張琳，宮春杰

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430086）

天然產(chǎn)物是動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)的組成成分或代謝產(chǎn)物，具有不同的生物學(xué)功能，在自然界中廣泛存在。例如，食用天然色素主要是從動(dòng)植物組織中提取；抗生素主要是微生物產(chǎn)生的具有抗病原體功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前，人們對(duì)許多天然產(chǎn)物的功能尚不了解，需要進(jìn)一步進(jìn)行探索研究。微生物作為生態(tài)環(huán)境中廣泛存在的一類群體，蘊(yùn)藏的天然產(chǎn)物是有待發(fā)現(xiàn)的資源寶庫。

1 天然產(chǎn)物概述

1.1 天然產(chǎn)物種類

天然產(chǎn)物主要包括萜類、甾體、香豆素類、酮類、抗生素、色素、有機(jī)酸、蒽醌、多糖、多肽、脂肪酸以及蛋白質(zhì)等[1]。近年來，研究人員關(guān)于新型天然產(chǎn)物開展了大量的研究工作，如尼瑞斯制藥公司從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)的化合物NPI-3114和NPI-3304具有抗菌性[2]；或采用新技術(shù)提高產(chǎn)量，如重建菌株黑曲霉T132發(fā)酵產(chǎn)酒精，將轉(zhuǎn)化率提高到86.8%[3]。在我國經(jīng)濟(jì)增長和豐富物種資源背景的推動(dòng)下，天然產(chǎn)物的研究也獲得了具有一些新類型、新結(jié)構(gòu)的原創(chuàng)性成果。

1.2 天然產(chǎn)物功能

天然產(chǎn)物本質(zhì)為次級(jí)代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分復(fù)雜，需其他小分子作為底物經(jīng)催化反應(yīng)合成，具有一定的生物活性和功能[4]。天然產(chǎn)物具有種類、結(jié)構(gòu)和功能多樣性的特點(diǎn)。目前，天然產(chǎn)物在藥物開發(fā)和代謝研究中應(yīng)用廣泛，可用作治療劑、化妝品和農(nóng)藥等，這些產(chǎn)品多達(dá)千種。例如，花生四烯酸可降低患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防心腦血管病，可由嗜冷菌希瓦氏菌（Ac10）低溫誘導(dǎo)生產(chǎn)[5]。海洋中由于鹽濃度高、壓強(qiáng)大、溫度低，使海洋微生物具有區(qū)別于陸生微生物的代謝途徑，從而生產(chǎn)獨(dú)特的天然產(chǎn)物，因此海洋生物是天然產(chǎn)物的主要資源寶庫。如海洋鏈霉菌（TPA0879）能夠產(chǎn)生含有一個(gè)γ-內(nèi)酯的聚酮類化合物，可有效抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散[6]。由此可見，天然產(chǎn)物可用于醫(yī)學(xué)治療，或農(nóng)業(yè)上用于防治有害生物，或用作藥劑的模板物、引導(dǎo)物[4]。目前，已有不同生物種屬來源的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用，如分離于細(xì)菌的抗寄生蟲藥伊維菌素、抗腫瘤藥物博萊霉素和阿霉素，分離于短皮酵母和桔霉的抗真菌藥物等。

2 微生物來源的天然產(chǎn)物的應(yīng)用

2.1 天然產(chǎn)物與抗癌藥物

天然產(chǎn)物作為藥物或前體可用作抗癌藥物或用于相關(guān)研究，目前，約50%的溶瘤藥物來自天然產(chǎn)物。如卡非佐米可治療多發(fā)性骨髓瘤，羅米地辛用于T細(xì)胞淋巴瘤的治療，通過天然產(chǎn)物溶瘤劑可靶向其他分子靶標(biāo)。深海皮生球菌（MT1.1和MT1.2）能夠產(chǎn)生吩嗪類化合物，通過對(duì)K562細(xì)胞的IC50值（半抑制濃度）可以確定其可以用于腫瘤治療研究[6]。從海綿黑松枝菌分離出類似于片胺的酚吡咯、新阿米拉林和5-羥基新阿米拉林具有抗腫瘤功能，可以抑制HIV-1整合酶和MCV拓?fù)洚悩?gòu)酶[7]。

2.2 天然產(chǎn)物與抗心腦血管疾病

心腦血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，占總死亡人數(shù)的1/3，超過了其他各類癌癥、傳染病和意外傷害造成的死亡人數(shù)，所以降低其死亡率至關(guān)重要，其藥物研究也必不可少。如他汀類藥物分子康帕以及洛伐他汀是從青霉和曲霉中發(fā)現(xiàn)的兩種天然產(chǎn)物分子，可抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，從而預(yù)防和治療冠心病[8]。

2.3 天然產(chǎn)物與移植

移植是一種常見的治療手段，能引起機(jī)體的組織排斥反應(yīng)，如從原核微生物提取物中分離得到鑭硫磷的環(huán)狀肽杜拉霉素可作為拮抗劑，抑制移植排斥反應(yīng)[9]。從多孔木霉菌中發(fā)現(xiàn)的環(huán)孢霉素，在早期也被應(yīng)用于抑制排斥反應(yīng)。另外，器官移植過程中易遭受真菌感染，但不宜使用抗生素，而天然產(chǎn)物中有很多抗真菌化合物，并很少產(chǎn)生抗藥性。例如，在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的白僵菌素、小檗堿以及雷帕霉素等已被廣泛用于臨床[10]。

2.4 天然產(chǎn)物與抗菌劑

日常生活中，有些微生物對(duì)人們生活可造成負(fù)面影響，發(fā)現(xiàn)和研究抗菌劑具有重要意義。例如，鏈霉菌素是從鏈霉菌培養(yǎng)物中分離，具有抗菌性能。目前，分離的抗菌化合物有絲裂霉素C、波非羅霉素、放線菌素、利福霉素和格爾丹霉等。從海洋低溫環(huán)境生長的真菌康氏木霉中分離得到5個(gè)新的聚酮衍生物，分別為7-鄰甲基甲酰胺和木霉酮A、木霉酮B、木霉酮C和木霉酮D，對(duì)細(xì)菌有抑制作用和協(xié)同抗真菌活性[11]。此外，被毛孢（BCC）產(chǎn)生的天然環(huán)肽Hirsutellide A表現(xiàn)出抗分枝桿菌活性[12]。

2.5 天然產(chǎn)物與植物促生

植物與微生物共生的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)，植物根部的微生物種類豐富，從中可以發(fā)現(xiàn)大量促進(jìn)植物生長的物質(zhì)[13]。例如，可可醇是一種環(huán)氧環(huán)己烯化合物，是從誘導(dǎo)馬鈴薯小薯的真菌培養(yǎng)濾液中分離而得，噴灑在馬鈴薯和牽?；ǖ戎参镏?，可以減短塊莖和花芽形成時(shí)間，故可應(yīng)用于種子、花蕾等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[14]。從黃絲曲霉（FS2）中釋放的β-石竹烯可以刺激植物生長和提高植物抗性或耐性，且實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)白菜生長和誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗病性[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)假單胞細(xì)菌可保證植物保持健康不感染疾病，研究微生物與植物的相互作用可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可產(chǎn)生促植物生長化合物。

2.6 天然產(chǎn)物與抗衰老

衰老是機(jī)體退化的特征，服用有機(jī)合成藥物抗衰老對(duì)人體傷害較大，而天然產(chǎn)物副作用小，在開發(fā)抗衰老藥物上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已有幾十種具有抗衰老作用的天然藥物被報(bào)道。如研究人員對(duì)黃絲曲霉（ABRF2）發(fā)酵粗提物中分離得到3-甲基-4-氧代戊酸，該物質(zhì)在抗衰老和抗癌的分子對(duì)接分析中，與標(biāo)準(zhǔn)藥物相比具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，有作為開發(fā)抗衰老藥物的潛力[16]。此外，對(duì)黃乳牛肝菌的發(fā)酵物進(jìn)行乙醇提取，發(fā)現(xiàn)其提取物具有很好的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤活性，所以對(duì)其提取物進(jìn)行分析，有進(jìn)一步開發(fā)成藥物的可能[17]。

3 天然產(chǎn)物成分分析方法

3.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（CE）是對(duì)多種離子化合物進(jìn)行高選擇性和高效分離的方法，在環(huán)境、法醫(yī)、食品以及生物分析等多個(gè)領(lǐng)域都有應(yīng)用，其原理是根據(jù)樣品在介質(zhì)中的電遷移率不同進(jìn)行分離，具有操作簡(jiǎn)便、快速分析等特點(diǎn)，最常用的是毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE）。將CE與其他分析分離技術(shù)結(jié)合，多用于食品、天然產(chǎn)物等分析中，其中與質(zhì)譜法結(jié)合的分析技術(shù)應(yīng)用最為普遍[18]。

生物胺是一種對(duì)人體具有傷害作用的次級(jí)代謝物，會(huì)在食品的微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生。Ad?mc?lar等[19]將樣品用三氯乙酸水溶液處理、真空過濾后，采用CE-電容耦合非接觸式CE電導(dǎo)檢測(cè)器（C4D）進(jìn)行分析，在分離介質(zhì)pH為2.05時(shí)可以很好地從樣品中分析得到生物胺。Gatea等[20]以0.5 mol/L磷酸、0.5 mmol/L CTAB和15%甲醇為背景電解液（BGE），BGE/水（1∶1）為樣品基質(zhì)，對(duì)益生菌進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，可以得到小鏈脂肪族有機(jī)酸和芳香族有機(jī)酸。

3.2 薄層掃描法

薄層掃描法（TLCS）是采用可見光或紫外線照射經(jīng)薄層層析的薄層色譜板，對(duì)有吸收或能產(chǎn)生熒光或能淬滅熒光的層析斑點(diǎn)掃描，對(duì)掃描的圖譜進(jìn)行定量分析。TLCS操作簡(jiǎn)便、樣品檢測(cè)快速，且檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域中的成分分析[21]。

倪孟祥等[22]應(yīng)用薄層色譜法測(cè)定南極放線菌N-I的代謝產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，得到南極放線菌N-I發(fā)酵液中的抑制劑含量為91.6%，且相對(duì)于高效液相色譜法進(jìn)行初度分析的結(jié)果更為接近事實(shí)。

3.3 色譜法

色譜法在各個(gè)分析領(lǐng)域是重要的分析手段，利用樣品在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的，或利用樣品與流動(dòng)相或固定相之間相互作用的性質(zhì)不同，同時(shí)分離不同種類的分子。常用的色譜法分為氣相色譜法和高效液相色譜法。

3.3.1 氣相色譜法

氣相色譜法是通過將少量樣品快速蒸發(fā)為氣體，與惰性氣體混合流動(dòng)進(jìn)入色譜柱，由于氣相中的各組分在固定相之間的分配系數(shù)不同進(jìn)行分離。該方法具有分辨率高、靈敏度高、樣品用量少、可快速分析的特點(diǎn)，但是操作復(fù)雜，成本高。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的微氣相色譜具有生產(chǎn)和維修成本低、體積小、耗能少等優(yōu)點(diǎn)。

Salmerón等[23]采用頂空氣相色譜法對(duì)乳酸菌發(fā)酵谷物基質(zhì)進(jìn)行分析。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)和蒸發(fā)，收集器收集揮發(fā)性物質(zhì)并提取500 μL的頂空樣品，用檢測(cè)器進(jìn)行分析，得到乳酸菌發(fā)酵物中含有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)乙醛、丙酮和乙酸乙酯等，同時(shí)對(duì)這些揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

3.3.2 高效液相色譜

高效液相色譜（HPLC）是對(duì)混合物或溶解在樣品溶液中的目標(biāo)成分進(jìn)行分析，采用高壓液流將流動(dòng)相從裝有固定相的色譜柱的一端泵入，固定相位于塔底端，另一端與加壓流動(dòng)相相連接，通過流動(dòng)相中目標(biāo)溶質(zhì)分子與其他溶質(zhì)分子分別與固定相的相互作用性質(zhì)的不同進(jìn)行分析。在氣相色譜中不能加熱的物質(zhì)可采用HPLC法分析，其具有高度敏感、高性能等特點(diǎn)，但不適用于某些特定的化合物。例如，Du等人[24]利用HPLC-ESI-MS/MS聯(lián)用技術(shù)可以分析橄欖小單孢菌發(fā)酵過程中氨基環(huán)己醇-氨基糖苷類生產(chǎn)途徑中產(chǎn)生的生物合成同系物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)橄欖枝菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的10種生物合成中間體的同時(shí)分析。

3.4 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法是利用樣品中各成分在被輻照或電離效應(yīng)之后獲得更高的能量變成離子狀態(tài)，該狀態(tài)在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下，可按照質(zhì)荷比的大小進(jìn)行分離，得到的質(zhì)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較即可對(duì)化合物進(jìn)行分析[25]，常與其他技術(shù)聯(lián)用。例如，可與液相色譜法聯(lián)用分析天然產(chǎn)物成分，與氣相色譜聯(lián)用檢測(cè)化合物等，同樣都具有操作簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。李園園等[26]將從土壤中分離純化出的178株放線菌分開進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)于每株放線菌的發(fā)酵液在乙醇提取后通過HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn) 41株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性。

4 結(jié)語

天然產(chǎn)物占所有治療性化合物的1/3～2/3，這些天然產(chǎn)物從自然界分離出來，部分被直接作為產(chǎn)品使用，部分作為半合成衍生物使用，并且其中約35%來源于微生物。所以微生物天然產(chǎn)物仍然是天然產(chǎn)品的重要來源，然而海洋、兩極中的低溫微生物往往被人類忽視。在天然產(chǎn)物的潛在來源中，細(xì)菌已被證明是重要來源[27]。此外，在海洋真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣化報(bào)道中，已發(fā)現(xiàn)100多種真菌可以代謝出用于藥物生產(chǎn)的活性物質(zhì)。但真正用于生產(chǎn)實(shí)踐的低溫微生物資源很少，因此加大開發(fā)與利用低溫微生物資源對(duì)人類社會(huì)的發(fā)展有積極的意義。