紀(jì)藝,陳笑蕓,丁霖,汪小福,彭城,徐曉麗,徐俊鋒

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所， 杭州 310021

近年來，肉類摻假問題成為食品安全熱點(diǎn)話題之一，肉類及肉制品摻假是指用成本更低的其他肉類或植物蛋白質(zhì)來部分或全部替代生肉及肉制品[1-4]。由于馬肉的價(jià)格是牛肉的三分之一，2013年，英國、法國等在內(nèi)的部分歐盟國家的一些不法商販將馬肉摻入到牛肉中進(jìn)行售賣[5]；由于狐貍?cè)獗旧泶嬖诋愇?，價(jià)格較為低廉，但經(jīng)處理后，可脫去其臭味，2013年年底，我國國內(nèi)媒體曝光沃爾瑪在售的“五香驢肉”被檢出狐貍?cè)鈁6]。肉類摻假不僅侵害了消費(fèi)者的利益，也存在諸多食品安全隱患。因此，亟需溯源肉類及肉制品中的動(dòng)物源性成分，確定肉類成分的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，向消費(fèi)者提供肉類及肉制品的清晰、可靠的信息[7]。

如今，對動(dòng)物源性成分分析的研究及相應(yīng)的鑒別方法逐漸增多。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法主要是通過感官辨別、顯微鏡法以及比色法等鑒別不同肉類[8-9]，也可通過化學(xué)方法檢驗(yàn)不同動(dòng)物種類糖原結(jié)合肌內(nèi)脂肪、脂肪中的亞油酸、胡蘿卜素、脂肪的折射率以及碘含量等進(jìn)行綜合判斷[8]。隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，因免疫學(xué)方法可精準(zhǔn)地確定動(dòng)物源而在肉類成分鑒別中更多地出現(xiàn)[10]。其中，通過免疫測定獲得定量數(shù)據(jù)的最佳方法是微孔板ELISA，它適用于高精度定量靶標(biāo)表征[11-12]。隨著實(shí)際應(yīng)用對檢測技術(shù)的要求逐漸提高，基于核酸鑒定和定量動(dòng)物源性成分的方法發(fā)展起來[13]，研究證明基于核酸的肉類鑒定是準(zhǔn)確、快速且敏感的[14]。Cai等[15]開發(fā)了一種基于實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的測定法，并且設(shè)計(jì)了對豬基因具有高度選擇性的引物，用于檢測肉制品中豬源成分。此方法僅需20 min，是在商業(yè)產(chǎn)品中使用實(shí)時(shí)LAMP測定法檢測豬源成分的首次嘗試。Ren等[16]開發(fā)了一種新的基于微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)的檢測方法，用于定量測定綿羊和山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量，并引入常數(shù)(乘法因子)以將拷貝數(shù)的比例轉(zhuǎn)換為肉的比例?？梢?，高效、精準(zhǔn)的檢測方法有助于鑒別食品工業(yè)中的摻假行為?；诖?，本文對肉類及肉制品中動(dòng)物源性成分檢測及鑒別的不同研究方法進(jìn)行介紹，并分析個(gè)中利弊，最后對此領(lǐng)域的后續(xù)研發(fā)方向進(jìn)行展望，以期為肉類及肉制品的安全監(jiān)控、檢測以及溯源提供一定的參考。

1 傳統(tǒng)鑒別方法

早期人們通過感官來鑒別動(dòng)物肉的種類。如豬肉及其脂肪的物理特征(包括顏色、質(zhì)地和氣味等)不同于其他肉類，豬肉顯示出柔軟的稠度、略帶腥味以及高比例的肌內(nèi)脂肪，這些表象屬性可用于豬肉的感官識別[17]。此外，屬于物理鑒別方法的還有鏡檢法，是唯一一個(gè)被歐盟認(rèn)可的檢測肉制品中動(dòng)物源性成分的官方方法[17]。鏡檢法可以通過對哺乳動(dòng)物、禽類和魚類等的肉質(zhì)進(jìn)行觀察并予以區(qū)分，但不能進(jìn)一步鑒別具體的種類。此外，也可以通過不同動(dòng)物種類之間的糖原含量、碘值等化學(xué)參數(shù)來區(qū)分動(dòng)物源。如將豬肉和其他肉類進(jìn)行區(qū)分的另一個(gè)因素是豬肉的高折射率(index of refraction，RI)(馬肉除外，馬肉RI值與豬肉相同)[18]；王新來[19]利用理化學(xué)鑒別的方法，通過測定脂肪溶解度以及糖原的定性反應(yīng)成功鑒別牛、馬肉。這些傳統(tǒng)的鑒別方法雖然可以得到鑒別結(jié)果，但是在實(shí)際應(yīng)用中卻存在許多限制因素：耗時(shí)長、靈敏度低，而且，肉糜類產(chǎn)品相對較難通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)[19-21]。

2 免疫學(xué)鑒別方法

免疫學(xué)方法因可精準(zhǔn)地確定動(dòng)物源而被應(yīng)用于肉類成分鑒別中，如利用試管沉淀法、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散法均能夠鑒別動(dòng)物肉類源性成分[10]。李景鵬和張玉樹[22]利用對流免疫電泳、瓊脂凝膠擴(kuò)散和環(huán)狀沉淀反應(yīng)3種方法對馬肉、牛肉以及其混合肉(共87份樣品)進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明這3種方法均可精準(zhǔn)地鑒別出其動(dòng)物源，但是大部分方法耗時(shí)較長，且無法進(jìn)行有效的定量分析。除耗時(shí)較長外，上述方法無法檢測出熱處理后的蛋白質(zhì)[10,23-24]，而大部分市售的肉制品均是被高溫處理過的，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。

免疫學(xué)檢測方法中另一具有代表性的是基于抗原-抗體特異性識別的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)，其利用酶來檢測樣品中抗體或抗原的存在，具有特異性、簡便性和敏感性等特點(diǎn)，近年來在動(dòng)物源性成分鑒別中得到廣泛的應(yīng)用[25-26]。Mandi等[27]開發(fā)了ELISA/免疫傳感器(包括直接免疫傳感器和競爭性免疫傳感器兩種形式的ELISA)用于檢測肉類摻假情況。與競爭性ELISA(在45 min內(nèi)確定0.1%的摻假水平)相比，直接ELISA能夠在14 h 15 min內(nèi)檢測出牛肉中0.01%的低摻假水平的豬肉。使用直接免疫傳感器，可以在2 h內(nèi)檢測到0.1%的豬肉摻假；而使用競爭性免疫傳感器，僅20 min即可檢測到低水平的豬肉摻假(0.01%)。研發(fā)的免疫傳感器可有效檢測加工食品中的豬肉免疫球蛋白(IgG)，并且可以在1%～100%的研究范圍內(nèi)檢測煮熟后牛肉丸中的豬肉，并已成功應(yīng)用于物種(雞、羊肉、火雞)篩選測試。2種競爭性免疫測定均顯示出高靈敏度、良好的特異性、簡便性和低成本等優(yōu)點(diǎn)，因此適用于食品認(rèn)證[28-30]。此外，多克隆抗體和單克隆抗體均可用于ELISA方法中進(jìn)行源性成分鑒定。多克隆抗體具有許多優(yōu)點(diǎn)，如識別抗原不同表位的混合物，對抗原性質(zhì)的微小變化(如聚合或輕微變性)具有更大的耐受性，因此是檢測變性蛋白質(zhì)的首選，但同時(shí)也存在局限性，如親和力可變、產(chǎn)量受限以及需要大量純化程序以消除針對特定物種鑒定的交叉反應(yīng)性[31]。

3 基于光譜的檢測方法

光譜技術(shù)是近年來常用于檢測肉品新鮮度的方法，具有無損、快速得出結(jié)果等特點(diǎn)。基于光譜的檢測方法包括近紅外光譜(near infrared spectrum instrument，NIRS)法、拉曼光譜檢測(raman spectra，RS)法和傅里葉近紅外光譜等，其中，近紅外光譜可以對肉類質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行估算并用于檢測肉類是否摻假，操作簡便、檢測速度快，是一種經(jīng)濟(jì)高效的方法[32]。許多研究將近紅外光譜和偏最小二乘法(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)算法結(jié)合進(jìn)行肉類檢驗(yàn)。如白京等[33]運(yùn)用近紅外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量法對牛肉漢堡中是否摻假豬肉進(jìn)行鑒別，研究表明，利用支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)和PLS-DA算法可進(jìn)行定性鑒別，且后者效果較好，而利用最小二乘回歸法(partial least squares regression regression，PLSR)算法可進(jìn)行摻假比例的定量檢測，獲得了目標(biāo)結(jié)果。Parastara等[34]通過將便攜手持式近紅外光譜技術(shù)與最新的分類算法相結(jié)合，開發(fā)了一種可用于鑒別雞肉真實(shí)性的方法。結(jié)果顯示，基于近紅外光譜從凍融的肉中區(qū)分出新鮮的肉，而且可以根據(jù)雞的生長條件對雞柳進(jìn)行正確分類。這說明手持式NIR結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法是一種有用、快速、無損的工具，可以識別雞肉摻假情況。通過測量NIR光譜，為消費(fèi)者和食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)展示了檢查包裝雞柳的真實(shí)性和來源的可能性[35]。Ainara等[36]通過研究結(jié)合化學(xué)計(jì)量技術(shù)的近紅外光譜的可行性，來檢測切碎的羊肉和牛肉與其他類型肉類混合的摻假行為，該研究準(zhǔn)備了不同占比的純羊肉和純牛肉樣品以及混合牛羊肉樣品，使用不同的技術(shù)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)進(jìn)行探索，以找出純樣品和混合樣品之間的差異。此外，對每種類型的肉混合物進(jìn)行PLS-DA，最終獲得較好的分類率。這項(xiàng)研究顯示了將NIRS與PLS-DA結(jié)合使用來檢測碎羊肉和牛肉中摻假情況的可能性。光譜技術(shù)具有很多優(yōu)勢，如準(zhǔn)確度高、檢測速度快等[37-39]，但是對于不同的樣品，需建立相對應(yīng)的模型，并且需要一個(gè)相對龐大的數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維及提取信息等操作較為繁瑣[40-42]。

4 基于核酸的鑒別方法

隨著實(shí)際應(yīng)用中對鑒別技術(shù)的要求不斷提高，基于核酸的檢測技術(shù)正在迅速發(fā)展，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，其中PCR又可分為實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)字PCR技術(shù)等。以核酸為基礎(chǔ)來鑒別肉及肉制品是否摻假，避免了由于食品加工出現(xiàn)的檢測誤差，穩(wěn)定性較高，檢測更準(zhǔn)確，靈敏度更高[9]。

4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

全球食品研究越來越重視肉類現(xiàn)場真?zhèn)螜z測，所以在實(shí)際檢測中，準(zhǔn)確并且有效地進(jìn)行現(xiàn)場檢測過程至關(guān)重要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)由Notomi等[43]于2000年首次開發(fā)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以在恒定溫度下以高特異性和靈敏度來快速、有效地?cái)U(kuò)增目的片段。LAMP方法中沒有DNA變性步驟，因此不需要復(fù)雜的溫度控制設(shè)備，從而使核酸擴(kuò)增過程擺脫了精密儀器的束縛，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要，花費(fèi)時(shí)間短，具有鑒定物種真實(shí)性的絕佳前景[1]。Abdulmawjood等[44]開發(fā)了一種基于非洲鴕鳥線粒體DNA的細(xì)胞色素b基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分析方法，并與熒光定量PCR結(jié)合使用。此系統(tǒng)能夠檢測出0.01%的鴕鳥肉，對于檢測鴕鳥肉具有極好的靈敏度和特異性，并且從采樣到得到結(jié)果僅需15～20 min。Zahradnik等[45]研究用于檢測加工食品中的馬肉，針對靶向馬(Equuscaballus)的線粒體基因組設(shè)計(jì)了特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，可檢測出0.1 ng的馬DNA，并可檢測出制備的模型香腸中0.1%的馬肉。雖然LAMP技術(shù)具有高靈敏度、操作簡單、便攜且可快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，但是LAMP不適用于痕量水平的定量，且原理較為復(fù)雜，存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求高、引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、擴(kuò)增的靶序列長度需小于300 bp等缺點(diǎn)[46]。

4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

由于具有物種之間豐富的多態(tài)性以及與其他生物分子相比的高穩(wěn)定性，DNA是源性成分鑒定的理想目標(biāo)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是檢測肉類是否摻假的應(yīng)用最廣泛的方法之一[47-49]。Druml等[50]提供了一個(gè)單一的實(shí)時(shí)PCR分析方法，可測定肉制品中鹿的含量[小鹿(Damadama)、馬鹿(Cervuselaphus)和梅花鹿(Cervusnippon)的總和]，從而檢測食品摻假。同時(shí)對豬肉中含有等量小鹿、馬鹿和梅花鹿的肉混合物以及野味香腸的分析表明，定量方法非常準(zhǔn)確(系統(tǒng)誤差通常<25%)?；谂Ｌ禺愋院图棺祫?dòng)物通用引物，Li等[51]開發(fā)了一種新穎、高效、可靠的雙向SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法，用于牛肉產(chǎn)品摻假檢測。通過分析雙鏈PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰的數(shù)目、位置，對樣品中的牛源性成分進(jìn)行鑒定，并初步篩選牛肉產(chǎn)品中的非牛源性成分；同時(shí)，可根據(jù)峰的面積比對牛肉的百分比進(jìn)行半定量。該方法不僅可以有效地鑒定樣品中是否含有牛DNA，而且還可以初步篩選出非牛和半定量牛在總?cè)獬煞种械陌俜直?。從DNA序列、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的熱力學(xué)特性以及DNA的熒光信號中可以獲得許多信息，隨后使用該研究中的分析方法可以實(shí)現(xiàn)對樣品中物種組成的鑒定和定量。但是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)耗時(shí)較長、成本較高，且需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品的拷貝數(shù)，還要克服潛在的問題(如擴(kuò)增效率的差異等)[16]。

此外，用于檢測不同動(dòng)物源性成分DNA的方法還有數(shù)字PCR(dPCR)，即通過對單個(gè)模板分子進(jìn)行計(jì)數(shù)，在使用熒光靶標(biāo)特異性水解探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，可以檢測其陽性擴(kuò)增。與定量PCR相比，dPCR的優(yōu)勢在于其具有更高的靈敏度和精確度。此外，無需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，即可提供絕對的核酸濃度測量拷貝數(shù)值[52-53]。定量PCR的精度受到限制，因?yàn)樗鼰o法精準(zhǔn)地區(qū)分小于2倍的差異，并且微量濃度(<1%)的定量通常不準(zhǔn)確。相比之下，數(shù)字PCR可以檢測到≤30%的基因表達(dá)差異[54]。數(shù)字PCR比熒光定量PCR更能耐受抑制劑[53]，并且由于在不同的反應(yīng)中進(jìn)行分配，它對許多可能影響PCR的因素(如交叉反應(yīng)DNA模板和引物二聚體)具有較強(qiáng)的抵抗力[55]。使用微滴式數(shù)字PCR，可以檢測低濃度模板，具有絕對定量的特點(diǎn)，可精確定量肉類和加工肉制品中的不同種類[56]。但是數(shù)字PCR成本較高，許多實(shí)驗(yàn)室尚不具備數(shù)字PCR相關(guān)儀器，這也是限制數(shù)字PCR在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的原因之一[57]。

5 展望

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平日益提高，更多追求的是生活品質(zhì)，尤其是食品質(zhì)量安全，如何快速檢測肉類及肉制品的源性成分，以便隨處可檢測、隨時(shí)可監(jiān)測，是我們現(xiàn)在并著眼于未來所需要解決的問題。蛋白質(zhì)在暴露于高溫、高壓、強(qiáng)酸度、高堿度、重金屬鹽和其他條件下時(shí)容易變性，所以基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)不能準(zhǔn)確地處理深加工食品?；诘鞍踪|(zhì)的檢測方法中，對于未來亟待改進(jìn)的方面包括：建立相應(yīng)的各個(gè)產(chǎn)品模型的數(shù)據(jù)庫，便于快速在線分析；開發(fā)有效的算法，高效提取特征數(shù)據(jù)；與其他鑒別手段聯(lián)用，同時(shí)達(dá)到鑒別準(zhǔn)確率高、速度快、檢出限低、無損等優(yōu)勢。基于分子水平的檢測技術(shù)，一方面，進(jìn)一步研究成本更為低廉、更高效、更靈敏且快速的檢測方法；另一方面，由于系統(tǒng)逐漸完善、體系逐步優(yōu)化，有待開發(fā)一系列能夠?qū)θ忸惓煞诌M(jìn)行快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測的試紙條或試劑盒，以滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的研究，為保障食品安全、有效溯源肉類成分提供充足、有效的參考依據(jù)。