楊宗渠，李長看，雷志華，曲金柱，李坤陶，孔慶寒，羅青

（1.鄭州師范學院生命科學學院，河南鄭州450044；2.河南省涉鳥故障工程技術研究中心，河南鄭州450044；3.鄭州師范學院生物物種資源研究中心，河南鄭州450044）

冬蟲夏草是我國特有的名貴中藥資源，是由冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis）侵染鱗翅目蝙蝠蛾幼蟲后發(fā)育而成的由子座和菌核組成的菌體，具有補肺益腎、止血、化痰等功效。冬蟲夏草含有腺苷、蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、甾醇類物質，及多種氨基酸、維生素和礦物質元素[1]?，F代醫(yī)學研究表明，冬蟲夏草有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血壓、調節(jié)內分泌、提高免疫力、鎮(zhèn)靜、抗心肌缺血以及調節(jié)心率等功效[2]。冬蟲夏草的生長對寄主和環(huán)境條件的要求非常嚴苛，主要生長在高海拔雪域地區(qū)，產量很低。市場對冬蟲夏草的需求量日益增加，價格飆升，造成對冬蟲夏草的肆意采挖，使這一珍貴的野生物種資源瀕臨滅絕。在冬蟲夏草人工培育技術尚未成熟的情況下，通過發(fā)酵法生產冬蟲夏草菌絲體，以菌絲體活性成分替代天然冬蟲夏草的藥用價值受到人們的關注[3]。王尊生等[4]分析了冬蟲夏草菌絲體固體發(fā)酵粉的化學成份，指出蟲草發(fā)酵粉中3′-脫氧腺苷，甘露醇的含量明顯高于冬蟲夏草，其它化學成份和冬蟲夏草相應成份基本一致。陳建國等[5]對冬蟲夏草菌絲體進行了安全性毒理學評價，證實冬蟲夏草菌絲體屬無毒級。韋會平等[6]用蛹蟲草為發(fā)酵菌株、大米為基質生產蟲草素，經過約13 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蟲草素達到0.60%，比傳統(tǒng)液體發(fā)酵方法的最高產量高出近2 倍。吳彩琴等[7]以豆粕和米糠為培養(yǎng)基質，采用固體發(fā)酵生產冬蟲夏草多糖，在適宜的工藝條件下，菌質中多糖含量達到16.991 mg/g。由于試驗菌株和發(fā)酵基質的不同，文獻報道的固體發(fā)酵工藝條件和活性成分產率差別較大。本文以小麥為發(fā)酵基質，通過固體發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體，分析菌質中活性成分和主要營養(yǎng)成分的含量，從而找出活性成分含量高的蟲草菌株和固體培養(yǎng)基質，為蟲草固體發(fā)酵提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

試驗的蟲草菌株分別由廣東省微生物研究所和河南農業(yè)大學提供，編號分別為ZNB2.1 和ZNB2.2。

1.1.2 試劑

葡萄糖：天津市天力化學試劑有限公司；苯酚：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；濃硫酸：廣州萬從化工有限公司；氯化鈣：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；碘：天津市津北精細化工有限公司；二甲基亞砜（分析純）：天津市申泰化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

LDZX-50FB 型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DH-420 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；TU-1901 紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Resesrch plus 移液器：德國Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基質的制備

用清水將麥粒清洗2 遍，浸泡12 h 后撈出，放入鍋中加熱直至鍋內水沸騰，煮沸20 min，待麥粒充分吸水膨脹但不開裂時撈出，瀝去多余的水分。然后將麥粒攤晾至麥粒表面無水分，配制成5 種培養(yǎng)基質。A：小麥100%；B：小麥50%、燕麥30%、玉米20%；C：小麥50 %、燕麥30 %、糙米 10 %、谷子10 %；D：小麥50%、燕麥30%、蕎麥5%、高粱 5%、玉米10%；E：小麥50%、燕麥30%、糙米5%；玉米8%、高粱7%。將不同配方的培養(yǎng)基質分裝于500 mL 菌種瓶中，每瓶裝干料150 g，121 ℃下殺菌2 h。每個配方4 次重復。

1.2.2 接種和培養(yǎng)

在無菌條件下，將蟲草母種接種到經過高壓殺菌的培養(yǎng)基質上，接種后的菌種瓶置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行避光培養(yǎng)。

1.2.3 蟲草多糖含量測定

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線的制作

取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg 放入小燒杯中，加蒸餾水溶解，然后轉至500 mL 容量瓶中，加水定容，即為40 μg/mL 的葡萄糖標準液。分別取40 μg/mL的葡萄糖溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL至編號為0～8 的9 支20 mL 具塞試管中，各加蒸餾水1.8 mL，6%的苯酚溶液1.6 mL 以及濃硫酸7.5 mL，搖勻，靜置 10 min，再搖勻，（23±2）℃放置 20 min 后，每組設3 個平行樣品，用紫外分光光度計在490 nm 波長測定樣品吸光度。橫坐標為葡萄糖微克數，縱坐標為吸光度，用excel 軟件制作葡萄糖標準曲線。

1.2.3.2 樣品提取液的制備

精確稱取烘干粉碎的菌質樣品放入100 mL 燒杯中，分別加入50 mL 的蒸餾水，85 ℃水浴加熱浸提2 h，連續(xù)提取3 次。合并濾液用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3.3 去淀粉處理

將固體菌質用粉碎機打成細末狀，然后稱取樣品粉末放入50 mL 燒杯中。向燒杯中分別添加4 mL 3 mol/L 的CaCl2溶液，然后將燒杯放入85 ℃的水浴鍋中加熱，用玻璃棒攪拌10 min 促進溶解，使淀粉糊化。取出燒杯，再分別向燒杯中添加15 mL 6 mmol/L 的I2-DMSO 溶液，溶解淀粉，放入85 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱30 min。將燒杯里的樣品倒入離心管中，放入離心機中，轉速3 000 r/min，離心5 min。取出離心管，倒掉上清液，取出離心管底部的沉淀放入燒杯中，向燒杯中分別添加4 mL 的CaCl2溶液，置85 ℃的恒溫水浴鍋里，進行第2 次去淀粉，再制備樣品提取液，提取，定容，稀釋2 倍，裝于50 mL 容量瓶中。

1.2.3.4 樣品多糖含量的測定

分別從50 mL 的容量瓶中用移液槍取0.2 mL 提取液至10 支20 mL 具塞試管中，另準備一支20 mL 具塞試管作為對照，向11 支具塞試管中加蒸餾水補至1.8 mL。分別加1.6 mL 的6%的苯酚溶液和7.5 mL 的濃硫酸至20 mL 具塞試管中，搖勻，靜置10 min；再次搖勻，（23±2）℃放置 20 min 后，于 490 nm 測定吸光度。

樣品多糖含量/（mg/g）=[提取液的多糖含量（μg）×稀釋倍數×100]/[樣品干重（g）×1 000]

1.2.4 蟲草素含量測定

稱取2.00 g 粉碎的樣品于離心管中，加入15 mL的蒸餾水，在50 ℃水浴中超聲60 min，離心取上清液；再向離心管中加入5 mL 的蒸餾水，混合均勻，水浴超聲30 min，離心取上清液；然后再加入5 mL 蒸餾水，混勻水浴超聲30 min，離心取上清液，將3 次離心的上清液合并，用蒸餾水定容25 mL，過濾膜進樣測定，若渾濁再次離心后過濾膜。色譜柱為C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫 35 ℃，流動相為水與乙腈體積比為 90 ∶10，流速 1.0 mL/min，進樣量 20 μL，波長 260 nm。

1.2.5 蟲草酸含量測定

提取過程與蟲草素測定相同。色譜柱C18（4.6 mm×250mm，5μm），柱溫35℃，流動相為水，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，檢測器為示差檢測器。

1.2.6 營養(yǎng)成分含量測定

1）還原糖：GB/T 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》直接滴定法。

2）蛋白質：GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法。

3）脂肪：GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》酸水解法。

4）淀粉：GB/T 5009.9-2016《食品中淀粉的測定》酸水解法。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

測定葡萄糖含量，標準曲線如圖1 所示。以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到回歸方程y=0.004 9x+0.021 9，R2=0.986 6。

圖1 葡萄糖含量標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose content

2.2 不同菌質中蟲草多糖含量

培養(yǎng)基質是蟲草菌絲體生長的基礎，基質的成分和原料配比直接影響菌絲的生長，進而影響次生代謝產物的形成。不同菌質的蟲草多糖含量見表1。

表1 不同菌質的蟲草多糖含量Table 1 Cordyceps polysaccharide content of different fungal substance

由表1 可以看出，2 個菌株在5 種不同配方的培養(yǎng)基質上的多糖產率不同，菌株ZNB2.1 在B 和C 培養(yǎng)基質中的多糖產率較高，分別為5.119%、5.037%，A培養(yǎng)基質中的多糖含量最低，僅為3.578 %。菌株ZNB2.2 在E 培養(yǎng)基質中的多糖含量最高，達到4.853%，在C 培養(yǎng)基質中的多糖含量最低，為2.799%。由表1還可知，菌株ZNB2.1 在5 種培養(yǎng)基質中多糖含量的平均值大于菌株ZNB2.2，說明ZNB2.1 產生多糖的能力大于ZNB2.2。

2.3 去淀粉處理的多糖含量的影響

據文獻報道，測定菌質的多糖含量時，菌質中的剩余淀粉，特別是被蟲草菌絲降解而產生的小分子淀粉，會使多糖的測定值提高，增大試驗誤差[8]。為減小菌質中淀粉對蟲草多糖測定的干擾，采用二甲基亞砜去除殘留淀粉后，再測定蟲草多糖含量。樣品經去淀粉處理后，蟲草多糖含量測定結果見表2。

表2 去淀粉后的菌質中蟲草多糖含量Table 2 Cordyceps polysaccharide content of fungal substance after starch removal

由表2 可知，去淀粉后10 個菌質樣品的多糖含量都比去淀粉前降低，ZNB2.1 菌株5 種培養(yǎng)基質的菌質多糖含量由3.578 %～5.119 %降至2.588 %～4.188%，ZNB2.2 菌株5 種培養(yǎng)基質的菌質多糖含量則由2.799%～4.853%降至2.094%～3.924%。

5 種培養(yǎng)基質中，ZNB2.1 在B 培養(yǎng)基質中產生的多糖最多，菌質多糖含量最高，為4.188%，在A 培養(yǎng)基質中形成的多糖最少，菌質多糖含量最低，為2.588%。ZNB2.2 在E 培養(yǎng)基質中的多糖產率最高，菌質多糖含量達到3.924 %，C 培養(yǎng)基質中的多糖含量最低，為2.094%。由表 2 還可知，去淀粉后，ZNB2.1 在 5 種培養(yǎng)基質菌質的多糖含量平均值依然大于ZNB2.2。無論是去淀粉前還是去淀粉后，ZNB2.1 在5 種培養(yǎng)基質中多糖含量的平均值都大于菌株ZNB2.2。

2.4 不同菌株的菌質中主要營養(yǎng)成分及活性成分的影響

發(fā)酵前后基質的營養(yǎng)成分變化和活性成分含量見表3。

表3 發(fā)酵前后基質的營養(yǎng)成分變化和活性成分含量Table 3 Changes of nutritional components and contents of active components in substrates before and after fermentation

蟲草菌絲體在生長過程中，從培養(yǎng)基質中吸取營養(yǎng)，完成生長代謝過程，產生活性成分，同時使基質的營養(yǎng)成分發(fā)生變化。將2 個菌株分別接種到基質E上，發(fā)酵結束后測定菌質的主要營養(yǎng)成分及活性成分含量，可以發(fā)現基質經過2 個蟲草菌株發(fā)酵后，其營養(yǎng)成分發(fā)生了變化，均表現為還原糖含量增高，淀粉和蛋白質含量降低。ZNB2.2 菌株在發(fā)酵過程中，產生蟲草素和蟲草酸，菌質中生活性成分蟲草素和蟲草酸的含量分別達到207.4 mg/kg 和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌質中未檢測到蟲草素和蟲草酸。說明蟲草菌絲體固發(fā)酵可產生蟲草素和蟲草酸，產生活性成分的能力因菌株而異。

3 結論與討論

菌株ZNB2.1 和ZNB2.2 分別在基質B 中和基質E中的多糖產率最高，ZNB2.1 產生蟲草多糖的能力大于ZNB2.2。對菌質樣品進行去淀粉處理，可減小殘留淀粉對蟲草多糖測定的干擾。基質經過蟲草固體發(fā)酵后，還原糖含量增高，淀粉和蛋白質含量降低。ZNB2.2 菌株的菌質中蟲草素和蟲草酸的含量分別達到207.4 mg/kg和22.1 g/kg，而ZNB2.1 菌質中未檢測到蟲草素和蟲草酸。蟲草菌絲體固發(fā)酵產生活性成分的能力因菌株而異，綜合考慮蟲草多糖、蟲草素和蟲草酸的產率，蟲草固體發(fā)酵宜選用ZNB2.2 菌株和基質E。

莊毅等以槐耳菌為發(fā)酵菌種、中藥材黃芪為發(fā)酵基質進行雙向固體發(fā)酵，即基質為槐耳菌生長提供所需營養(yǎng)，槐耳菌產生新的活性成分，而基質的原有成分因真菌分泌的酶的作用發(fā)生變化，槐耳菌絲體、活性成分和黃芪基質共同構成藥性菌質，從而產生新的性味功能，具有比該真菌或藥性基質本身或兩者簡單相加更好的藥效[9]。本研究選用蟲草為發(fā)酵菌種、小麥為發(fā)酵基質進行雙向固體發(fā)酵，雖然基質中的淀粉和蛋白質等營養(yǎng)成分被菌絲分解而減少，但菌質中生成了蟲草的活性成分——蟲草多糖、蟲草素和蟲草酸，菌質可用于開發(fā)營養(yǎng)保健食品。該雙向固體發(fā)酵研究為小麥的精深加工提供了一條新途徑。薛俊杰等報道，蟲草素的分泌與菌株特性有密切關系，并不與菌株的長勢直接相關[10]。孫軍德等通過5 個蟲草菌株的菌絲生長速率和培養(yǎng)基中活性物質含量的對比研究，發(fā)現不同蟲草菌株的菌絲生長速率、蟲草多糖和蟲草素地含量不同[11]。劉艷芳等對19 個蟲草屬菌株的菌絲體中活性成分進行了分析，結果表明不同菌株菌絲體蟲草素含量差異顯著[12]。本試驗中不同蟲草菌株產生活性成分的能力不同，與文獻[10-12]的研究結果一致。另據報道，蟲草菌絲的培養(yǎng)條件直接影響菌質中活性成分的含量，為提高蟲草多糖、蟲草素和蟲草酸等活性物質的產率，需要對蟲草雙向固體發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行更深入的研究。