劉玉龍，李廣悅，胡 南，李建東，丁德馨

(1.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001；2.中廣核鈾業(yè)發(fā)展有限公司，北京 100029)

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(AcidthiobacillusFerrooxidans,A.f)已被廣泛應(yīng)用于微生物冶金、煤炭脫硫和廢水處理[1-3]。低品位鈾礦石的微生物浸出也取得了良好的效果[4]。微生物在處理土壤重金屬污染過程中也表現(xiàn)出良好的淋濾效果，其首要條件是微生物能適應(yīng)重金屬的環(huán)境[5-6]。

低品位鈾礦石的A.f浸出，是利用A.f的氧化作用從鈾礦石中提取鈾的方法。A.f的氧化作用分為直接氧化作用和間接氧化作用，其中，直接氧化是通過A.f將黃鐵礦、砷黃鐵礦等硫化礦物氧化，實(shí)現(xiàn)鈾礦石中鈾的浸出；而間接氧化則是通過A.f將Fe2+氧化生成Fe3+，隨后Fe3+被用作氧化劑，實(shí)現(xiàn)礦石中鈾的浸出。如果鈾礦石中含有較高品位的重金屬，隨著浸出的進(jìn)行，浸出液中的重金屬離子會富集得越來越多，吸收尾液中重金屬離子的濃度也隨之升高。吳學(xué)玲等[7]的研究表明，在培養(yǎng)液中添加150 mmol/L Cu2+或200 mmol/L Zn2+時(shí)，A.f的生長速率受到明顯抑制，其Fe2+氧化速率出現(xiàn)顯著差異。通常，環(huán)境中高濃度的重金屬離子主要通過改變細(xì)菌細(xì)胞的滲透壓，對細(xì)菌生長產(chǎn)生抑制甚至危害作用。在異常的生長環(huán)境中，細(xì)菌可通過調(diào)整自身的生理反應(yīng)以適應(yīng)滲透壓的變化，從而表現(xiàn)出對重金屬離子的耐受性。但是，細(xì)菌對重金屬離子的耐受性受重金屬離子種類及濃度的影響較大。因此，為增強(qiáng)A.f在實(shí)際礦石浸出液環(huán)境中的適應(yīng)性，需要提高A.f對高濃度重金屬離的耐受性及其氧化活性。

根據(jù)某含Cu、Mn、Cr和Pb鈾礦石的A.f浸出需要，以A.f為試驗(yàn)菌株，采用連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化法提高A.f對Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的耐受性；并結(jié)合其在馴化培養(yǎng)基中的適應(yīng)時(shí)長，確定該菌株對4種重金屬離子的耐受限值，為這類鈾礦石的A.f浸出的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，SPH-200D小容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器，SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，AL-104電子天平，BCD-195KAN冰箱，ALP高壓滅菌器，SH23-2恒溫磁力攪拌器，S20K Seven Easy數(shù)字pH儀。

1.2 試驗(yàn)試劑

本試驗(yàn)所需的化學(xué)藥劑有(NH4)2SO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、H2SO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、3CdSO4·8H2O、Cr2(SO4)3·6H2O、Pb(NO3)2，均為分析純。

1.3 菌種

采用的A.f由本實(shí)驗(yàn)室從中國某鈾礦山酸性礦坑水中分離純化得到，并保存在低溫冰箱中。

1.4 培養(yǎng)基

9K培養(yǎng)基組分：(NH4)2SO4，3 g；K2HPO4，0.5 g；KCl，0.1 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；Ca(NO3)2，0.01 g；FeSO4·7H2O，23 g；蒸餾水，1 000 mL。9K培養(yǎng)基pH=2.0，121 ℃滅菌15 min。

在9K培養(yǎng)基中，加入Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+重金屬離子，配制成不同濃度的馴化培養(yǎng)基。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 配制培養(yǎng)基

按照9K培養(yǎng)基的配方稱取化學(xué)試劑。先將除FeSO4·7H2O外的所有化學(xué)試劑倒入燒杯，用磁力攪拌器攪拌，將pH調(diào)節(jié)至2.5；再繼續(xù)攪拌至所有化學(xué)試劑溶解后，加入FeSO4·7H2O，調(diào)節(jié)pH，使其穩(wěn)定在2.0。

1.5.2A.f活化

將500 mL的三角燒瓶滅菌后，向其中倒入300 mL 9K培養(yǎng)基，加入50 mL菌液。測量溶液初始電位，用牛皮紙包好瓶口，放入SPH-200D小容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)，當(dāng)溶液的電位達(dá)到-500 mV時(shí)，取出備用。

1.5.3A.f氧化活性的表征

A.f通過把培養(yǎng)基中的Fe2+氧化為Fe3+獲得生長需要的能量。如果培養(yǎng)基中的電位持續(xù)升高，則表明A.f生長活性較高；當(dāng)培養(yǎng)基中的氧化還原電位達(dá)到-500～-550 mV時(shí)，培養(yǎng)基中Fe2+的氧化比例達(dá)100%，表明A.f處于生長旺盛期[13]。此外，A.f在馴化培養(yǎng)過程中的適應(yīng)時(shí)長與其氧化活性存在一定的相關(guān)性。A.f的氧化活性通過綜合培養(yǎng)基的氧化還原電位和A.f的適應(yīng)時(shí)長進(jìn)行表征。

1.5.4 耐重金屬離子馴化試驗(yàn)

將150 mL的三角燒瓶滅菌后，倒入80 mL的9K培養(yǎng)基，并接種20 mL的活化菌液。接種完成后，在培養(yǎng)基與菌液的混合體系中加入不同質(zhì)量濃度的重金屬離子?；旌暇鶆蚝螅瑴y量初始溶液的電位和pH，并用牛皮紙包好瓶口，放入轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為30 ℃的SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，定期測量溶液的電位和pH。培養(yǎng)時(shí)間在2 d內(nèi)時(shí)，每3 h測量一次；培養(yǎng)時(shí)間超過2 d時(shí)，每24 h測量一次。當(dāng)溶液的電位超過-550 mV并趨于穩(wěn)定時(shí)，表明該菌株能適應(yīng)極端環(huán)境，對重金屬離子產(chǎn)生了耐受性。取該菌液作為下一步耐重金屬離子馴化試驗(yàn)的出發(fā)菌，按50%的接種量將馴化菌轉(zhuǎn)接到具有更高重金屬離子濃度的馴化培養(yǎng)基中。如此反復(fù)，直至該馴化菌的適應(yīng)時(shí)長發(fā)生突變，此時(shí)的重金屬離子濃度即為本研究中A.f的耐受限值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 A.f耐Cu2+馴化試驗(yàn)

A.f耐Cu2+馴化的試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 A.f耐Cu2+馴化試驗(yàn)結(jié)果

從表1可看出，與對照樣相比，接種于Cu2+質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0和6.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中的A.f，其生長活性明顯降低，完全氧化馴化培養(yǎng)基中Fe2+的時(shí)間由0.5 d延長至4～5 d。適應(yīng)時(shí)長的延長表明這3種質(zhì)量濃度的Cu2+對A.f有較強(qiáng)的毒害作用，抑制了A.f的生長繁殖，致使A.f需要經(jīng)過一定時(shí)間的調(diào)整或改變代謝途徑來適應(yīng)新的環(huán)境[14]。

將Cu2+質(zhì)量濃度為6.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中的A.f進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到Cu2+質(zhì)量濃度相同的馴化培養(yǎng)基中，A.f氧化Fe2+的能力和效率明顯提升，完全氧化Fe2+的時(shí)間由5 d縮短至2 d，表明連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)較大程度提高了A.f的馴化速度和效果。將上一級馴化后的A.f連續(xù)轉(zhuǎn)接至Cu2+質(zhì)量濃度分別為12.0、18.0和26.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中，A.f完全氧化馴化培養(yǎng)基中Fe2+的時(shí)間分別為2、3和4 d，表明經(jīng)過馴化的A.f在逐步提高Cu2+質(zhì)量濃度時(shí)，其氧化活性逐漸降低，二者具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到30.0 g/L時(shí)，A.f的生長能力及對Fe2+的氧化能力受到強(qiáng)烈的抑制，第9天才能把馴化培養(yǎng)基中的Fe2+完全氧化。這與李洪枚[15]的研究結(jié)果一致，即Cu2+質(zhì)量濃度在20.0～30.0 g/L的范圍內(nèi)，通過馴化能提高A.f的生長活性。當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Cu2+的質(zhì)量濃度達(dá)到34.0 g/L時(shí)，A.f在馴化培養(yǎng)基中的適應(yīng)時(shí)長發(fā)生突變，完全氧化馴化培養(yǎng)基中Fe2+的時(shí)間為23 d，表明此濃度下A.f的生長能力和氧化活性受到了較強(qiáng)的抑制和危害，即達(dá)到A.f生長可耐受的Cu2+濃度限值。

2.2 A.f耐Mn2+馴化試驗(yàn)

A.f耐Mn2+馴化的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 A.f耐Mn2+馴化試驗(yàn)結(jié)果

從表2可看出，與對照樣相比，當(dāng)A.f接種在Mn2+質(zhì)量濃度分別為1.8、3.6和5.4 g/L的馴化培養(yǎng)基中時(shí)，完全氧化Fe2+的時(shí)間由0.5 d延長至4～5 d。Mn2+對A.f有較大的毒害作用，對其生長有較強(qiáng)的抑制作用，使其氧化活性維持在較低水平。因此，A.f在Mn2+存在的環(huán)境中需要一個(gè)較長的適應(yīng)過程。

將Mn2+質(zhì)量濃度為5.4 g/L的馴化培養(yǎng)基中的A.f進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到Mn2+質(zhì)量濃度相同的馴化培養(yǎng)基中，A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間由5 d縮短至3 d，表明連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化可以明顯提高A.f對Mn2+的耐受性。將馴化培養(yǎng)基中Mn2+的質(zhì)量濃度逐步提高至10.8、16.2、21.6、28.8和34.2 g/L，A.f完全氧化馴化培養(yǎng)基中Fe2+的時(shí)間由1 d逐步延長至6 d。滕青等[16]研究表明，Mn2+質(zhì)量濃度越大，A.f對環(huán)境的適應(yīng)性越弱，遲緩期越長，A.f的比生長速率越小，進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間越久。因此，隨著Mn2+質(zhì)量濃度升高，A.f適應(yīng)時(shí)長延長的主要原因可能是A.f的生長活性受到抑制。

當(dāng)馴化培養(yǎng)基中的Mn2+質(zhì)量濃度達(dá)到41.4 g/L時(shí)，A.f完全氧化馴化培養(yǎng)基中Fe2+的時(shí)間為8 d。主要原因可能是高質(zhì)量濃度的Mn2+對A.f產(chǎn)生明顯的生理毒害作用，部分A.f因不能適應(yīng)環(huán)境而死亡，導(dǎo)致A.f的數(shù)量減少，從而影響其對Fe2+的氧化速率。當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Mn2+質(zhì)量濃度達(dá)到45.0 g/L，A.f的適應(yīng)時(shí)長發(fā)生突變，完全氧化Fe2+所需時(shí)間為16 d，表明A.f代謝完全受到抑制，生長活性減弱，此時(shí)的質(zhì)量濃度即為A.f生長可耐受的Mn2+濃度限值。

2.3 A.f耐Cr3+馴化試驗(yàn)

A.f耐Cr3+馴化的試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 A.f耐Cr3+馴化試驗(yàn)結(jié)果

從表3可看出，Cr3+對A.f的毒害及阻生作用極其強(qiáng)烈。有關(guān)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在Cr3+濃度較低時(shí)，可抑制A.f生長。當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Cr3+質(zhì)量濃度僅為0.3 g/L時(shí)，A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間為4 d，比對照樣中A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間延長了3.5 d。Cr3+質(zhì)量濃度為0.6和0.9 g/L的馴化培養(yǎng)基中，A.f完全氧化Fe2+也需要6 d的時(shí)間，表明即使較低質(zhì)量濃度的Cr3+也能明顯抑制A.f的生長和氧化活性。

將在Cr3+質(zhì)量濃度為0.9 g/L的馴化培養(yǎng)基中馴化過的A.f逐級連續(xù)轉(zhuǎn)接至1.2和1.5 g/L的培養(yǎng)基中，A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間均為4 d，比在Cr3+質(zhì)量濃度為0.9 g/L的馴化培養(yǎng)基中的馴化時(shí)間縮短了2 d。結(jié)果表明連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化有效提高了A.f對Cr3+的耐受性，在較短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)了新環(huán)境，氧化活性得到了提高。

將馴化培養(yǎng)基中的Cr3+質(zhì)量濃度提高至1.8 g/L后，連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化后A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間成倍增長，達(dá)到9 d，表明該質(zhì)量濃度對A.f產(chǎn)生了很強(qiáng)的抑制作用，導(dǎo)致A.f氧化活性明顯降低。當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Cr3+質(zhì)量濃度提高至2.1 g/L時(shí)，A.f的生理活動(dòng)受到較強(qiáng)的毒害，氧化活性明顯降低，即達(dá)到A.f生長可耐受的Cr3+濃度限值。

2.4 A.f耐Pb2+馴化試驗(yàn)

A.f耐Pb2+馴化的試驗(yàn)結(jié)果見表4。

從表4可看出，將A.f接種到Pb2+質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5和2.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中，其完全氧化Fe2+的時(shí)間由0.5 d延長至5 d。該現(xiàn)象表明，Pb2+對A.f的生長活性影響較大。當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Pb2+質(zhì)量濃度逐漸增大時(shí)，A.f的活性明顯降低，其生長受到抑制。晏銘等[18]的研究同樣表明，A.f對Pb2+有一定的耐受性，通過馴化能篩選出耐受性強(qiáng)、生長活性高的性能優(yōu)良的菌種。

將Pb2+質(zhì)量濃度為2.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中的A.f接種至Pb2+質(zhì)量濃度為2.5 g/L的馴化培養(yǎng)基中，A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間由5 d縮短至3 d。結(jié)果表明A.f在連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化下，很快適應(yīng)了環(huán)境，增強(qiáng)了其對Pb2+的耐受性。將上一級馴化的菌液再次轉(zhuǎn)接到Pb2+質(zhì)量濃度為3.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中，A.f完全氧化Fe2+的時(shí)間由3 d延長至8 d，表明3.0 g/L的Pb2+對A.f產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

當(dāng)馴化培養(yǎng)基中Pb2+質(zhì)量濃度達(dá)到3.5 g/L時(shí)，A.f需要相當(dāng)長一段時(shí)間(17 d)來適應(yīng)這一濃度，A.f生長基本處于停滯狀態(tài)，細(xì)菌的氧化活性受到較強(qiáng)的抑制作用，此時(shí)的質(zhì)量濃度即為A.f生長可耐受的Pb2+濃度限值。

3 結(jié)論

1)Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的質(zhì)量濃度越高，對A.f的生理毒害作用及生長抑制作用越明顯。4種重金屬離子對A.f的生理毒害作用的強(qiáng)弱排序?yàn)镃r3+>Pb2+>Cu2+>Mn2+。

2)接種比例為50%的連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化是一種可有效提高A.f對重金屬離子的耐受性和A.f的氧化活性的馴化方式。經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化后，A.f對重金屬離子的耐受能力明顯提高，生長停滯期縮短，氧化活性顯著提高。

3)在接種比例為50%的連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化條件下，A.f對Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的耐受限值分別為34.0、45.0、2.1和3.5 g/L。當(dāng)重金屬離子的質(zhì)量濃度在耐受限值內(nèi)時(shí)，連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化可以快速提高A.f對重金屬離子的適應(yīng)性及A.f的氧化活性；當(dāng)重金屬離子質(zhì)量濃度高于耐受限值時(shí)，A.f的生長基本處于停滯狀態(tài)，氧化活性較低。在后續(xù)的研究中可進(jìn)行高濃度下的等濃度連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)，以最大限度地提高A.f對重金屬離子的耐受性。