馬躍新，聶根宇,李維莉*

(1．昆明市食品藥品檢驗所 藥品檢驗中心，云南 昆明 650032；2.昆明學院 化學化工學院，云南 昆明 650214)

滇金銀花(FloraLoniceraebournei)為忍冬科植物西南忍冬(LonicereibourneiHemsl.)的干燥花蕾或帶初開的花，在云南常作為藥用金銀花的地方習用品，收載于2005年版《云南省中藥飲片標準：第7冊》．該藥材在《全國中草藥匯編》中稱為“短唇忍冬”，在《云南中藥資源名錄》中稱為“西南忍冬”，為了與2015年版《中華人民共和國藥典：一部》[1]收載的“金銀花”區(qū)別，將該藥材名稱確定為“滇金銀花”．滇金銀花主要產(chǎn)于云南省的峨山、雙柏、建水、思茅、勐臘等地．2005年版《云南省中藥材標準：第7冊》[2]顯示，滇金銀花中主要含有綠原酸等酚性成分、木犀草素和金絲桃苷等黃酮成分，以及三萜皂苷、揮發(fā)油等．目前，使用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸的含量已有許多報道[3-6]，但對滇金銀花含量測定的報道卻較少．因此，本研究嘗試建立反相高效液相色譜法測定滇金銀花中綠原酸含量的方法，以期為評價滇金銀花的質(zhì)量提供科學依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藥材

滇金銀花3批(批號：160901；170802；161101)，經(jīng)檢驗均為滇金銀花．

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，帶紫外檢測器(美國安捷倫公司)；MS205DU電子天平(梅特勒公司，1/100 000)，AL204電子天平(梅特勒公司，1/10 000)；DFY-200高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；KQ 5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CHORUS超純水系統(tǒng)(英國ELGA公司)．

1.3 試藥與試劑

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201716)；乙腈(德國默克集團，批號：JA054230，色譜純)；磷酸(四川西隴化工有限公司，批號：170512，分析純)；甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170712，分析純)；水為GB/T 6682中規(guī)定的一級水．

1.4 實驗方法

1.4.1 對照品儲備溶液的制備

精密稱取綠原酸 25.00 mg，置 50 mL 棕色容量瓶，加50%甲醇制成每 1 mL 含 500 μg 的溶液，即得對照品儲備溶液．

1.4.2 供試品溶液的制備

取過4號篩的該藥材粉末 0.5 g，精密稱定其質(zhì)量，平行取樣2份，準確加入50%甲醇溶液 100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 30 min，放置至室溫，稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，準確吸取續(xù)濾液 5 mL，置于 25 mL 的棕色量瓶，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液．

1.4.3 液相條件

色譜柱為Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測器，檢測波長 327 nm，流動相為V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90，流速 1.0 mL/min，柱溫 40 ℃，進樣量 10 μL．對照品溶液色譜圖如圖1，供試品溶液色譜圖如圖2．

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性考察

將制備好的供試品溶液與對照品溶液按1.4.3項下條件注入液相色譜儀進行系統(tǒng)適用性考察，結(jié)果理論板數(shù)均大于 8 000，供試品中主色譜峰綠原酸與前后雜峰的分離度均大于3.0．

2.2 線性關(guān)系考察

分別取1.4.1項下制備的對照品儲備溶液0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，20.00 mL 至 100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，100.00 μg/mL 系列標準溶液．按1.4.3項下條件進樣，然后以峰面積A為縱坐標，以綠原酸含量C為橫坐標，繪制標準曲線圖(圖3)，回歸方程為A=14.583 83C+4.978 55，R=0.999 90．

2.3 檢出限及定量限考察

2.3.1 儀器檢出限和定量限考察

取對照品溶液(質(zhì)量濃度 5.00 μg/mL)分別稀釋至信號/噪音比為S/N=1∶3和S/N=1∶10時，通過計算得到儀器所對應的檢出限為 0.051 7 μg/mL，定量限為 0.164 μg/mL．

圖3 綠原酸標準曲線

2.3.2 方法檢出限和定量限考察

取供試品溶液(批號160901)分別稀釋至信號/噪音比為為1∶3和1∶10時，計算得到方法檢出限為 0.053 8 μg/mL，定量限為 0.182 μg/mL．

2.4 重復性實驗

取滇金銀花(批號160901)，按樣品制備條件1.4.2制備的供試品溶液，平行制備6份，代入標準曲線得到供試品質(zhì)量濃度，供試品中綠原酸的RSD為0.09%，結(jié)果見表1．

表1 重復性實驗結(jié)果

由上述實驗得出RSD小于2.0%，說明該方法的重復性良好．

2.5 精密度考察

系列標準溶液與對照品溶液4(即質(zhì)量濃度 40 μg/mL)，連續(xù)進樣6次，測定，代入標準曲線得到供試品質(zhì)量濃度，計算得到RSD為0.07%，結(jié)果見表2．

表2 精密度實驗結(jié)果

由上述實驗得出RSD小于2.0%，說明該實驗有較好的精密度．

2.6 穩(wěn)定性實驗

2.6.1 時間穩(wěn)定性考察

系列標準溶液與供試品溶液(批號160901)分別在0，12，24，48，72，96 h 進樣分析，以所得標準曲線計算質(zhì)量濃度，并計算平均質(zhì)量濃度與RSD，得到供試品中綠原酸的RSD為1.1%，結(jié)果見表3．

由上述實驗得出RSD小于2.0%，說明供試品溶液在 96 h 內(nèi)穩(wěn)定．

2.6.2 柱溫穩(wěn)定性考察

系列標準溶液與供試品溶液(批號160901)分別在柱溫為20，30，40 ℃ 進樣分析，每次平行進樣4次，以所得標準曲線計算所得質(zhì)量濃度，并計算平均質(zhì)量濃度和RSD，得到供試品中綠原酸的RSD為1.2%，結(jié)果見表4．

表3 時間穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表4 柱溫穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由上述實驗得出RSD小于2.0%，說明供試品溶液測定柱溫在20～40 ℃ 的測定結(jié)果穩(wěn)定．

2.7 回收率實驗

精密稱取1份已知含量的滇金銀花粉末樣品 0.50 g，加入適量綠原酸對照品，按樣品制備方法操作，制成含對照品 25 μg/mL 的加標溶液，進行分析，結(jié)果代入標準曲線計算質(zhì)量濃度，依次計算回收率．使用樣品(批號160901)制備加標溶液6份，同時平行制備樣品溶液．得到平均回收率為101.1%，RSD為0.3%，結(jié)果見表5．

2.8 樣品含量測定

精密稱取每批滇金銀花粉末樣品各兩份，每份 0.5 g，按樣品制備方法分別制備供試品溶液，每份進樣測定2次，計算樣品的平均含量，結(jié)果見表6．

表5 回收率實驗結(jié)果

表6 樣品含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

因綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基，遇光很不穩(wěn)定，考慮到該因素，綠原酸對照品溶液及供試品溶液用棕色的容量瓶盛放，以保證測定結(jié)果的準確性與穩(wěn)定性．

本實驗對提取溶劑選擇時，比較了乙醇、甲醇、50%乙醇溶液和50%甲醇溶液，最后選擇峰形和提取率更好的50%甲醇溶液．

在綠原酸含量測定的過程中，對供試品溶液的制備方法進行比較，最終選取最佳方案為加入50%的甲醇溶液進行超聲處理(功率 250 W，頻率 35 kHz)30 min．對流動相和檢測波長的選擇，經(jīng)比較認為以V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90為流動相峰形及分離度效果最好，檢測波長在 327 nm 處各色譜峰之間分離效果最佳．

在系統(tǒng)適用性實驗中，通過在不同品牌液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾液相、島津液相)條件下測定綠原酸的理論塔板數(shù)與分離度，所得結(jié)果理論塔板數(shù)均大于 8 000，分離度均大于1.5，滿足文獻[1]中的標準要求．

樣品的生長環(huán)境、采收時間、儲存條件等因素均可能影響到滇金銀花中綠原酸的含量，這可能是造成表6中樣品含量差異較大的原因之一．

本實驗結(jié)果表明，重復性RSD為0.09%，精密度RSD為0.07%，回收率RSD為0.3%，說明采用反相高效液相色譜法測定滇金銀花中主要成分綠原酸的含量，方法操作簡單、穩(wěn)定、精確，可為評價滇金銀花的質(zhì)量提供參考依據(jù)．