孟凡飛，史套興，宋倫

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

內(nèi)在的生理活動與外在的行為活動在時(shí)間上與日出日落24 h 的周期相一致的節(jié)律活動叫做晝夜節(jié)律，這種晝夜節(jié)律影響著幾乎所有單細(xì)胞生物、植物和動物。晝夜節(jié)律產(chǎn)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是生物鐘。哺乳動物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），是生物鐘系統(tǒng)的主起搏點(diǎn)[1]，在晝夜節(jié)律的產(chǎn)生、維持和調(diào)控中起主導(dǎo)作用。過去幾十年中，各種研究已表明生物鐘同樣也存在于心、肺、腎、肝、骨骼肌等外周組織器官，稱之為外周生物鐘[2]。外周生物鐘可以受到中樞生物鐘通過神經(jīng)、體液等方式直接或間接的調(diào)控，同時(shí)也能擺脫中樞生物鐘的調(diào)控獨(dú)立運(yùn)行，起到生物鐘系統(tǒng)次起搏點(diǎn)的作用。在自然狀態(tài)下，生物鐘受到光照、溫度、食物以及化學(xué)物質(zhì)刺激等環(huán)境因素的作用影響，生物鐘時(shí)相以及相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生改變，來與外界環(huán)境保持同步。

生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因包括clock（cir?cadian locomotor output cycles kaput）、bmal1（brain and muscle ARNT-like protein 1）、cry2（cryptochrome 2）、per2（period 2）、rev-erbα（nucle?ar receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1）和rorα（RAR-related orphan receptor α）等[3]。其中在生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用的是2 個(gè)PAS-bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員CLOCK 和BMAL1。CLOCK 與BMAL1 形成異二聚體，作用于cry、per、rev-erbα、rorα等靶基因的 E 反應(yīng)元件（E box，CACGTG）并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程[4]。cry基因的表達(dá)產(chǎn)物 CRY（Cryptochrome 1 和 2）和per基因的表達(dá)產(chǎn)物 PER（Period 1、2 和 3）可形成復(fù)合物，隨著蛋白產(chǎn)物的不斷積聚，積累到一定程度時(shí)可作為負(fù)性元件抑制CLOCK-BMAL1 異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制cry和per基因的轉(zhuǎn)錄[5]。同時(shí)CLOCK-BMAL1 異二聚體也可以誘導(dǎo)視黃酸相關(guān)的孤束核受體 REV-ERBα（NR1D1）和 RORα（NR1F1）的表達(dá)，REV-ERBα可以與bmal1啟動子區(qū)結(jié)合阻遏BMAL1 的表達(dá)，RORα可以作為正向調(diào)節(jié)因子促進(jìn)BMAL1 的表達(dá)[6]。

1 骨骼肌中相關(guān)生物鐘基因的表達(dá)

骨骼肌兼負(fù)運(yùn)動、代謝、內(nèi)分泌等多重生理功能，其功能機(jī)制涉及中樞生物鐘的直接調(diào)控與其內(nèi)部自身內(nèi)源性生物鐘的自我調(diào)控。骨骼肌晝夜節(jié)律現(xiàn)象的存在是從大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成存在24 h 的周期性變化中首次發(fā)現(xiàn)的，之后骨骼肌中晝夜節(jié)律的振蕩器被Zylka 等提出[7]。2007年第一個(gè)骨骼肌生理節(jié)律轉(zhuǎn)錄組被Takahashi 提出，在小鼠中有215 個(gè)、大鼠中有107 個(gè)基因的表達(dá)存在晝夜節(jié)律性[8]。這些基因不僅包括在骨骼肌中起主要調(diào)控作用的生物鐘基因bmal1、cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關(guān)的鐘控基因dbp（al?bumin D-site-binding protein）和tef1（thyrotroph embryonic factor 1），同時(shí)也包括與骨骼肌功能相關(guān)的基因myod1（myogenic determination gene 1）等以及與骨骼肌能量代謝相關(guān)的基因pgc-1β（proliferator-activated receptor-γ coactivator 1β）、pdk4（pyruvate dehydrogenase kinase-4）等。

生物鐘基因?qū)趋兰∩砉δ艿恼{(diào)控作用包括肌肉生長和維持、收縮功能、結(jié)構(gòu)組織、葡萄糖代謝和能量生成[9]。利用整體或骨骼肌局部生物鐘基因缺陷技術(shù)構(gòu)建的小鼠模型為我們提供了遺傳學(xué)工具來研究生物鐘基因環(huán)路在骨骼肌中的功能機(jī)制。clock基因缺陷小鼠由于線粒體含量減少、線粒體活力下降以及非正常線粒體數(shù)量增加，表現(xiàn)出了骨骼肌肌力和運(yùn)動耐力的下降，同時(shí)由于肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白表達(dá)的減少造成了骨骼肌結(jié)構(gòu)的變化[10]。有研究表明，BMAL1 是骨骼肌增殖、分化、生肌祖細(xì)胞再生的正向調(diào)控因子。在bmal1基因缺陷小鼠模型中，除了一些晝夜節(jié)律行為和一些節(jié)律代謝活動的改變，還會出現(xiàn)骨骼肌纖維直徑的減小、肌纖維類型的轉(zhuǎn)變、肌節(jié)結(jié)構(gòu)的改變、骨骼肌對胰島素敏感性的降低；bmal1基因缺陷小鼠從8 周齡開始就已經(jīng)表現(xiàn)出骨骼肌重量的降低，同時(shí)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力達(dá)到峰值，在40 周齡時(shí)基因缺陷小鼠不僅表現(xiàn)出壽命的降低，同時(shí)骨骼肌重量也出現(xiàn)降低，低至正常小鼠骨骼肌重量的一半[11]。rev-erbα基因缺陷的小鼠會影響骨骼肌細(xì)胞的分化，出現(xiàn)糖脂代謝平衡的紊亂，同時(shí)由于線粒體活性的下降和骨骼肌內(nèi)自噬反應(yīng)的增強(qiáng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌運(yùn)動能力減弱[12-14]。

2 生物鐘基因?qū)趋兰∩⌒纬傻恼{(diào)控

骨骼肌是胚胎發(fā)育過程中最早形成的組織之一，是由體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過增殖、遷移、分化而形成。構(gòu)成骨骼肌的基本單位是肌纖維，肌纖維的類型、直徑、密度、肌節(jié)長度等都決定了骨骼肌的收縮力度、運(yùn)動耐力等生理功能。生肌決定因子（myogenic determination gene，MyoD）在骨骼肌的生長發(fā)育過程中起到了決定作用[15]。生肌決定因子家族不僅與哺乳動物胚胎期肌細(xì)胞的增殖、分化、融合、肌纖維數(shù)量和體積的增大有關(guān)，還可以激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為骨骼肌細(xì)胞。MyoD 家族主要包括4 個(gè)成員，分別是生肌決定因子（MyoD）、肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子 6（Myf6）[16]。

生物鐘基因?qū)趋兰〗Y(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控機(jī)制之一是BMAL1/CLOCK 異二聚體作用于myod1啟動子區(qū)E 盒（E-box），從而介導(dǎo)了myod1的節(jié)律性振蕩表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，盡管MyoD1 在野生型小鼠骨骼肌中呈現(xiàn)振蕩表達(dá)，但這種振蕩表達(dá)在clock以及bmal1基因缺陷小鼠中均消失。然而，在clock和bmal1基因缺陷小鼠中雖然MyoD1 的振蕩表達(dá)受到影響，但表型上骨骼肌的生肌形成過程是正常的，這就說明存在某種相應(yīng)的補(bǔ)償機(jī)制，這種補(bǔ)償機(jī)制很可能是其他的生肌調(diào)節(jié)因子例如Myf5 發(fā)揮了補(bǔ)償作用[17-18]。在馬和斑馬魚的骨骼肌中，Myf6（Mrf4）的表達(dá)是隨著BMAL1 和CLOCK 表達(dá)時(shí)相的變化而變化的，這說明其他的生肌調(diào)節(jié)因子也可能直接受到生物鐘基因的調(diào)控,對骨骼肌生肌過程產(chǎn)生影響。

BMAL1/CLOCK 異二聚體除了直接調(diào)控MyoD1 的表達(dá)，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)BMAL1 通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Wnt 信號通路中的關(guān)鍵因子來調(diào)控成肌細(xì)胞的分化。事實(shí)上bmal1基因缺陷小鼠在受到例如凍傷等創(chuàng)傷后，出現(xiàn)骨骼肌再生缺陷和骨骼肌修復(fù)的減弱，肌衛(wèi)星細(xì)胞開始增殖分化，但肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，這其中部分是由于BMAL1 表達(dá)的抑制造成Wnt 信號通路中關(guān)鍵因子表達(dá)的抑制。在bmal1基因缺陷小鼠的成肌細(xì)胞中，通過激活Wnt 信號通路的表達(dá)活性可以部分恢復(fù)成肌細(xì)胞的分化。這說明在胚胎形成過程中，Wnt 信號通路對骨骼肌細(xì)胞分化起到了一定作用。

在成肌細(xì)胞分化過程中BMAL1 表達(dá)不斷增加，在成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期并分化時(shí)BMAL1 的阻遏物REV-ERBα的表達(dá)就會受到抑制[19]。在小鼠C2C12 肌源性細(xì)胞系中，過表達(dá)REV-ERBα可以抑制成肌細(xì)胞的分化，MyoD1、MyoG 及肌節(jié)細(xì)胞中的α肌動蛋白的表達(dá)受到抑制。與此同時(shí)，RORα 結(jié)合與 REV-ERBα 相同的基因啟 動子序列，激活靶基因的表達(dá)[20]。因此，REV-ERBα 與RORα都在肌源性分化過程中發(fā)揮重要作用。

一旦細(xì)胞進(jìn)入生肌形成過程，都會發(fā)生分化、融合并表達(dá)肌球蛋白等特異性功能蛋白。生物鐘基因?qū)Τ杉〖?xì)胞的融合以及對骨骼肌功能的影響報(bào)道較少。McCarthy 等已經(jīng)證明了編碼骨骼肌收縮基因的表達(dá)蛋白是具有晝夜節(jié)律的，其中某些基因編碼因子如肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白在clock基因缺陷小鼠中是明顯下調(diào)的[21]。鐘基因在骨骼肌纖維形成與轉(zhuǎn)化以及收縮功能的建立等方面的貢獻(xiàn)仍須深入研究。

3 生物鐘基因?qū)趋兰∧芰看x的調(diào)控

生物鐘基因可以調(diào)控機(jī)體內(nèi)的能量代謝過程，生物節(jié)律的紊亂往往對這一調(diào)控過程產(chǎn)生影響，造成機(jī)體內(nèi)能量代謝自穩(wěn)態(tài)的失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗等相應(yīng)癥狀的出現(xiàn)。在哺乳動物中，骨骼肌是糖脂代謝的主要器官，生物鐘對骨骼肌能量代謝的調(diào)控是機(jī)體能量代謝反應(yīng)的重要組成部分。生物鐘基因缺陷動物模型會出現(xiàn)骨骼肌能量代謝的紊亂。骨骼肌氧化分解碳水化合物和脂肪酸的過程也存在晝夜節(jié)律性，同時(shí)在培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)葡萄糖的攝取也存在晝夜節(jié)律[22]。bmal1和clock基因缺陷小鼠的葡萄糖和脂質(zhì)晝夜節(jié)律性變化消失。clock基因缺陷小鼠長期飼養(yǎng)后會出現(xiàn)肥胖、高血糖的表現(xiàn)[23]。此外，bmal1、per1/2雙缺陷小鼠和cry1/2雙缺陷小鼠會出現(xiàn)葡萄糖不耐癥[24-25]。

組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirtuin-1（Sirt1）在培養(yǎng)的肌管細(xì)胞中可調(diào)節(jié)葡萄糖氧化和脂肪酸氧化反應(yīng)[26]。CLOCK∶BMAL1 異二聚體上調(diào)NAMPT的表達(dá)，NAMPT 可介導(dǎo)NAD+的合成并表現(xiàn)出節(jié)律性。由于NAD+是Sirt1 的重要輔助因子，因此NAD+介導(dǎo)了Sirt1 活性的晝夜節(jié)律變化[27]。Sirt1通過使BMAL1 去乙?；?，降低了CLOCK∶BMAL1異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性，從而使其靶基因表達(dá)受抑。另外，Sirt1 可使PER2 去乙酰化并促進(jìn)其降解[28]。因此，Sirt1 是將鐘基因與骨骼肌能量代謝聯(lián)系起來的一個(gè)關(guān)鍵因子。LKB1（肝激酶B1）在AMP/ATP 比增加時(shí)激活A(yù)MPK 能量代謝通路。AMPK 通過誘導(dǎo)Sirt1 的去乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性介導(dǎo)PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活劑1α）的去乙?；?，而PGC-1α是調(diào)節(jié)骨骼肌中線粒體的合成與氧化呼吸的關(guān)鍵信號分子[29]。不同環(huán)境刺激（例如運(yùn)動或禁食/進(jìn)食）都可以通過調(diào)節(jié)骨骼肌中AMP/ATP 和NAD+/NADH 的比例分別控制AMPK 和Sirt1 的活性，進(jìn)而通過靶向PGC-1α調(diào)節(jié)骨骼肌中的線粒體活性并對骨骼肌能量代謝產(chǎn)生影響[30]。

晝夜節(jié)律抑制性基因rev-erbα在骨骼肌的能量代謝過程中同樣發(fā)揮重要作用。在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)rev-erbα在氧化纖維中高表達(dá)并通過抑制線粒體自噬來促進(jìn)骨骼肌的氧化能力[31]。作為配體依賴性核受體，REV-ERBα可受合成的配體調(diào)節(jié)，REV-ERBα的合成激動劑在小鼠中表現(xiàn)出抗肥胖和降脂功效。通過合成激動劑激活REV-ERBα可以誘導(dǎo)脂肪酸氧化，抑制骨骼肌中的脂質(zhì)合成基因，REV-ERBα可能在體內(nèi)起到降脂的重要作用[32]。研究表明REV-ERBα可以促進(jìn)葡萄糖的優(yōu)先使用，減少脂質(zhì)的利用，rev-erbα基因缺陷小鼠表現(xiàn)出輕度高血糖癥和脂肪酸利用增加[12]。

4 結(jié)語

目前生物鐘基因?qū)趋兰≈猩⌒纬珊湍芰看x的調(diào)控已經(jīng)得到眾多研究者的認(rèn)同，但研究方向大都集中在BMAL1∶CLOCK 異二聚體的調(diào)控作用，對于骨骼肌中表達(dá)的其他生物鐘基因cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關(guān)鐘控基因dbp和tef1的研究相對較少?；谏镧娀?qū)ι⌒纬珊湍芰看x的研究，我們可以設(shè)想這些鐘基因及鐘控基因可以獨(dú)立抑或與BMAL1∶CLOCK 異二聚體共同發(fā)揮重要的調(diào)控作用，構(gòu)成生物鐘基因?qū)趋兰〉恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，機(jī)體的能量代謝也是在骨骼肌、肝臟、脂肪等產(chǎn)能器官相互協(xié)同作用下進(jìn)行，我們是否可以找尋作為產(chǎn)能器官的外周生物鐘與SCN 中樞生物鐘之間的關(guān)系，建立起在生物鐘主導(dǎo)下的全身能量代謝網(wǎng)絡(luò)，從而更全面地分析生物鐘對機(jī)體能量代謝的調(diào)控。另一方面，人體長期處于睡眠剝奪狀態(tài)或睡眠時(shí)間不規(guī)律都會造成人體節(jié)律紊亂，引起生物鐘基因在骨骼肌中表達(dá)的改變，從而對骨骼肌生理運(yùn)動功能以及能量代謝造成影響，進(jìn)而降低人體作業(yè)能力。生物鐘基因調(diào)控的生肌調(diào)節(jié)因子和糖脂代謝的關(guān)鍵酶可以作為未來改善睡眠節(jié)律紊亂造成的作業(yè)能力下降的潛在作用靶點(diǎn)，相關(guān)干預(yù)藥物的研發(fā)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。