張義浜，楊昱華

1.江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

納米顆粒，由于其尺寸與細胞主要組分和蛋白接近，容易通過內(nèi)吞機制進入活細胞，在生物醫(yī)學領(lǐng)域中得到廣泛研究與應(yīng)用[1]。膠體金因其尺寸處于納米級，更多地被稱為納米金或金納米顆粒（gold nanoparticles，GNPs）。其具有形狀和粒徑可控、易于表面改性和修飾等優(yōu)點，并且有良好的生物相容性，被認為是一類具有潛力的疫苗遞送載體。本文擬就膠體金在疫苗遞送及其佐劑效應(yīng)方面，尤其在無針化免疫方面的應(yīng)用研究進展做簡要綜述。

1 膠體金作為疫苗載體及其佐劑效應(yīng)

研究表明，膠體金能促進抗原特異性抗體的產(chǎn)生，具有免疫佐劑效應(yīng)，被用于設(shè)計包括抗腫瘤以及多種傳染性疾病的預防性疫苗。

2016年，Dakterzada等[2]報道了膠體金與銅綠假單胞菌鞭毛蛋白部分肽段的結(jié)合，評價了其對銅綠假單胞菌的免疫佐劑效果，表明膠體金能產(chǎn)生與弗氏佐劑相似的細胞免疫反應(yīng)，起到殺菌效果。Wang等[3]也證明膠體金作為免疫佐劑，相較于弗氏佐劑能誘導產(chǎn)生更高滴度的特異性抗體。

另有研究發(fā)現(xiàn)，當膠體金和其他免疫佐劑聯(lián)合使用時，可顯著增強免疫效果。PfMSP-119是抑制瘧疾侵襲抗體的靶點，但即使在有鋁佐劑存在的條件下，其免疫原性仍然較弱。Parween等[4]采用膠體金和氫氧化鋁凝膠共同作為PfMSP-119抗原的免疫佐劑，結(jié)果比單用鋁佐劑組的血清抗體滴度增加了約10倍。同樣，將鼠疫桿菌F1抗原與膠體金聯(lián)合鋁凝膠制劑，比單用鋁凝膠制劑產(chǎn)生更強的體液免疫效果，特異性抗體滴度水平不僅更高而且持續(xù)時間更長[5]。

Wang等[6]發(fā)現(xiàn)與單用CpG寡脫氧核苷酸相比，CpG與膠體金聯(lián)用能使乙肝核心蛋白（HBc）的特異性抗體滴度、CD4+和CD8+T細胞數(shù)、白細胞介素4（IL-4）和干擾素γ（IFN-γ）的表達水平顯著增加。Dykman等[7]的研究也支持這一觀點。膠體金被認為能促進樹突狀細胞對抗原的提呈，促進細胞毒性T淋巴細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]。

除運載蛋白類抗原外，膠體金也被用作DNA或RNA疫苗的載體，甚至細菌膜[9]的載體。Paul等[10]將抗登革熱病毒（DENV）的小干擾RNA（siRNA）與膠體金連接，發(fā)現(xiàn)陽離子膠體金-siRNA復合物可以進入Vero細胞，并顯著降低感染后DENV血清型2的復制和感染性病毒的釋放。此外，經(jīng)過RNase處理的膠體金-siRNA復合物仍能抑制DENV的復制，表明膠體金對RNA可以起到保護和穩(wěn)定的作用。

2 膠體金佐劑效應(yīng)的影響因素

研究發(fā)現(xiàn)，膠體金兼具抗原遞送載體和佐劑效應(yīng)[11]，且受到膠體金自身理化性質(zhì)的影響。

首先，粒徑作為膠體金的重要物理參數(shù)，對其體內(nèi)分布及免疫佐劑效果有顯著影響。Kang等[12]用卵清蛋白（OVA）包被膠體金，并給OVA額外添加了2個半胱氨酸基團，以通過Au-S鍵與膠體金發(fā)生共價鍵合。不同粒徑膠體金對OVA向淋巴結(jié)的輸送效率和誘導CD8+T細胞反應(yīng)的影響結(jié)果表明，22和33 nm的膠體金比10 nm的膠體金具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運效率，且能誘導更強的免疫反應(yīng)。Quach等[13]研究了不同粒徑膠體金對登革熱抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)隨膠體金的粒徑和濃度的增加，特異性抗體滴度也隨之明顯升高。以上研究表明，在一定范圍內(nèi)，粒徑較大的膠體金更有助于免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生。

Barhate等[14]研究了不同粒徑膠體金對破傷風毒素（TT）二級結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)20 nm的膠體金可導致TT二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗原的免疫活性降低95%，而40和80 nm的膠體金則不會對TT二級結(jié)構(gòu)和免疫活性造成明顯影響。然而，口蹄疫病毒（FMDV）疫苗的研究者發(fā)現(xiàn)，并非膠體金粒徑越大越有利于疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，平均粒徑為8～17 nm的膠體金產(chǎn)生的免疫反應(yīng)最強，而且未發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠血清中有針對膠體金的抗體產(chǎn)生[15]。由此可見，膠體金的免疫佐劑效果沒有絕對的粒徑依賴性，其具體粒徑的選擇還與其所應(yīng)用的抗原有關(guān)。

其次，膠體金的形狀對其免疫佐劑有一定影響。Dykman等[7]探究了不同粒徑、形狀的膠體金對抗原特異性抗體產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示相對于其他形狀的膠體金，金納米球的免疫佐劑效果最佳，且50 nm的金納米球產(chǎn)生的特異性抗體比15 nm的更多。其在報道中所列不同形狀的納米金免疫動物所產(chǎn)生的特異性抗體滴度順序為：納米球（nanosphere）＞納米殼（nanoshells）＞納米星（nanostars）＞納米棒（nanorods）。

Niikura等[16]進一步系統(tǒng)研究了膠體金形狀對西尼羅河病毒（WNV）體內(nèi)和體外免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響。球形（直徑20和40 nm）、棒狀（40 nm×10 nm）及立方形（40 nm×40 nm×40 nm）的膠體金作為免疫佐劑，并用WNV包膜（Es）蛋白包裹。結(jié)果表明40 nm的金納米球產(chǎn)生的抗體水平最高。為了研究形狀依賴性WNV抗體產(chǎn)生的機制，他們采用巨噬細胞 Raw264.7對膠體金的細胞攝取效率進行了分析，結(jié)果顯示金納米棒比球形更容易被細胞攝取，表明抗體的產(chǎn)生并不直接依賴于膠體金的細胞攝取效率。用膠體金處理骨髓來源樹突狀細胞（BMDC），再對其表達的細胞因子水平進行檢測，結(jié)果只有金納米棒-Es處理的細胞產(chǎn)生顯著的白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18），表明金納米棒可激活炎癥依賴性細胞因子的分泌。同時，金納米球40-Es和立方金-Es均能顯著誘導炎癥細胞因子的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，膠體金是一種有效的疫苗佐劑，隨著其大小和形狀的不同，將會通過不同的細胞因子途徑產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

最后，表面修飾/改性對膠體金發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)也存在影響。Moyano等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）存在的條件下，表面經(jīng)疏水性修飾的膠體金能促進在小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，提示其具有免疫佐劑效應(yīng)，而PEG修飾的親水性膠體金則顯示出良好的抗炎活性。

表面經(jīng)多糖修飾后的金納米粒子更容易被樹突狀細胞攝取，能有效增強抗原提呈和T細胞應(yīng)答，有助于抗腫瘤免疫治療。Climent等[18]在體外細胞實驗中證明了表面修飾HIV肽和甘露糖苷的金納米粒子，能顯著增強特異性CD4+和CD8+T細胞的增殖，可促進pro-Th1細胞因子和趨化因子的分泌，適當分泌pro-Th2細胞因子，顯著提高促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）與IL-1β的分泌。Safari等[19]以膠體金負載由45%四糖和5% OVA323-339組成的糖蛋白產(chǎn)生特異性抗肺炎鏈球菌14型包膜多糖（PN14PS）的IgG抗體，細胞因子檢測表明多糖修飾的金納米粒子更能激活輔助性T細胞。

作者團隊也曾分別制備了OVA與膠體金的物理共混物（OVA+GNPs）以及兩者的共價復合物（OVA@GNPs），其平均粒徑均為5 nm左右。通過對比研究，最先發(fā)現(xiàn)并提出抗原與膠體金的結(jié)合方式，同樣會影響其體外穩(wěn)定性及體內(nèi)免疫效果。采用一步法制備的共價復合物OVA@GNPs能有效誘導小鼠產(chǎn)生與鋁佐劑相當?shù)拿庖邞?yīng)答反應(yīng)，且使用劑量極低，安全性高，制備方法簡單可行，可應(yīng)用于其他抗原[20]。

以上研究結(jié)果顯示，膠體金能促使細胞因子分泌，幫助多種類型抗原提呈而其本身無明顯的細胞和免疫毒性，可單獨或聯(lián)合其他佐劑發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)，有望作為潛在的新型免疫佐劑。然而由于膠體金的粒徑和形狀存在多樣性，且均會影響到免疫細胞的攝取以及細胞因子的釋放，產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)，再加上納米粒子表面的親疏水性和糖基化修飾等與其與免疫細胞的相互作用密切相關(guān)，膠體金作為免疫佐劑還有待于更加具體、深入和廣泛的研究。

3 膠體金在無針免疫中的應(yīng)用

3.1 膠體金在黏膜免疫中的應(yīng)用

現(xiàn)已獲批上市的疫苗大多通過皮下或肌肉注射完成接種[21]。注射接種傾向于誘導機體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫，較難引發(fā)局部的黏膜免疫。如果能誘導分泌針對黏膜表面特定病原體的IgA（sIgA）抗體，就可以有效預防通過黏膜傳染的疾病，但目前只有少量的黏膜免疫類疫苗被獲批上市，提示該類疫苗的研發(fā)存在較大的難度和挑戰(zhàn)，其主要原因在于：①黏膜長期接觸各種抗原，易發(fā)生免疫耐受，因此需要高劑量的抗原刺激或配合使用強免疫佐劑；②由于黏膜環(huán)境存在各種酶以及微生物，要成功引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，抗原需要具有良好的穩(wěn)定性；③經(jīng)黏膜免疫的疫苗須穿透防御性良好的上皮細胞屏障，才有可能被黏膜的抗原提呈細胞捕獲。因此，與注射類疫苗不同，依靠黏膜遞送疫苗由于在實際應(yīng)用中接種劑量存在不確定性，且黏膜免疫后所產(chǎn)生的sIgA不易被檢測[21]，開發(fā)能夠幫助抗原通過黏膜，并產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的疫苗載體，對黏膜疫苗的成功研發(fā)至關(guān)重要。

理想的黏膜免疫抗原載體，需要能夠保證抗原的穩(wěn)定性、生物利用度以及抗原攝取率，且載體應(yīng)具有佐劑活性或可搭載有效的免疫佐劑。膠體金作為潛在的抗原載體之一，能夠有效提高抗原在體內(nèi)外的穩(wěn)定性[22]，可通過不同的作用方式與抗原結(jié)合，并在膠體金表面高密度展示。膠體金的粒徑大小可控，尤其小粒徑的膠體金易于穿過上皮細胞與淋巴細胞接觸，發(fā)揮佐劑效應(yīng)。目前已有研究報道膠體金在鼻疽病、流感及破傷風等疾病中作為抗原載體，展示其在黏膜免疫中的潛在應(yīng)用前景。

鼻疽病的病原體是鼻疽假單胞菌，通過氣溶膠經(jīng)呼吸道感染，致死率高。研究發(fā)現(xiàn)其LPS的O抗原與其毒力有關(guān)，Gregory等[23-24]構(gòu)建了LPS多糖偶聯(lián)膠體金疫苗，經(jīng)鼻接種后，比游離LPS能產(chǎn)生更高的抗體滴度，且在小鼠和非人靈長類動物中均顯示出良好的免疫效果，有效減少了鼻疽假單胞菌的感染率，顯著提高了免疫后動物的生存率。

流感病毒所含的2種抗原膜蛋白——血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的快速突變，可降低甚至消除流感疫苗的有效性。Wang等[25]利用膠體金開發(fā)了一種新的流感疫苗制備方法，以18 nm金納米球作為載體，HA為抗原，聯(lián)合鞭毛蛋白（FliC）免疫佐劑，制備H3N2流感病毒疫苗，動物實驗發(fā)現(xiàn)該疫苗能夠產(chǎn)生顯著高于兩者單用，即HA/FliC和GNPs-HA的抗體滴度。

Tao等[26-27]將甲型流感病毒基質(zhì)2蛋白（M2e）高度保守的胞外區(qū)與膠體金結(jié)合（M2e-GNPs），另輔以CpG免疫佐劑，通過鼻內(nèi)接種檢測納米粒子復合物誘導小鼠產(chǎn)生的抗體滴度以及對小鼠流感的免疫保護作用。結(jié)果表明，無CpG時，在初免M2e-GNPs的42 d后能產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答反應(yīng)，只在一定程度上減少流感病毒PR8-H1N1感染小鼠后的死亡率，而額外添加CpG佐劑組在初免后21 d即可產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)，并且在較長時間內(nèi)（8個月以上）降低流感的發(fā)病率和死亡率。該疫苗不僅對H1N1產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時還能對H3N2、H5N1其他病毒亞型產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，起到良好的交叉免疫保護效果[28]。

Barhate等[22,29]制備了殼聚糖功能化金納米粒（CsGNPs），用于破傷風類毒素（TT）和皂樹（Quillaja saponaria，QS）或總序天冬（Asparagus racemosus，ARE）萃取物的共同載體。小鼠經(jīng)口服接種后，TT-QS-CsGNPs誘導的免疫應(yīng)答顯著高于單用對照組（28倍）。TT-ARE-CsGNPs組產(chǎn)生的特異性IgG（34.53倍）和IgA（43.75倍）也得到了顯著增加。與普通TT組相比，基于ARE的疫苗組對TT的局部免疫應(yīng)答也顯著增加，且該疫苗的體外穩(wěn)定性較好。

以上研究表明，膠體金經(jīng)鼻腔或胃腸道的黏膜免疫，可作為抗原的穩(wěn)定和保護劑，幫助和促進抗原透過黏膜上皮屏障，從而被免疫細胞捕獲，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.2 膠體金在經(jīng)皮免疫中的應(yīng)用

人體皮膚中所含的朗格漢斯細胞和樹突狀細胞是重要的抗原提呈細胞，具有捕獲外來抗原并在引流淋巴結(jié)中呈遞抗原的重要作用。此外，表皮和真皮中含有豐富的角質(zhì)形成細胞和其他免疫細胞（如肥大細胞）可以分泌細胞因子和趨化因子，這些細胞因子和趨化因子可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)?？乖D(zhuǎn)運實驗證明，通過皮膚接種疫苗比常規(guī)肌肉注射更有效地將抗原轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)[30]，因此經(jīng)皮免疫是非常具有吸引力的免疫接種方式，但由于角質(zhì)層的屏障作用，一直難以實現(xiàn)。

角質(zhì)層由數(shù)層扁平角質(zhì)細胞組成，胞內(nèi)是密集的角蛋白，胞間則充滿了角質(zhì)小體釋放的脂類物質(zhì)。正常皮膚一般只允許中度親脂性（脂水分配系數(shù)logP 2～3）和小分子（相對分子質(zhì)量＜500）透過，水溶性的大分子抗原類物質(zhì)無法直接透過角質(zhì)層。為了實現(xiàn)經(jīng)皮免疫，有各種手段被用來促進抗原透過角質(zhì)層，包括使用促透劑、超聲、激光、電穿孔、微針等方法。其中微針被認為是最具前景的一項新型透皮應(yīng)用技術(shù)，并且已有微針類疫苗進入臨床試驗階段[31]。微針技術(shù)無痛且可自行接種，適合疫苗的需求[32]，但在規(guī)?；圃爝^程中存在生產(chǎn)效率和重現(xiàn)性較低，以及生產(chǎn)成本相對過高的問題，使得微針類疫苗的市場化推廣存在較大的技術(shù)性障礙。

近年來，隨著納米材料和技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究表明納米粒子能夠通過不同機制透過角質(zhì)層，從而進入更深層的皮膚組織。正常的皮膚角質(zhì)層含有直徑小于10 nm的孔隙，納米粒子可與脂質(zhì)相互作用，增加脂質(zhì)流動，因此小粒徑的剛性納米粒子有可能穿透角質(zhì)層。一些有機納米顆粒，聯(lián)合應(yīng)用透皮制劑技術(shù)，如脂質(zhì)體、膠束、納米乳等，可降低皮膚擴散的屏障。對于粒徑較大的納米粒子，有研究認為還可依靠毛囊等旁路途徑進入皮膚。另外，納米粒子的親疏水性也與其透皮性密切相關(guān)[33]。

目前學界關(guān)于膠體金的透皮性尚無統(tǒng)一定論。有日本的研究結(jié)果顯示，15 nm的膠體金相對于102和198 nm的膠體金，在皮膚深層的數(shù)量明顯增加，而198 nm的金納米粒子則主要聚集在表皮區(qū)域[34]。之后Huang等[35]的研究也支持了小粒徑膠體金有助于透皮的觀點。他們發(fā)現(xiàn)5 nm膠體金可廣泛分布在表皮層和真皮層，在毛囊區(qū)域并沒有觀察到膠體金，認為5 nm膠體金通過與皮膚脂質(zhì)相互作用，可使角質(zhì)層出現(xiàn)短暫且可逆的開放，允許膠體金及蛋白分子透過。然而有人針對其操作方法中的“在膠體金處理前先用紗布潤濕小鼠皮膚10 min”提出了質(zhì)疑，認為該處理可能會破壞小鼠皮膚的結(jié)構(gòu)，從而增加膠體金的皮膚透過性[36]。

Raju等[37]研究了不同粒徑的膠體金對大鼠足底的透過性，將大鼠后足暴露于不同粒徑的膠體金3 h，然后取后足皮膚進行切片染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒徑為22、105和186 nm的膠體金在3 h后均能透過角質(zhì)層進入表皮深層。

盡管關(guān)于膠體金的透皮依然存在爭議，但最近的一些研究顯示通過對膠體金進行表面修飾或與近紅外聯(lián)用能有效增加膠體金的透皮性。Hsiao等[38]考察了平均粒徑為10 nm的膠體金，以及分別經(jīng)過PEG（GNS-PEG）和PEG油酰胺（GNSPEG-OAm）修飾的膠體金，在與大鼠皮膚作用24 h后的皮膚透過情況，結(jié)果均顯示普通膠體金只在角質(zhì)層聚集，而修飾的膠體金能滲透到深層皮膚組織，尤其GNS-PEG-OAm在大鼠各層皮膚組織均有分布，且還能觀察到在皮下脂肪組織聚集。另外研究還發(fā)現(xiàn)GNS-PEG-OAm在毛囊區(qū)域顯著增多，提示其可能通過毛囊途徑進入皮膚。隨后該課題組又繼續(xù)考察了PEG-OAm修飾的不同形狀和粒徑的膠體金的透皮效果，結(jié)果顯示GNP-PEG-OAm的透皮能力還與膠體金的形狀相關(guān)，但與粒徑大小無關(guān)。棒狀的膠體金在表皮的富集量是球狀的1.9倍，而在皮下脂肪組織的富集量是球狀的1.7倍[39]。

作者團隊也曾同樣研究過膠體金作為蛋白類抗原經(jīng)皮遞送載體的可能性，但結(jié)果表明小粒徑GNPs作為蛋白透皮載體的能力非常有限，在不破壞角質(zhì)層的情況下無法實現(xiàn)透皮免疫[20]。

日本有研究者[40]利用金納米棒的光熱效應(yīng)對大分子的透皮遞送及其影響進行了探討。體外研究發(fā)現(xiàn)，金納米棒在低功率連續(xù)近紅外（能使皮膚升溫）和脈沖近紅外（不改變皮膚溫度）聯(lián)合應(yīng)用下均能促進OVA蛋白的透皮遞送。然而體內(nèi)研究卻發(fā)現(xiàn)，采用相同強度的脈沖近紅外照射皮膚，并不能明顯促進OVA的透皮效果，而額外借助一些輔助設(shè)備，如圓筒小杯或采用多糖類凝膠，將金納米棒局限在某一區(qū)域內(nèi)，可增強OVA的透皮效果。

由此可見，膠體金在無針免疫的具體應(yīng)用過程中，除了考慮自身的理化性質(zhì)和表面修飾以外，還需要選擇和借助合適的劑型和應(yīng)用手段。

4 膠體金在疫苗應(yīng)用中存在的問題及展望

雖然膠體金或金復合物已有幾項產(chǎn)品獲批用于臨床治療某些疾病，如Auranofin、Solganal和Myochrysine，但尚未真正實現(xiàn)在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用，分析原因可能有幾方面。

首先，關(guān)于膠體金的免疫佐劑效應(yīng)缺乏系統(tǒng)深入的研究。雖然有很多針對膠體金的粒徑、形狀及表面修飾對免疫應(yīng)答影響的研究，但其潛在機制尚未得到論證。第二，雖然膠體金合成過程簡單，但在合成粒徑均一、重現(xiàn)性良好的非聚集態(tài)納米顆粒方面仍存在困難。第三，目前缺乏有效的膠體金定量方法，使得產(chǎn)品質(zhì)量控制存在一定困難。第四，對膠體金的物理特性如何影響其體內(nèi)分布及代謝的理解還不夠深入和全面，導致對膠體金的生物安全性還存在某些爭議。因此，結(jié)合現(xiàn)代藥劑技術(shù)，進一步優(yōu)化不同粒徑、形狀膠體金的合成工藝，探究膠體金定量方法非常關(guān)鍵。同時，了解不同膠體金的體內(nèi)動力學過程及其與免疫系統(tǒng)的相互作用，將有助于膠體金的臨床轉(zhuǎn)化。

大量研究已證明膠體金能與機體免疫細胞相互作用，促進免疫相關(guān)細胞因子的釋放，具有較好的疫苗遞送能力和免疫佐劑效應(yīng)。雖然關(guān)于膠體金與免疫系統(tǒng)的具體作用機制尚不明確，膠體金的規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量檢測等技術(shù)性問題也尚待解決，但隨著對膠體金不斷的深入研究，在不久的將來有望能夠真正實現(xiàn)膠體金作為疫苗的新一代載體和佐劑，以及在疫苗無針化免疫接種中的應(yīng)用。