合并心、肝、腎等器質(zhì)性病變或惡性腫瘤者、合并免疫相關(guān)疾病者及入組前有服用VD補充劑史的兒童。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法與觀察指標

所有的實驗均單獨重復(fù)3次。采用全血DNA小量試劑盒（3001250，杭州新景生物）、總VD測定試劑盒（化學發(fā)光法）、NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus（E096，上海近岸蛋白）、7500 FAST實時熒光PCR儀進行檢測，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。見表1。

1.2.1全血DNA提取? 采集各組患兒外周血標本，分裝于EDTA-K2抗凝管和普通干燥管中，使用全血DNA小量試劑盒，按照說明書進行全血DNA提取。并利用微量分光光度計對其濃度及純度進行檢測。

1.2.2 qPCR基因分型? 將提取的DNA作為擴增反應(yīng)模板，加入NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus和相應(yīng)的引物，采用傳統(tǒng)的三步法對VDR SNPs進行實時PCR分型。每例DNA模板同時在兩個反應(yīng)管中進行，分別用引物對上游引物/野生型下游引物和引物對上游引物/突變型下游引物進行擴增，設(shè)置3個復(fù)孔，利用擴增阻滯突變系統(tǒng)法進行基因分型。

1.2.3 25-羥維生素D3水平檢測? 檢測血清25-羥維生素D3水平，采用總VD體外診斷免疫試劑盒測定分析，利用ADVIA Centaur全自動化學發(fā)光免疫分析儀，確定VD水平。

1.2.4 T淋巴細胞亞群檢測? 使用流式細胞儀對T淋巴細胞亞群水平進行測定，T淋巴細胞亞群檢測項目包括CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR多態(tài)性位點檢測方法可行性

通過前期實驗驗證，以VDR基因的rs2228570、rs1544410、rs7975232三個SNP位點的突變堿基，利用所設(shè)計的特異性引物對全血DNA進行SNP位點特異性擴增，根據(jù)7500 FAST實時熒光PCR儀的分析結(jié)果得到基因型，與測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)，11個樣本采用實時熒光定量PCR方法基因分型結(jié)果與測序結(jié)果均一致。證明該方法特異性高、重復(fù)性高，操作方便快捷，可以為本研究提供檢測技術(shù)支持。

2.2兩組VDR多態(tài)性位點比較

2.2.1 兩組Bsm I檢測結(jié)果比較? Bsm I（rs1544410）基因序列的野生基因型為GG，突變基因型為AG和AA，研究組和對照組均未檢測到另一突變基因型AA。兩個不同分組基因頻率分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律（H-W test）檢測，顯示均符合H-W分布（P>0.05）。檢測到的基因型GG和AG在兩組中的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2.2 兩組Fok I檢測結(jié)果比較? Fok I（rs2228570）基因序列的野生基因型為CC，突變基因型是CT、TT，符合H-W分布（P>0.05）。此三種基因型在研究組和對照組中的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.2.3 兩組Taq I檢測結(jié)果比較? Taq I（rs731236）基因序列的野生基因型為TT，突變基因型為CT和CC，研究組與對照組均未檢測到突變型基因CC，符合H-W分布（P>0.05）?；蛐蚑T、CT在兩組中的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

2.2.4 兩組Apa I檢測結(jié)果比較? Apa I（rs7975232）基因序列的野生基因型為CC，突變基因型為CA、AA，符合H-W分布（P>0.05）。三種基因型在兩組的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

2.2.5 兩組外周血清中25-羥維生素D3水平比較? 研究組25-羥維生素D3水平為（45.51±5.20）nmol/L，低于對照組的（60.25±4.60）nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表6、圖1。

2.2.6 兩組VD水平與臨床特征相關(guān)性? 研究組近一年感冒次數(shù)為（10.12±2.30）次，高于對照組的（4.07±1.30）次，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。感冒次數(shù)與25-羥維生素D3水平呈負相關(guān)，即血清中25-羥維生素D3水平越高，感冒次數(shù)越少。見圖3。

3討論

先天免疫力是病原體入侵之后人體的第一道防線，其中最重要的是先天免疫細胞。當出現(xiàn)諸如昆蟲叮咬等微環(huán)境損傷時，最先出現(xiàn)的是中性粒細胞和巨噬細胞。它們分泌具有高度破壞性的物質(zhì)，包括各種活性酶和化學成分，吞噬并消化受損的物質(zhì)。當兩種細胞的作用未奏效時，感染就引起了淋巴細胞的注意，淋巴細胞具有特異性識別和記憶功能，使免疫系統(tǒng)能夠做出更多的反應(yīng)并記住各種感染類型，從而以更快、更有效的反擊來應(yīng)對再次感染，這些響應(yīng)都依賴于特定基因的選擇性表達。

VD對人體的免疫系統(tǒng)有重要影響，其既可以調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫，還可以調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。一項匯集11 321名參與者的Meta分析顯示，補充VD可降低受試者急性呼吸道感染的風險，且對VD缺乏患者受益最大[19]，Bergman等[20]匯總了11項隨機安慰劑對照試驗，共涉及5660人（平均年齡16歲，6個月～75歲），分析結(jié)果顯示，補充VD可顯著降低呼吸道感染的風險（P<0.01）。已有的研究顯示，反復(fù)呼吸道感染患兒存在25-羥維生素D3和免疫球蛋白功能降低的情況，補充VD后，患兒機體免疫力顯著提高，呼吸道感染的發(fā)生率顯著降低[21]。本研究通過位點阻滯法進行分析，結(jié)果顯示，Apa I基因三種基因型在實驗與對照組中的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Apa I基因的野生基因型（CC）相比突變基因型（CA、AA）有更好的抗病能力（P<0.05），而與Bsm I、Taq I、Fok I基因的多態(tài)性無關(guān)。孫越等[22]的研究顯示，Apa I突變型基因人群中，血清免疫球蛋白水平顯著低于正常非突變?nèi)巳?，驗證了該基因型對免疫力的影響。

VD與免疫系統(tǒng)之間存在多種相互作用，大多數(shù)免疫細胞在自身受刺激后可表達VDR。研究顯示，VD調(diào)節(jié)炎癥和免疫力的機制似乎是多方面的，其可以調(diào)控巨噬細胞和樹突狀細胞的活性，以及中性粒細胞中各種Toll樣受體介導的信號通路。本研究顯示，研究組25-羥維生素D3水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且研究對象的感冒次數(shù)與25-羥維生素D3水平呈負相關(guān)，即VD在一定程度上能夠增強兒童免疫力。VDR分布于各種組織中，VD調(diào)控機制具有多樣性及重要性。但是目前的研究尚未明確VD的補充標準，根據(jù)實驗結(jié)果，需要結(jié)合VDR基因多態(tài)性及進一步的臨床試驗以確定最合適的補充方案，以此判斷VD缺乏的原因及用什么方式改善這種狀況。

綜上所述，VDR基因多態(tài)性與兒童免疫力具有相關(guān)性，其相關(guān)基因為Apa I，野生型的免疫力高于突變型，并且VD可能具有與兒童感染風險相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能，血清中VD含量與感冒次數(shù)呈負相關(guān)。

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（收稿日期：2020-07-23）