李文桂，陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲(chóng)病研究所，重慶 400016

銅綠假單胞菌（Psendomonas aeruginosa）是一種院內(nèi)感染的常見(jiàn)致病菌，用抗生素治療易產(chǎn)生耐藥性，需要探索其他治療方法。許多研究表明脂多糖、多糖、藻酸鹽、鞭毛或菌毛均可作為疫苗使用，但有許多缺陷，故需尋找其他抗原[1]。銅綠假單胞菌外毒素A（P.aeruginosaexotoxin A，PEA）編碼基因長(zhǎng)約1.9 kb，編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為66 000，由613個(gè)氨基酸殘基組成。研究表明，PEA含有252個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域Ⅰa、128個(gè)殘基的結(jié)構(gòu)域Ⅱ、39個(gè)殘基的結(jié)構(gòu)域Ⅰb以及194個(gè)殘基的結(jié)構(gòu)域Ⅲ。PEA具有下述作用：呈現(xiàn)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，既有較強(qiáng)的免疫原性，又有較好的佐劑效應(yīng)，可作為黏膜佐劑使用；催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）水解為煙酰胺（N）和腺苷二磷酸核糖（ADPR），ADPR結(jié)合EF-2后使其失活，導(dǎo)致肽鏈無(wú)法延長(zhǎng)，從而阻止蛋白的合成[2]；抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制外周血單核細(xì)胞（PBMC）產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-10和IL-8等細(xì)胞因子[3-5]；誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和鼠胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而逃避免疫細(xì)胞的殺傷作用[6-8]；刺激小鼠肺泡的Ⅱ型上皮細(xì)胞產(chǎn)生H2O2及自噬相關(guān)蛋白LC3，引起細(xì)胞自噬[9]。大量研究表明銅綠假單胞菌的溫度敏感株D/1/8和E/9/9、甲醛滅活的疫苗株SBI-N以及PEA類(lèi)毒素可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的保護(hù)力[10-12]，表明PEA抗原具有作為疫苗的潛力。在此，我們將對(duì)PEA蛋白分子、融合蛋白、耦合蛋白以及核酸疫苗等的研制現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 PEA蛋白分子

Gilleland等[13]將20 μg PEA蛋白加鋁佐劑肌肉注射SD大鼠，初次接種后2、4周加強(qiáng)2次，初次接種后6周血清IgG升高，此時(shí)氣管內(nèi)注射5×104CFU的PA01株進(jìn)行攻擊，攻擊后1周免疫組的肺組織病理變化顯著減輕，計(jì)數(shù)存活率表明免疫組和對(duì)照組分別為72.2%（13/18）和0（0/18）。

將PEA與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）或硫氧還蛋白（Trx）進(jìn)行融合表達(dá)，不僅提高了蛋白的溶解性，而且有利于蛋白正確折疊和二硫鍵形成，最大限度地保持蛋白活性。胡曉梅[14-15]以PA01株基因組的DNA為模板擴(kuò)增PEA基因，插入pSK-T得pSK-PEA，與pMAL-P2x重組得pMALPEA，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為112 000的PEA-MBP融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。趙志強(qiáng)等[16]將PEA基因插入pBV221得pBV221-PEA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，篩選重組菌，40℃熱誘導(dǎo)30 min，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為69 000的PEA蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。佟偉[17]將1917 bp的PEA基因插入pET32α得pET32α-PEA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為78 000的PEA-TrxA融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。吳建勇[18]將PEA基因插入pET28α得pET28α-PEA，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為74 000的PEA-His融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。劉祥等[19]將50 μg PEA-His蛋白皮下注射昆明種小鼠，初次接種后2、4周加強(qiáng)2次，初次接種后6周血清IgG滴度為1∶8000，這時(shí)腹腔注射1×106CFU銅綠假單胞菌PA01株進(jìn)行攻擊感染，攻擊后5 d接種組和對(duì)照組的存活率分別為 60%（12/20）和30%（4/12）。Manafi等[20]將 100 μg PEA蛋白皮下注射BALB/c鼠，每周1次，連續(xù)6周，初次接種后7周血清IgG升高，此時(shí)建立10%的體表面積燒傷模型，建模后1 d皮下注射108CFU的PA103株進(jìn)行攻擊感染，攻擊感染后70 d接種組和對(duì)照組的存活率分別為93.8%（45/48）和0（0/25）。

KDEL是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)留置序列，與蛋白融合表達(dá)后可以保持蛋白的全部活性。PE38是一個(gè)截短的PEA分子，含有PEA的部分結(jié)構(gòu)域Ⅱ（253-362）、全部結(jié)構(gòu)域Ⅰb（381-420）和結(jié)構(gòu)域Ⅲ（421-613）。Qaiser等[21]以PA01株基因組DNA為模板擴(kuò)增1043 bp的PE38-KDEL基因，插入pTZ57R/T得pTZ-PE38-KDEL，與pET22b（+）重組得pET22b-PE38-KDEL，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為38 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。

用成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶清除位點(diǎn)的11個(gè)氨基酸替代PEA的Ⅱ區(qū)，同時(shí)改造PEA的Ⅲ區(qū)與人Her2受體結(jié)合的6個(gè)氨基酸序列，將KDEL序列加入PE38的C端稱(chēng)為Her2-PE38X7。Tehranizadeh等[22]人工合成Her-PE38X7編碼基因，插入pET21b（+）得pET21b-Her2-PE38X7，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為45 500的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合，該融合蛋白具有穩(wěn)定性強(qiáng)、活性高和毒性低等特點(diǎn)。

2 PEA融合蛋白

2.1 PEA-Fla

鞭毛的基本組成單元為鞭毛蛋白（flagellin，F(xiàn)la），F(xiàn)la可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[23]。將PEA和Fla的編碼基因融合是值得探索的方法。Tanomand等[24]以PA01株的基因組DNA為模板擴(kuò)增1212 bp的PEA基因，以8821M株的DNA為模板擴(kuò)增510 bp的Fla基因，采用重疊PCR合成1722 bp的PEA-Fla融合基因，插入pET22b得pET22b-PEA-Fla，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)，Western印跡提示陽(yáng)性血清結(jié)合重組菌表達(dá)的Mr為63 000重組蛋白。Farajnia等[25]將PEA-Fla融合基因插入pTZ57R得pTZPEA-Fla，與 pET22b重組得 pET22b-PEA-Fla，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為63 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。將20 μg重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后21、42和72 d加強(qiáng)3次，初次接種后79 d血清IgG升高，初次接種后86 d腹腔注射7.5×107CFU銅綠假單胞菌Pa8821M株進(jìn)行攻擊，攻擊后10 d，PEA-Fla免疫組、Fla免疫組、PEA免疫組和對(duì)照組的存活率分別為 80%（4/5）、60%（3/5）、40%（2/5）和20%（1/5）。

2.2 ntPE-M2e

若PEA的Ⅲ區(qū)553位谷氨酸殘基發(fā)生突變，PEA就喪失了ADP-核糖基酶活性，成為無(wú)毒形式的PEA（ntPE）。A型流感病毒的M2蛋白胞外區(qū)（M2 extracellular domain，M2e）是一種跨膜離子通道，通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)部的pH值促進(jìn)病毒增殖。M2e的氨基酸序列保守，具有一定的免應(yīng)原性[26]。徐一等[27]將M2e的編碼基因插入pET30αntPE得pET-ntPE-M2e，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為72 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。將200 μg融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后3、6周加強(qiáng)2次，初次接種后7周血清IgG滴度為1∶7800，ELISPOT證實(shí)脾IFN-γ+SFC數(shù)目增加，初次接種后8周腹腔注射5 LD50的APR348株進(jìn)行攻擊感染，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和20%（2/10）。

2.3 PEIF

外膜蛋白F（outer membrane protein F，OprF）和I（OprI）是嵌合在銅綠假單胞菌脂多糖和磷脂層外膜上的蛋白，主要參與微孔的形成，用它們免疫小鼠均可誘導(dǎo)較好的保護(hù)力[28]。Chen等[29]以pJH4為模板擴(kuò)增PEA1-405編碼基因，插入pET-15b得pET-PE，然后以PA01株的基因組DNA為模板擴(kuò)增OprI19-83和OprF(24-380)編碼基因，先后插入pETPE得pETIF，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為90 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。將10 μg融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠，初次接種后3、5周加強(qiáng)2次，初次接種后6周血清IgG升高，此時(shí)制作30%體表面積的燒傷模型，燒傷1 d后皮下注射5×104CFU銅綠假單胞菌PA103株進(jìn)行攻擊感染，攻擊后10 d接種組和對(duì)照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/10）。

2.4 PEA-GP5-M

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征的病原體。包膜糖蛋白GP5和非糖基化的膜蛋白M通常形成異二聚體，與巨噬細(xì)胞的CD163受體結(jié)合，在病毒侵襲中起作用，同時(shí)可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[30]。Yang等[31]制備PEA-GP5-M融合蛋白，將3 mg融合蛋白加1 mL ISA206佐劑肌肉注射28 d齡的仔豬，初次接種后2周加強(qiáng)1次，初次接種后4周血清IgG升高，ELISPOT提示PBMC中IFN-γ+SFC數(shù)目增多，此時(shí)肌肉注射5×105TCLD50銅綠假單胞菌TC-01株進(jìn)行攻擊，攻擊后3周免疫組的肺病理變化明顯減輕。

2.5 CVN-PE38

CVN是藍(lán)細(xì)菌（Nostoc ellipsosporum）分泌的一種蛋白質(zhì)，可與Ⅰ型人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）的gp120結(jié)合，具有抗病毒作用。Mori等[32]將CVN的編碼基因L插入pPB57得pPB57-L，與pUC19-PE38重組得pPB57-L-PE38，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導(dǎo)，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為49 300的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合，H9細(xì)胞模型提示該融合蛋白可提高gp120+H9細(xì)胞的毒性。

2.6 PEA-V3MV26

Mrsny等[33]將HIV-1的gp120蛋白V3環(huán)26個(gè)氨基酸插入PEA的Ⅰb區(qū)，稱(chēng)為PEA-V3MV26，然后將20 μg融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后2、7周加強(qiáng)1次，初次接種后8周免疫鼠的血清IgG、IgG1、IgG2a和IgG3水平明顯提升，唾液IgA水平也顯著升高。

2.7 PEA-HphA

HphA基因編碼一種組氨酸類(lèi)似蛋白，該蛋白具有結(jié)合DNA的特性。PEA的Ⅰa區(qū)和Ⅱ區(qū)結(jié)構(gòu)域可作為受體介導(dǎo)的基因傳遞載體，HphA基因與其融合并不影響DNA的序列或形態(tài)，可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率。Deng等[34]將HphA基因插入pET26α-PEA得pET26α-PEA-HphA，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌；Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為50 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。研究提示該融合蛋白可增加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的效率。

2.8 IL-18-PE38

PE38具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，常被用作分子佐劑[35]。IL-18是一種Th1型細(xì)胞因子，可將IL-18與PEA融合表達(dá)，利用IL-18將PEA導(dǎo)向Th1靶細(xì)胞，發(fā)揮其殺傷作用，常用于自身免疫性疾病的治療。李虹等[36]以小鼠總RNA為模板擴(kuò)增480 bp的IL-18基因，插入pRKL459K得pRKLIL-18-PE38，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達(dá)的Mr為56 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。

3 PEA耦合蛋白

3.1 PEA-LPS

化學(xué)耦聯(lián)常用于病原體的蛋白、多肽和多糖疫苗，通過(guò)與載體蛋白的耦聯(lián)，使它們成為全抗原，從而提高耦聯(lián)抗原的免疫原性。PEA是一種T細(xì)胞依賴(lài)性抗原，常作為半抗原的連接載體，從而提高半抗原的免疫原性[37]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是銅綠假單胞菌的內(nèi)毒素，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體反應(yīng)[38]。Cryz等[39]將PEA與LPS耦合為PEA-LPS，然后將50 μg耦合物加鋁佐劑肌肉注射新西蘭大白兔，初次接種后14、28 d加強(qiáng)2次，初次接種后42 d血清IgG升高。接著，Schaad等[40]將25 μg耦合物肌肉注射囊性纖維化的患者，初次接種后2、12個(gè)月加強(qiáng)2次，初次接種后13個(gè)月治療組的血清IgG升高。

3.2 PEA-CSP

惡性瘧原蟲(chóng)（Pf）是惡性瘧的病原體，Pf環(huán)子孢子蛋白（PfCSP）是一種紅前期抗原，Mr通常為40 000～60 000，在子孢子入侵肝細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用。Fries等[41]將400 μg CSP-PEA加鋁佐劑肌肉注射19名健康志愿者，初次注射后8周加強(qiáng)1次，初次注射后10周52%（11/19）接種者的血清IgG大于9.8 μg/mL；初次注射后16周加強(qiáng)第2次，初次注射后20周40%（4/10）接種者的血清IgG大于6 μg/mL。此時(shí)用2只感染Pf的斯氏按蚊叮咬接種者5 min，叮咬后2周免疫組和對(duì)照組的原蟲(chóng)血癥分別為25%（1/4）和33.3%（1/3），研究表明免疫組的血清可抑制Pf子孢子入侵肝細(xì)胞，抑制率為90%，但抑制率與保護(hù)力無(wú)關(guān)聯(lián)。

3.3 PEA-Pfs25

Pfs25是Mr為25 000的受精后抗原，在動(dòng)合子穿透蚊胃上皮以及動(dòng)合子轉(zhuǎn)為卵囊的過(guò)程中起重要作用。錢(qián)鋒等[42]將Pfs25與PEA耦聯(lián)為Pfs25-PEA。Shimp等[43]將2.5 μg耦合物加鋁佐劑皮下注射CD1鼠，初次接種后4周進(jìn)行加強(qiáng)，血清IgG在首次注射后6～15周提升明顯，首次注射后6周提升到較高水平；膜飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，1∶4和1∶8稀釋的初次接種后6周鼠血清的減囊率分別為99.0%和91.6%，而對(duì)照血清為0。

3.4 CD4-PEA

CD4是HIV-1結(jié)合T細(xì)胞的受體，Berger等[44]證實(shí)CD4-PEA耦合物可選擇性殺傷HIV-1感染的T細(xì)胞，但不殺傷表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的正常T細(xì)胞。

3.5 G17-PE38

胃泌素 17（gastrin 17，G17）是縮膽囊肽 2R（CCK2R）的受體。G17-PE38是一種免疫毒素，通過(guò)G17與胃癌細(xì)胞上的CCK2R受體結(jié)合，將PE38靶向胃癌細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒作用。Feng等[45]將G17-PE38融合基因插入pET28α得pET28α-G17-PE38，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示表達(dá)的Mr為43 000的融合蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合，細(xì)胞毒試驗(yàn)表明該蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901均具有細(xì)胞毒作用。

3.6 PLGA-PEA

多聚乳酸羥乙酸（PLGA）是一種可生物降解的多聚體，由其包裹形成的納米顆粒可增強(qiáng)抗體的免疫應(yīng)答，可作為抗原的傳遞載體[46]。Zanjani等[47]用PLGA包裹PEA，形成PLGA-PEA耦合物。將100 μg耦合物肌肉注射BALB/c鼠，初次接種后2、4周加強(qiáng)2次，初次接種后6周血清IgG提升顯著，脾細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-4、IFN-γ、TNF-α和IL-17A等活性分子，這時(shí)腹腔注射1.5×108CFU的PA01株進(jìn)行攻擊感染，攻擊后3 d接種組的脾臟內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷顯著減少。

4 PEA核酸疫苗

4.1 反義RNA

反義RNA在RT+細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄一個(gè)無(wú)毒性的RNA，與表達(dá)毒素的cDNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。反義RNA治療并不依賴(lài)反轉(zhuǎn)錄（RT），因它不表達(dá)有意義的毒素，但能降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活性。HaHafkemeyer等[48]將PEA的反義RNAP92、P95、77和 P100插入 pCMVβGa1得pCMV-P92/P95/p77/P100，將其轉(zhuǎn)染鴨乙肝病毒（DHBV）感染的HepG2細(xì)胞，篩選培養(yǎng)，RT-PCR證實(shí)重組質(zhì)?？梢种艱HBV的轉(zhuǎn)錄。

4.2 重組質(zhì)粒

Denis-Mize等[49]以pGW580為模板擴(kuò)增PEA基因，插入 pVR1012得 pVR1012-PEA，轉(zhuǎn)染UM449細(xì)胞，篩選培養(yǎng)，Western印跡提示陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的Mr為67 000的PEA蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合。將100 μg重組質(zhì)粒肌肉注射BALB/c鼠，血清IgG在接種后3～5周升高，接種后5周達(dá)較高水平；RT-PCR證實(shí)接種后35 d淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄增加，但I(xiàn)L-4無(wú)變化；此時(shí)腹腔注射2.6 μg PEA毒素進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，10 d后接種組和對(duì)照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/10）。Shiau等[50]將 1.66 kb的 PEA 基因插入pSecTagXpress得pSecTag-PEA，將其轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，篩選培養(yǎng)，Western印跡提示陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的Mr為62 000的PEA蛋白可被陽(yáng)性血清結(jié)合；借助肌肉注射將100 μg重組質(zhì)粒接種BALB/c鼠，首次注射后2、4、6和8周重復(fù)4次，血清IgG在首次注射后3～11周提升明顯，首次注射后9周提升到較高水平；首次注射后10周腹腔注射1 μg PEA毒素進(jìn)行攻擊，攻擊后1周免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%（5/5）和0（0/5）。

銅綠假單胞菌低鈣反應(yīng)蛋白V（P.aeruginosalow-calcium response protein V，PcrV）是一種Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有一定的免疫原性[51]。Jiang等[52]以PA01株基因組的DNA為模板擴(kuò)增PEA和PcrV基因，將其分別插入pIRES的2個(gè)位點(diǎn)得pIRES-PEA-PcrV，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，篩選培養(yǎng)，Western印跡提示感染銅綠假單胞菌的血清可結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的Mr為70 000的PEA和33 000的PcrV蛋白；借助肌肉注射將100 μg重組質(zhì)粒注射BALB/c鼠，首次注射后2、4周重復(fù)2次，首次注射后5周血清IgG升高，脾細(xì)胞增殖，分泌高水平的IFN-γ和IL-12；初次接種后6周用5×107CFU銅綠假單胞菌PA01株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后3 d免疫組的肺組織病理變化減輕，肺組織內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷大量減少。

5 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)有部分銅綠假單胞菌PEA蛋白疫苗接種小鼠可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但誘導(dǎo)的保護(hù)力水平一般較低，離期望值甚遠(yuǎn)。重組PEA抗原的免疫原性較低，常須加用佐劑或與其他抗原進(jìn)行融合以及耦合表達(dá)才能誘導(dǎo)有效的保護(hù)力；核酸疫苗可誘導(dǎo)全面的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，但其有整合進(jìn)宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)；尚未深入研究這些疫苗的免疫機(jī)制；尚未建立疫苗效果的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的評(píng)價(jià)體系；尚未弄清疫苗的免疫途徑、劑量、次數(shù)、間隔以及末次免疫后菌株攻擊時(shí)間；尚欠缺新型PEA疫苗研制的創(chuàng)新思維。

隨著核基因組學(xué)、泛基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、高通量測(cè)序和反向疫苗學(xué)等學(xué)科的進(jìn)展，大家勢(shì)必聚焦銅綠假單胞菌的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)的研究，從而闡明PEA結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)聯(lián)；為了提升DNA疫苗的免疫效果，可對(duì)PEA抗原表位的序列進(jìn)行修飾，構(gòu)建PEA多抗原表位或免疫增強(qiáng)序列-PEA抗原表位的融合基因疫苗，構(gòu)建PEA表位-佐劑序列或不同抗原表位序列的融合基因疫苗；同時(shí)應(yīng)努力探索新型疫苗載體，多管期下，積極推動(dòng)銅綠假單胞菌PEA蛋白疫苗的研究步伐。