賀凌煜，朱文勇，楊麗源，廖國陽

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650599；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneu?monia，CAP）最常見的病因之一，它與很多呼吸道感染性疾病有關(guān)，如支氣管炎、肺炎，還可誘發(fā)哮喘等疾病[1]。肺炎支原體肺炎（MP pneumonia，MPP）通常被稱為“行走性肺炎”，預(yù)后良好[2]。在肺炎支原體大流行期間，兒童和老人是易感人群，成人MPP 的發(fā)生率為社區(qū)獲得性細菌性肺炎的4%～8%，在流行期分別增加了20%和70%[3-5]。盡管在感染預(yù)防和抗菌藥物方面取得了重大進展，肺炎仍然導(dǎo)致顯著的死亡率，世界衛(wèi)生組織估計，下呼吸道感染是世界上最常見的死亡傳染病原因，每年有近350 萬人死亡。MP 感染的總體死亡率較低，但文獻報道由MPP 導(dǎo)致進入ICU 病房的患者死亡率高達30%，尤其是老年人[6]。MP感染的患病率被廣泛低估，因為大多數(shù)感染MP的患者很少有癥狀而尋求醫(yī)療，并且由于其假定的良性性質(zhì)，缺乏具有良好敏感性和特異性的診斷測試，因此在很大程度上仍然未被診斷[7-9]。由于缺乏用于檢測這種非典型呼吸道病原體的標(biāo)準(zhǔn)化、敏感和特異性的方法[10]，大多數(shù)采用經(jīng)驗診斷及治療[11]。然而，目前肺炎支原體出現(xiàn)了大面積耐藥現(xiàn)象[12]，因此，選擇一種快速、靈敏、特異的檢測方法特別重要[13]。

1 肺炎支原體檢測方法

肺炎支原體目前的檢測常用方法有物理學(xué)檢測、培養(yǎng)法檢測、抗原檢測、血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等。

1.1 物理學(xué)檢測

支原體肺炎的癥狀和診斷是多方面的，會伴隨著發(fā)熱、心動過緩[14]?；颊叩穆犜\可以顯示出晚期吸氣性噼啪聲或正常肺泡聲，然而，由于毛細支氣管炎，有時可以聽到雙側(cè)和弦喘息[15]。放射學(xué)檢查結(jié)果被歸類為鞏固組（腦葉或節(jié)段性鞏固）和非鞏固組（斑片狀浸潤，局部網(wǎng)狀結(jié)節(jié)浸潤或肺門旁支氣管浸潤）。Cho 等[15]認為在年齡較大的兒童中經(jīng)常觀察到鞏固性病變，并且與更嚴(yán)重的臨床特征相關(guān)。Tomoo 等[16]發(fā)現(xiàn)在成人病例中很少觀察到胸腔積液，與免疫功能低下的患者相比，免疫功能正常的患者傾向于顯示更廣泛的陰影，由于血清學(xué)診斷方法無法提供100%可靠的診斷，因此物理和放射檢查的整合對于準(zhǔn)確診斷支原體肺炎至關(guān)重要。

1.2 培養(yǎng)法檢測

培養(yǎng)法實驗室是指將病人的咽試紙或痰樣在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分別經(jīng)過0.45 與0.22 μm的濾膜，最后如果得到澄清透亮的菌體則為肺炎支原體，但周期較長，一般最少需要1 周時間[17]。醫(yī)院一般會取樣涂皿，顯微鏡下觀察是否會出現(xiàn)油煎蛋狀的菌體，周期至少為1 周[18]。肺炎支原體感染的黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)被認為是轉(zhuǎn)換或升高的IgG 滴度，但抗體結(jié)果對兒童的年齡和免疫狀態(tài)敏感，特別是難以獲得恢復(fù)期血清[19]。有研究表明，口咽部若存在耐藥菌或多重耐藥菌以及對某些抗生素有天然耐藥機制的細菌時，會造成肺炎支原體快速培養(yǎng)法檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[20]。

1.3 抗原檢測

肺炎支原體抗原檢測方法目前有ELISA 定量、免疫層析法、抗體-捕獲酶-免疫測定法（Ag-EIA）、量子點標(biāo)記抗體檢測抗原。Miyashita 等[21]研究發(fā)現(xiàn)一種商業(yè)快速抗原試劑盒（日本東京旭化成制藥公司）的診斷靈敏度僅為實時PCR 的60%。之后，Li 等[22]采用膠體金免疫層析法，以p1基因為靶點快速診斷肺炎支原體，并與實時PCR做比較，發(fā)現(xiàn)實時PCR 中的雙標(biāo)本陽性為陰性，膠體金分析的特異性和靈敏度分別為100%和97.4%，從而證明新開發(fā)的免疫層析抗原檢測方法是鑒定肺炎支原體的一種快速、靈敏、特異的方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，可用于肺炎支原體感染的早期診斷。Onari 等[23]使用PA 抗體和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）作為金標(biāo)準(zhǔn)評估，發(fā)現(xiàn)免疫層析法測試的靈敏度更高。Namkoong 等[24]使用照相顯影增加免疫色譜測定靈敏度的新型銀擴增免疫層析（SAI）系統(tǒng)，評估了快速肺炎支原體診斷系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)它能夠以較低的抗原濃度檢測所有測試樣品，并且與其他病原體無交叉反應(yīng)。與實時PCR 相比，該系統(tǒng)具有90.4%的靈敏度和100.0%的特異性；與LAMP 方法相比，該結(jié)果還證明了該系統(tǒng)的高性能，靈敏度為93.0%，特異性為100.0%。SAI 系統(tǒng)使用專用設(shè)備進行自動分析和讀取，使其具有高度客觀性，并且只需較少的人力，從而支持其在臨床環(huán)境中的實用性?？乖东@雖然不如PCR 敏感，但它的優(yōu)勢在于，不需要嚴(yán)格的實驗室操作即可避免假陽性結(jié)果[25]。量子點標(biāo)記抗體檢測抗原的方法操作簡單、快速，適用于早期的肺炎支原體診斷[26]。ELISA 抗原檢測具有快速簡單高效的特點[27]，但是本科室使用購買的產(chǎn)品交叉反應(yīng)問題很突出。

1.4 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測方法簡單，速度較快，成本較低，是常規(guī)臨床實踐中肺炎支原體診斷的基本策略，已經(jīng)通過靈敏分析檢測不同抗體類別的廣泛可用性得到了改善[28]。但血清學(xué)檢測在感染早期的檢測上存在很大的問題，如靈敏度特別低。目前有補體結(jié)合試驗（CFT）、酶免疫試驗（EIA）、明膠顆粒凝集試驗（PA）、間接免疫熒光抗體法（IFA）、電化學(xué)發(fā)光方法（CLIA）等。其中，PA 操作簡單，但不能準(zhǔn)確鑒別出IgM 抗體；IFA 易受實驗人員的影響；相比之下CLIA 則比較穩(wěn)定[29]。Chen 等[30]比較了 IFA 和 PPA 檢測方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng) MP抗體滴度為±1∶40 時應(yīng)解釋為陰性，PPA 顯示出高特異性。Petitjean 等[31]證實，IgM EIA 血清學(xué)檢測是兒童肺炎支原體感染早期診斷的有效工具，只要使用的EIA 檢測是特異性的。在成人中，對EIA 測試的困難解釋表明，準(zhǔn)確診斷應(yīng)該要求配對血清，結(jié)合對患者入院時收集的呼吸道標(biāo)本的PCR 檢測。檢測肺炎支原體感染的黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)被認為是血清轉(zhuǎn)換或IgG 滴度升高，但抗體結(jié)果對兒童的年齡和免疫狀態(tài)敏感，特別是在兒科醫(yī)院難以獲得恢復(fù)期血清[32]。由于IgM 早于IgG出現(xiàn)，因此血清中IgM 的檢測是早期血清學(xué)診斷肺炎支原體感染的一種廣泛使用的方法，特別是在兒童中[33]。血清學(xué)檢測的靈敏度取決于是否在疾病發(fā)作后早期或晚期收集第一份血清樣本以及配對血清的可用性，因為進行準(zhǔn)確診斷需要配對的血清樣本，在疾病發(fā)作后3～4 周出現(xiàn)滴度上升[34]。即使在恢復(fù)后，血清檢測也會持續(xù)長時間陽性結(jié)果。因此，通常難以僅基于急性期[35]單個血清樣品的抗體滴度進行診斷[36]。Beersma 等[37]用實時PCR 肺炎支原體DNA 檢測作為金標(biāo)準(zhǔn)來評估12 種市售血清學(xué)測定（用于IgG 和IgM）和補體結(jié)合測試（CFT），很少有商業(yè)血清學(xué)檢測用于檢測肺炎支原體感染，在敏感性和特異性方面具有適當(dāng)?shù)男阅?，并且PCR 在確定的患者組中對于診斷肺炎支原體感染變得越來越重要。由于肺炎支原體是季節(jié)性流行病，并且晚期診斷增加了周圍環(huán)境感染的風(fēng)險，因此需要一種快速且實用的改進診斷系統(tǒng)[38]。

1.5 分子生物學(xué)檢測

PCR 是目前直接病原體檢測的首選方法，但一些PCR 相關(guān)方法提供了增強的靈敏度或更方便的處理程序，并已成功用于研究，這些技術(shù)包括實時PCR、巢式PCR、咽拭子樣本的RT-PCR、多重PCR[39]。由于其比培養(yǎng)法更加節(jié)省時間且具有高靈敏度和特異性，因此廣泛用于診斷[40]。Li等[41]用同時擴增和測試肺炎支原體（SAT-MP）的實時方法，通過靶向核糖體RNA 區(qū)域診斷肺炎支原體，并發(fā)現(xiàn)這種方法可以準(zhǔn)確鑒定肺炎支原體，檢測范圍為101～107CFU/mL。這種優(yōu)異的靈敏度可能歸因于相同濃度的肺炎支原體的rRNA水平高于DNA。此外，SAT-MP 的擴增動力學(xué)比PCR 更有效（SAT-MP 一次反應(yīng)可以產(chǎn)生 100 到1000 倍的擴增產(chǎn)物）。SAT-MP 在識別方面也具有理想的特異性。因為肺炎支原體的IgM 沒有出現(xiàn)在感染初期階段，應(yīng)用SAT 等新的快速診斷工具來改善臨床應(yīng)用中的早期診斷和及時治療至關(guān)重要。此外，SAT-MP 檢測只需 2～3 h 即可完成。值得注意的是，SAT-MP 擴增產(chǎn)物也是RNA，這表明實驗室污染和假陽性結(jié)果的風(fēng)險降低[42]。Ratliff 等[40]通過實時 PCR 和 PCR 產(chǎn)物的雙向測序使用LAMP 技術(shù)，例如在致病基因支原體DNA 測定中的LAMP 技術(shù)，證明其是臨床環(huán)境下肺炎支原體實時PCR 的可接受且成本更低的替代品。Huang[43]等從敏感性（SEN）、特異性（SPE）、陰性似然比（-LR）、陽性似然比（+LR）、診斷比值比（DOR）和匯總接受者操作特征（SROC）等方面匯總分析了高水平文獻，最后得出基于核酸序列的擴增是診斷肺炎支原體感染的可靠技術(shù)。

2 結(jié)語

肺炎支原體是臨床上重要的病原體，定期流行[44]。近年來，在肺炎支原體呼吸道感染的診斷方面取得了重大進展，但對于肺炎支原體在呼吸道和其他感染中的作用仍有待深入研究。為了防止進一步傳播到社區(qū)，需要一種快速簡單的診斷工具。通過培養(yǎng)分離或配對血清樣品檢測肺炎支原體需要時間，并且在一般醫(yī)療機構(gòu)中培養(yǎng)物分離是不可行的。分子生物學(xué)方法，例如PCR測試和LAMP 方法需要昂貴的設(shè)備，并且對通常性診斷肺炎支原體感染是不實用的。許多醫(yī)院的PCR 檢測經(jīng)常缺乏適當(dāng)?shù)尿炞C和標(biāo)準(zhǔn)化，質(zhì)量控制研究揭示了常見的缺陷，導(dǎo)致假陰性和假陽性結(jié)果[45]。雖然正確和快速檢測肺炎支原體感染對于開始適當(dāng)?shù)闹委熤陵P(guān)重要，但是所有新開發(fā)的測試必須在應(yīng)用之前進行廣泛驗證。因為，確診肺炎支原體感染在臨床上是具有挑戰(zhàn)性的，僅僅根據(jù)臨床體征和癥狀不可能診斷出這種疾病。因此，最佳診斷工具對于更準(zhǔn)確地診斷和適當(dāng)治療肺炎支原體感染患者并減少濫用抗生素非常重要，需要繼續(xù)進行深入研究。