閆宇輝，張二飛，李紅艷，殷 紫，盧營博，馮 鋒*

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)退行性疾病，臨床特征主要涉及記憶和其他認(rèn)知功能的進(jìn)行性喪失，典型病理特征是β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積、tau 蛋白高度磷酸化和神經(jīng)纖維的纏結(jié)［1］。僅在2010 年，據(jù)估計全世界范圍內(nèi)疾病藥物治療費(fèi)用為604 億美元，阿爾茨海默病的成本就達(dá)到了172 億美元，高達(dá)28.47%，全世界的阿爾茨海默病病例數(shù)目（目前估計為3 600 萬）將在2050 年前增加3 倍［2］。因此，開發(fā)和研制有效治療阿爾茨海默病的新藥物是目前醫(yī)藥界亟待解決的重大問題。關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制，目前尚未有確切的結(jié)論。在眾多阿爾茨海默病的致病學(xué)說中，Aβ 級聯(lián)假說得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。該學(xué)說認(rèn)為阿爾茨海默病的發(fā)病與Aβ 異常沉積造成神經(jīng)元損傷密切相關(guān)［3］。

楮實子Fructus Broussonetiae首載于《名醫(yī)別錄》，是?？浦参飿?gòu)樹的干燥成熟果實，被奉為上品。王丹丹等［4］應(yīng)用補(bǔ)腎益精方治療阿爾茨海默病臨床及實驗均證實有效，該方主要藥物就包括楮實子在內(nèi)。楮實子甘寒而無毒，藥理學(xué)研究顯示，楮實子中含有多種化學(xué)成分，如氨基酸、脂肪酸、紅色素、多糖等［5-7］，其藥理作用包括抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老等多個方面［8-14］。但楮實子對APP 基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞是否具有神經(jīng)保護(hù)作用鮮有報道。本實驗采用淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Human Neuroblastoma cell，SH-SY5Y），模擬Aβ 沉積致阿爾茨海默病發(fā)病的細(xì)胞模型，研究楮實子提取物對APP 基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，為楮實子治療阿爾茨海默病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 楮實子水提物的制備 楮實子購自安徽毫州藥材市場，精密稱取100 g，加入蒸餾水浸泡1 h，然后煎煮2 次，2 h／次，用100 目篩過濾藥渣，合并2 次濾液，濃縮至150 mL左右，將濃縮液倒入無菌的200 mL 燒杯中，用無菌的培養(yǎng)皿蓋住燒杯，繼續(xù)濃縮藥液至體積為100 mL。將藥液轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，無菌條件下，將藥液分裝至離心管中離心，1 000 r／min 離心5 min，取上清液（即為楮實子水提物原液），其生藥量為1 g／mL。實驗時，先將楮實子水提物用少量細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，用0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌，再用適量細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至其終質(zhì)量濃度（與細(xì)胞共同孵育時的）分別為10、5、1 mg／mL。

1.2 細(xì)胞株 SH-SY5Y、人源胚胎腎細(xì)胞293T（human emborynic kidney 293T，HEK 293T）細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)集存庫（American type culture collection，ATCC）。

1.3 試劑 DMEM-F12 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、青-鏈霉素（penicillin-strepotomycin，P／S）購自美國Gibco 公司；感受態(tài)大腸桿菌購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自美國Omega 公司；LB 固體和液體培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP 慢病毒載體購自美國System Biosciences 公司；pLP1、pLP2 和pLP／VSVG 質(zhì)粒購自美國Invitrogen 公司；cell counting kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本Dojindo 公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；DAPI 染色液購自美國Sigma 公司；兔抗Aβ1－42、p-CREB、BDNF 單克隆抗體購于北京Bioss 生物技術(shù)有限公司；Cy3 標(biāo)記羊抗兔IgG 購于美國Jackson 公司；全蛋白提取試劑盒、5×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液、ECL 檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.4 儀器 Ti-S 型熒光顯微鏡（日本尼康公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）；實時熒光定量PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別采用含有10% FBS 和1% P／S 的DMEM-F12 或DMEM 高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y、HEK 293T 細(xì)胞。將細(xì)胞放置在37 ℃、5% CO2、95% air 的培養(yǎng)箱中，每3～4 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，后續(xù)實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

2.2 慢病毒包裝轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞［15］取pCDHCMVMCS-EF1-copGFP（只表達(dá)GFP）慢病毒載體，將含突變位點(diǎn)的APP 基因片段用XbaI和NotI雙酶切后插入該載體，使其同時表達(dá)APP-GFP。用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞后，接種于含有50 μg／mL 氨芐青霉素LB 固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃培養(yǎng)16～20 h 后。挑取單克隆菌落，將其轉(zhuǎn)移至LB 液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含50 μg／mL 氨芐青霉素），在37 ℃條件下振蕩培育16 h，再將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000 r／min 離心2 min，棄去上清，應(yīng)用質(zhì)粒小提試劑盒抽提其中的APP 質(zhì)粒。取培養(yǎng)至80%～90%融合度的HEK 293T 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按照APP（15 μg）、pLP1（6.5 μg）、pLP2（2.5 μg）、pLP／VSV-G（3.5 μg）的比例，用Lipofectamine2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，對照組轉(zhuǎn)染只表達(dá)GFP 的空白pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP載體。常規(guī)培養(yǎng)HEK 293T 細(xì)胞，24 h 后置于熒光顯微鏡下觀察，可見2 組細(xì)胞都呈現(xiàn)綠色熒光。分別收集24、48、72 h 的HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng)液上清（內(nèi)含病毒），離心、濃縮后檢測病毒滴度，用濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞，3 d 后對SH-SY5Y 細(xì)胞中的APP 進(jìn)行免疫熒光染色，檢測APP 在SH-SY5Y 細(xì)胞中的表達(dá)情況。

2.3 分組及給藥 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞分為對照組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP 的SH-SY5Y 細(xì)胞）、模型組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP 基因的SH-SY5Y 細(xì)胞）和給藥組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP 基因的SHSY5Y 細(xì)胞，分別給予不同質(zhì)量濃度的楮實子水提物共培養(yǎng)24 h）。

2.4 檢測細(xì)胞活力 采用CCK-8 法。將上述各組細(xì)胞以1×108／L的濃度接種于96 孔板中，每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，以含有不同質(zhì)量濃度楮實子水提物（10、5、1 mg／mL）的DMEM-F12 完全培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對照組和模型組只更換不含藥物的新鮮DMEM-F12 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h 后取出培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測各孔OD值，并記錄結(jié)果?？瞻捉M只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞，其它實驗步驟同實驗組。以對照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組與之相比，計算細(xì)胞存活率。

2.5 檢測細(xì)胞LDH 釋放率 各組細(xì)胞以1×108／L 的濃度接種于96 孔板中，每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，以含有10 mg／mL 楮實子水提物的DMEM-F12 完全培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對照組和模型組只更換不含藥物的新鮮DMEMF12 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集以上各組細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書操作，在510 nm 處用酶標(biāo)儀檢測各孔的OD值，計算細(xì)胞釋放至上清液中的LDH 值。每孔剩余的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 溶液清洗3 次，然后加入預(yù)冷的2%TritonX-100 溶液0.1 mL，采用3 次反復(fù)凍融吹打的方法使細(xì)胞充分裂解，12 000×g離心3 min，取各組細(xì)胞上清液按照試劑盒說明書要求，在510 nm 處用酶標(biāo)儀檢測OD值，計算細(xì)胞內(nèi)的LDH 值。LDH 釋放率＝［細(xì)胞上清液中LDH值／（細(xì)胞上清液LDH 值＋細(xì)胞內(nèi)LDH 值）］×100%。

2.6 檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、BaxmRNA 的表達(dá)采用qRT-PCR 法。將各組細(xì)胞置于含有完全培養(yǎng)基的6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后，以含有10 mg／mL 楮實子水提物的DMEM-F12 完全培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對照組和模型組只更換不含藥物的新鮮DMEM-F12 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用Trizol 提取各組RNA，按照說明書步驟反轉(zhuǎn)成cDNA，取2 μL cDNA 為模板，按照qRT-PCR 說明書進(jìn)行體外擴(kuò)增，以β-actin 作為內(nèi)參，DNA引物序列見表1。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃30 s，延伸72 ℃60 s，循環(huán)30 次，72 ℃1 min。結(jié)果使用2－△△CT法計算基因相對表達(dá)變化，重復(fù)3 次。

2.7 檢測細(xì)胞中Aβ1－42蛋白的表達(dá) 采用Western blot 法。將各組細(xì)胞置于含有完全培養(yǎng)基的6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后，以含有10 mg／mL 楮實子水提物的DMEMF12 完全培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對照組和模型組只更換不含藥物的新鮮DMEM-F12 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol／L 的PMSF，在冰上裂解30 min。然后將液體轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃條件下離心，取少量上清液用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測。各組蛋白調(diào)整至等濃度后，用等體積的蛋白上樣緩沖液稀釋，SDS-PAGE 電泳分離。轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜，用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶500 稀釋的Aβ1－42一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次后，加入二抗置搖床上室溫孵育1 h，采用ECL 發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J 軟件分析圖像，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（βactin）的光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 基因序列

2.8 檢測細(xì)胞中Aβ1－42、p-CREB、BDNF 蛋白的表達(dá) 采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法。將各組細(xì)胞置于含有完全培養(yǎng)基的96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，以含有10 mg／mL 楮實子水提物的DMEM-F12 完全培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對照組和模型組只更換不含藥物的新鮮DMEM-F12 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心棄去各孔上清液，用1×PBS 液洗滌3 次。每孔中加入4%多聚甲醛固定15～30 min，用1×PBS 液洗滌3 次。再向各孔中加入0.1% Tritox X-100，使其充分透化15～30 min，再用1×PBS 液小心洗滌3 次。將Aβ1－42、p-CREB 及BDNF 一抗以1∶150 稀釋后加入到各個孔中，4 ℃孵育過夜。將相應(yīng)的二抗以1∶200 稀釋后加入到各孔中，1 h 后用1×PBS 液洗去二抗，再加入DAPI 染色液（1∶50），室溫避光放置10 min 后用1×PBS 液小心洗滌3次。放置在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件處理分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析及多元相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 構(gòu)建APP 高表達(dá)的SH-SY5Y 細(xì)胞 采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法對轉(zhuǎn)染APP 基因3 d 后的SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行染色。如圖1 所示，各組細(xì)胞中均可觀察到較強(qiáng)的GFP 熒光，說明病毒有效轉(zhuǎn)染了細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約為93%；而APP 只在模型組細(xì)胞中高表達(dá)，在對照組中僅有微弱表達(dá)，說明成功建立了阿爾茨海默病細(xì)胞模型。

圖1 SH-SY5Y 細(xì)胞中APP 表達(dá)的檢測（×20）

3.2 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞活力下降（P＜0.01），而5、10 mg／mL 楮實子水提物細(xì)胞活力高于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。在后續(xù)實驗中，以10 mg／mL作為楮實子水提物的給藥量。

3.3 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞LDH 釋放率的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞LDH 的釋放率增加（P＜0.01），其釋放量達(dá)到對照組的2 倍以上（P＜0.01）；與模型組比較，楮實子水提物（10 mg／mL）組能夠降低細(xì)胞的LDH 釋放率（P＜0.01），說明楮實子水提物能夠減輕轉(zhuǎn)染APP 的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷。

3.4 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的影響 文獻(xiàn)報道，抗凋亡基因Bcl-2 和促凋亡基因Bax基因水平之間的平衡對于調(diào)控細(xì)胞凋亡至關(guān)重要［16］。如圖4 所示，與對照組比較，模型組BaxmRNA 水平升高，Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，楮實子水提物10 mg／mL 組能夠下調(diào)BaxmRNA 表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2 mRNA 表達(dá)（P＜0.01），并能夠減少Bax／Bcl-2 比值，這可能有助于增加細(xì)胞活力。

3.5 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Aβ 蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞中Aβ 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，10 mg／mL 楮實子水提物降低Aβ 蛋白表達(dá)（P＜0.05），提示楮實子水提物能夠顯著抑制APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的Aβ 蛋白表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)

圖3 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞LDH 釋放率的影響

圖4 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Bax、 Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響

圖5 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Aβ 蛋白表達(dá)的影響

3.6 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞p-CREB、BDNF 蛋白表達(dá)的影響 如圖6 所示，與對照組比較，模型組p-CREB、BDNF 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；經(jīng)楮實子水提物給藥后，p-CREB、BDNF 蛋白表達(dá)較模型組增加（P＜0.01），說明楮實子水提物能夠增加CREB 的磷酸化，進(jìn)一步可以上調(diào)其下游靶蛋白BDNF 表達(dá)，發(fā)揮一定的神經(jīng)營養(yǎng)作用。

4 討論

圖6 楮實子水提物對APP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞p-CREB、BDNF 蛋白的表達(dá)

SH-SY5Y 目前廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)研究，其來源于神經(jīng)母細(xì)胞瘤，與神經(jīng)元細(xì)胞在形態(tài)和生理生化功能等方面具有高度相似性。研究發(fā)現(xiàn)，位于21 位染色體上的APP 基因發(fā)生突變時，可致細(xì)胞或動物腦內(nèi)具有神經(jīng)毒性的Aβ 分泌增高，表現(xiàn)出與阿爾茨海默病患者相似的臨床癥狀及病理特征［17］。因此本實驗在構(gòu)建阿爾茨海默病細(xì)胞模型時，采用具有突變位點(diǎn)的APP 基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上研究楮實子水提物是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。

在我國大部分地區(qū)都分布有楮實子，作為補(bǔ)益藥，其滋腎、清肝、明目之功效尤為顯著。近年來，有學(xué)者對楮實子的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了研究，但尚未深入，有研究表明［13-14，18-19］，該藥具有延緩及治療癡呆的作用，但對其治療的機(jī)制尚不明確。在本研究中發(fā)現(xiàn)APP 基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞給予楮實子水提物后能夠顯著提升細(xì)胞活力，減少LDH 的釋放，還能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax／Bcl-2 的比值，對細(xì)胞中Aβ 沉積情況也有顯著的改善。

為了進(jìn)一步研究楮實子水提物對APP 基因轉(zhuǎn)染SHSY5Y 細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制，本研究采用免疫熒光染色法和Western blot 法同時檢測了細(xì)胞中p-CREB 和BDNF 蛋白的表達(dá)。CREB 在真核生物細(xì)胞核內(nèi)普遍表達(dá)，當(dāng)CREB磷酸化被磷酸化之后，其在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞發(fā)育和生存等方面發(fā)揮重要作用。研究報道［20］，p-CREB 參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增加神經(jīng)細(xì)胞可塑性及神經(jīng)發(fā)生，上述作用與p-CREB 增加反向BDNF 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Bcl-2／Bax 比值有關(guān)。本研究的結(jié)果證實了楮實子水提物能夠顯著增加CREB蛋白磷酸化，并上調(diào)BDNF 蛋白的表達(dá)。

綜上所述，我們的實驗證實了楮實子水提物具有確切的神經(jīng)保護(hù)作用，通過激活CREB／BDNF 信號通路，增加細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡并減少Aβ 沉積，為進(jìn)一步開發(fā)楮實子的藥用價值，尤其是在治療阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的新藥開發(fā)中具有重要意義。