張夢圓 魏婷婷 謝田華 姚勇

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是世界上發(fā)病人數(shù)增長最快的流行病之一，2017年全球糖尿病患者總數(shù)為4.25億，預(yù)計(jì)到2045年，這一數(shù)字將達(dá)6.93億(國際糖尿病聯(lián)合會，IDF糖尿病地圖集，第8版)。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是DM最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是世界勞動人口視力下降的主要原因之一[1]。DR主要的病理表現(xiàn)包括非增生性病變(微動脈瘤和微血管異常)和增生性病變(新生血管形成、玻璃體積血和硬性滲出)，其發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是DR發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，Rac1/Nox2信號通路可以通過激活多種信號途徑調(diào)節(jié)活性氧自由基 (reactive oxygen species，ROS) 水平，增加視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，促進(jìn)線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘發(fā)DR。

1 氧化應(yīng)激與DR

正常情況下，超氧自由基的生成和清除處于動態(tài)平衡，而氧化應(yīng)激是自由基過剩的病理狀態(tài)。由于視網(wǎng)膜多元不飽和脂肪酸含量高、氧攝取量大，高糖刺激下視網(wǎng)膜更易發(fā)生氧化應(yīng)激[3]。大量研究表明，蓄積的ROS可導(dǎo)致多元醇通路活化，激活蛋白激酶C，引發(fā)糖基化產(chǎn)物積聚及各種細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素等炎癥因子增加[4-8]，進(jìn)而影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)功能異常。持續(xù)增加的ROS還會破壞線粒體DNA，進(jìn)一步損害電子傳遞鏈，繼而產(chǎn)生更多的自由基，形成惡性循環(huán)[9]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等生理形態(tài)發(fā)生改變，造成血-視網(wǎng)膜屏障破壞，出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏和玻璃體積血，最終導(dǎo)致DR的發(fā)生[10]。氧化應(yīng)激在DR發(fā)病機(jī)制中起重要的促進(jìn)作用。

2 Rac1/Nox2信號通路

2.1 Nox2ROS可由多種途徑產(chǎn)生，其中細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)是主要的產(chǎn)生部位之一[11]。NADPH家族是由催化跨膜亞基(gp91phox、p22phox)和調(diào)節(jié)亞基(p47phox、p67phox、Rac1)等組成的酶復(fù)合體。該復(fù)合體由7個同工型組成，脫氫酶結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域是它們共享的催化核心，電子先后被轉(zhuǎn)移至脫氫酶結(jié)構(gòu)域的FAD和跨膜結(jié)構(gòu)域的內(nèi)外血紅素中，最后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜另一側(cè)，產(chǎn)生超氧化物或過氧化氫物[12]。Nox2是NADPH氧化酶家族成員之一，研究顯示，Nox2在正常視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，但在高糖高脂或缺氧誘導(dǎo)的DR動物模型中表達(dá)顯著增加，提示Nox2與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。

2.2 Rac1Rac1是Rho家族Rac亞家族成員，Rac亞家族有Rac1、Rac2、Rac3以及Rac1剪切突變體Rac1b 4種同工型。它們是一類具有GTP 酶活性的小分子GTP苷結(jié)合蛋白，具有共同的G結(jié)構(gòu)域核心，提供GTP酶與GTP/GDP交換活性，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程[14]。Rac1生物功能的發(fā)揮以GTP 結(jié)合形式(活性狀態(tài))和GDP 結(jié)合形式(非活性狀態(tài))存在[15]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，Rac1處于GTP結(jié)合的活躍形式，參與Nox2的激活[16]。Rac1主要分布于線粒體，在不同細(xì)胞類型中介導(dǎo)不同的生理效應(yīng)。淋巴瘤細(xì)胞中，Bcl2的過表達(dá)抑制Rac1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[17]。但在嗜鉻細(xì)胞瘤中，Rac1與Bcl2的相互作用被認(rèn)為對機(jī)體有利[18]。Rac1也存在于細(xì)胞核，通過調(diào)控PAK1/2向G2期中心體募集，在有絲分裂中起關(guān)鍵作用[19]。Rac1激活PAK和LIM激酶抑制cofilin表達(dá)以及通過激活A(yù)rp2/3調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和免疫細(xì)胞的遷移，參與慢性炎癥的發(fā)生[20]。血-視網(wǎng)膜屏障在視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)中起重要作用，Rac1激活使高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin蛋白表達(dá)降低、β-catenin蛋白表達(dá)升高，VE-cadherin/β-catenin復(fù)合物解離，破壞細(xì)胞間連接，血-視網(wǎng)膜屏障改變，血管通透性增加[21]。

2.3 Rac1/Nox2在DR中的作用Rac1的啟動子區(qū)域具有許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，與正常大鼠相比，DM大鼠的視網(wǎng)膜微血管Rac1啟動子上的 p65亞基結(jié)合增加了3倍。Rac1/Nox2信號上調(diào)誘導(dǎo)線粒體損傷，半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶信號通路被激活而引發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。Rac1還可以激活P38 MAPK應(yīng)激激酶，破壞線粒體及其DNA，加速糖尿病視網(wǎng)膜功能的代謝失調(diào)。Rac1的特異性抑制劑NSC23766在細(xì)胞和動物水平上使P38 MAPK表達(dá)水平下降，改善線粒體功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23]。應(yīng)激激酶除了引起線粒體損傷外，還會導(dǎo)致緊密連接蛋白減少、基質(zhì)金屬蛋白酶活化等生理性改變[24]，加速DR的病理進(jìn)程。Wang等[25]通過視網(wǎng)膜靜脈阻塞的動物模型發(fā)現(xiàn)，敲除Rac1基因可以減少視網(wǎng)膜新生血管形成。Rac1在DR發(fā)生發(fā)展的早期和晚期均發(fā)揮重要作用。

3 Rac1在DR中的調(diào)節(jié)作用

3.1 Rac1的激活和翻譯后修飾眾所周知，蛋白質(zhì)表達(dá)水平及其活性受轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。Rac1活性受到鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanosinc nuclcotide exchange factors，GEFs)、GTPase激活蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)、鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑(guanosinc nuclcotide dissociation inhibitor，GDIs)的調(diào)控[26]。GEF通過釋放結(jié)合的GDP促進(jìn)GTP結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，GAP和 GDI是 Rac1負(fù)性調(diào)控因子，使其失去活性[27]。Rac1可以被Tiam1、Vav2等多個GEF激活，NSC23766 (Tiam1抑制劑) 和Ehop (Vav2抑制劑) 都可顯著減弱Rac1活化，減少線粒體損傷、血管滲漏和毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡[28]。 Sos1蛋白是另外一個重要的GEF， Mishra等[29]研究發(fā)現(xiàn)它受p66Shc(相對分子質(zhì)量為66 000的銜接蛋白)的調(diào)控，p66Shc通過減少Sos1與生長因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)結(jié)合促進(jìn)Rac1激活。Rac1在其C端半胱氨酸殘基上可經(jīng)歷一系列翻譯后修飾，包括甲基化、異戊二烯化、棕櫚酰化和乙?；龋揎椇蟮腞ac1蛋白更具疏水性，可有效結(jié)合到質(zhì)膜上增強(qiáng)蛋白質(zhì)間的相互作用，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[30]。

3.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳修飾DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA的調(diào)控等表觀遺傳修飾對調(diào)節(jié)Rac1與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合也起著重要作用[31]。Sirtuin1(Sirt1)是Ⅲ類組蛋白脫乙酰基酶，其在糖尿病視網(wǎng)膜中顯著低表達(dá)。過表達(dá)Sirt1可減輕線粒體損傷，緩解糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變進(jìn)程[32]。Mishra等[32]在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，Sirt1過表達(dá)會導(dǎo)致p66Shc啟動子區(qū)域H3K9Ac表達(dá)下降和P53結(jié)合減少，繼而調(diào)控Sos1與Rac1的相互作用，改善視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元異常。而抑制Sirt1活性會導(dǎo)致Rac1-Nox2激活增強(qiáng)，誘發(fā)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)使DNA甲基化形成5-甲基胞嘧啶(5mC)抑制基因表達(dá)，雙加氧酶Tets使DNA去甲基化形成5-羥甲基胞嘧啶(5 hmC)刺激基因表達(dá)[33]。Duraisamy等[34]發(fā)現(xiàn)，Dnmt1和Tet2在糖尿病視網(wǎng)膜及其脈管系統(tǒng)中均被激活。與對照相比，高糖孵育的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞在Rac1啟動子處的5hmC水平高2倍，5mC水平降低了50%，而用Dnmts/Tets的藥理抑制劑和小干擾RNA處理后，5hmC和NF-kB表達(dá)減少，并減弱Rac1轉(zhuǎn)錄水平，證實(shí)DNA甲基化/羥甲基化機(jī)制在調(diào)節(jié)Rac1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。近年來，微小RNA(miRNA)已被發(fā)現(xiàn)在DR的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)超過80種miRNA表達(dá)異常升高[35]。 代寶珠等[36]發(fā)現(xiàn)，DR患者血清中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b異常高表達(dá)，提示可能參與DR的發(fā)生發(fā)展。Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA差異表達(dá)可能調(diào)節(jié)Rho蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)攝取和組蛋白賴氨酸甲基化，參與增生性DR的發(fā)病機(jī)制。

4 小結(jié)

綜上所述，Rac1/Nox2信號通路激活在促進(jìn)DR發(fā)展中起重要作用。Rac1-Nox2的激活先于線粒體損傷，一旦線粒體DNA受損，由于電子傳遞鏈功能異常，ROS就會惡性循環(huán)蓄積。因此，抑制Rac1活化是調(diào)控DR的有效途徑，深入Rac1抑制劑的藥理研究將提供更多DR的治療方案，提高療效，緩解疾病進(jìn)展。