李東麗 宮媛媛

基于不同細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用已成為其治療包括心肌缺血、缺血性腦卒中等在內(nèi)各種組織來源的缺血性疾病最有前景的策略[1-3]。目前正在針對越來越廣泛的疾病適應(yīng)證進(jìn)行各種動(dòng)物模型研究和臨床試驗(yàn)，而其衍生的外泌體(exosomes)因含蛋白因子、脂質(zhì)體、RNA、DNA 片段等傳遞細(xì)胞間信號作用和特有的一些優(yōu)勢，從而成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn);需要特別提出的是，根據(jù)細(xì)胞類型、細(xì)胞大小、細(xì)胞所處微環(huán)境變化，外泌體的內(nèi)容物成分呈差異性表達(dá)。研究證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞及干細(xì)胞分泌的外泌體在神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程及損傷

修復(fù)機(jī)制中起重要的調(diào)控作用[4]。因此，MSCs衍生的外泌體可能提供治療前部缺血性視神經(jīng)病變(anterior ischemic optic neuropathy，AION)和潛在的其他視網(wǎng)膜血管相關(guān)疾病新的安全的有效工具。

1 AION概述

AION是50歲以上患者最常見的由于后睫狀動(dòng)脈循環(huán)障礙造成視盤供血不足，引起視神經(jīng)急性缺氧而水腫的一種病變，由于對本病的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識不充分，臨床上尚缺乏療效確切的治療方案[5]。非動(dòng)脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(non arteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是缺血性視神經(jīng)病變的最常見形式，故以下探討的AION均指非動(dòng)脈炎性。研究顯示，這種形式的病變與各種危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括高齡、系統(tǒng)性高血壓、夜間低血壓、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、高脂血癥等，血管活性藥物的使用可能是NAION的另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素，盡管已經(jīng)報(bào)道了許多血管活性藥物與NAION的關(guān)聯(lián)，但沒有一個(gè)被證明是最終明確的因果關(guān)系，對其發(fā)病機(jī)制也知之甚少[6]。

NAION可被稱為類似發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)中的腦卒中，其通常導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失，可單側(cè)或雙側(cè)，患者通常表現(xiàn)出與視野缺損相關(guān)的急性、無痛性的視力喪失、相對傳入性瞳孔障礙、視盤腫脹和一個(gè)或多個(gè)火焰形狀的視盤周圍視網(wǎng)膜少量出血。視力喪失在首次發(fā)生后2個(gè)月內(nèi)通常保持穩(wěn)定，之后逐漸發(fā)展為彌漫性或節(jié)段性視盤蒼白，伴繼發(fā)性萎縮。研究顯示，對側(cè)眼隨訪5 a內(nèi)的NAION發(fā)生率為14.7%，第二眼受累的風(fēng)險(xiǎn)多為更差的基線視力或糖尿病等。NAION的組織病理學(xué)涉及缺血性水腫、海綿狀變性、視神經(jīng)軸突萎縮以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡[7]。藥物治療包括抗凝血藥物、抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物、皮質(zhì)類固醇和促紅細(xì)胞生成素等，但均未確切地被證明是持續(xù)有益的[8-9]。通過口服、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)或眼球下Tenons途徑給予類固醇的長期療效仍不確定[10]；有證據(jù)表明，視神經(jīng)開窗手術(shù)無效并且可能有害[11]。因此,迫切需要尋找有效的治療策略。干細(xì)胞療法可以進(jìn)行組織再生，目標(biāo)是恢復(fù)或替換受損的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)和缺氧損傷中受損和(或)退化的神經(jīng)元。目前已經(jīng)探索了不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其衍生的外泌體作為潛在治療工具。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體的發(fā)生及其生物作用

MSCs為一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞亞組，在修復(fù)組織損傷、抑制局部炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的治療潛力和安全性已得到眾多研究的支持。然而，使用MSCs有一些缺點(diǎn)，如需要具有穩(wěn)定的表型，成本高和生產(chǎn)儲存時(shí)間延遲等。此外，已經(jīng)報(bào)道了其在異位組織形成、細(xì)胞排斥等中的一系列問題[12]。研究表明，MSCs可以通過直接分化和旁分泌機(jī)制將分子(如生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外微泡)分泌到周圍環(huán)境中實(shí)現(xiàn)治療效果；在這些旁分泌分子中，外泌體在疾病診斷和治療中顯示出重要功能[13-14]。外泌體是一種幾乎可由所有類型細(xì)胞分泌到胞外空間的具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的納米級囊泡，含有其母體細(xì)胞多種特異的結(jié)構(gòu)成分及其特性。目前外泌體神經(jīng)相關(guān)研究的治療效果已廣泛歸因于其表面標(biāo)志物、分子內(nèi)容物、低免疫原性、穿過血-腦脊液屏障的能力以及介導(dǎo)神經(jīng)再生的作用[15]。然而，與外泌體類似，間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(MSC-exosomes)也攜帶核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等復(fù)雜物質(zhì)。通過質(zhì)譜、抗體陣列和微陣列分析，已經(jīng)在MSC-exosomes的內(nèi)容物中鑒定了超過850種獨(dú)特的基因產(chǎn)物和多于150種miRNA[16]。這些外泌體蛋白質(zhì)和miRNA的功能是復(fù)雜的，并且涉及許多不同的生物化學(xué)和細(xì)胞過程，如通信、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和再生以及代謝。這種廣泛的生物活性分布賦予MSC-exosomes引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，并與許多細(xì)胞類型相互作用的潛力。

3 MSC-exosomes治療AION的作用機(jī)制

MSCs不僅具有多向分化潛能，并能分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管形成，改善血流灌注和氧供，因此，MSCs一直是缺血性疾病血管再生治療的研究熱點(diǎn)。MSC-exosomes含有MSCs來源的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)和核酸，能夠部分模擬MSCs功能，且能透過血-腦脊液屏障，可替代MSCs治療缺血性疾病的再血管化治療。最近，MSC-exosomes也已經(jīng)在各種神經(jīng)和神經(jīng)退行性疾病的治療中顯示出令人鼓舞的治療功效，包括創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中和阿爾茨海默病等[17]。然而，在AION中，視網(wǎng)膜的特殊結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)更方便的位置來研究MSC-exosomes的缺血后神經(jīng)修復(fù)功能和其在視網(wǎng)膜中的分布。MSC-exosomes成功地將營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)因子遞送至視網(wǎng)膜內(nèi)部，并有效促進(jìn)受損RGCs的存活和神經(jīng)再生。外泌體在介導(dǎo)MSCs作為基質(zhì)支持細(xì)胞的功能中起關(guān)鍵作用，以維持組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)并響應(yīng)外部刺激。目前的各種臨床試驗(yàn)證據(jù)顯示，基于細(xì)胞療法的MSCs不是替代受損細(xì)胞，而是通過向細(xì)胞內(nèi)遞送功能性蛋白質(zhì)分子和miRNA信號來促進(jìn)神經(jīng)可塑性，促進(jìn)血管生成，抑制氧化應(yīng)激和纖維化，減少細(xì)胞凋亡以及起到免疫調(diào)節(jié)作用，為眼部缺血性視神經(jīng)病變重塑建立適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，從而快速啟動(dòng)細(xì)胞修復(fù)功能。以下綜述了MSC-exosomes在治療AION相關(guān)疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的主要作用機(jī)制，為該領(lǐng)域研究者進(jìn)一步探索MSC-exosomes在AION的有效治療提供依據(jù)。

3.1 促進(jìn)神經(jīng)可塑性視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜RGC軸突和支持神經(jīng)膠質(zhì)組成的CNS白質(zhì),這使它們?nèi)菀资艿絼?chuàng)傷性和退行性疾病。ahin等[18]通過光譜域光學(xué)相干斷層掃描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)檢測到慢性期NAION患者眼中黃斑神經(jīng)節(jié)細(xì)胞復(fù)合體和視盤周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度明顯變薄和軸突損傷。雖然手術(shù)或皮質(zhì)類固醇可能使一些患者受益，但由于進(jìn)行性RGC軸突變性和壞死，失去的視力可能是永久性的。已證明基于細(xì)胞療法的MSCs促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性和神經(jīng)血管重塑導(dǎo)致功能獲益[19]。而MSCs通過其衍生的外泌體促進(jìn)神經(jīng)血管重塑，改善神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的發(fā)生。 Mead等[20]用大鼠視神經(jīng)擠壓模型模擬RGC凋亡和軸突變性，玻璃體內(nèi)骨髓MSC-exosomes注射后在OCT和視網(wǎng)膜電圖下顯示了RGC軸突的顯著保護(hù)(以視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度測量)和RGC功能的保留(以pSTR振幅測量)。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC-exosomes促進(jìn)皮層神經(jīng)元的軸突生長，而攜帶升高的miR-17-92的MSC-exosomes進(jìn)一步促進(jìn)這種效應(yīng)。MSC-exosomes也報(bào)道了Akt途徑的激活，這是受損RGC存活和再生的主要途徑[20]?？傊?，數(shù)據(jù)表明MSC-exosomes含有多種miRNA，外泌體成功地將物質(zhì)運(yùn)送到視網(wǎng)膜內(nèi)層以及Müller膠質(zhì)細(xì)胞和RGCs，并通過miRNA依賴性機(jī)制引發(fā)治療效果[20]。RGCs的喪失或功能障礙是不可逆性失明的主要原因，而外泌體可以將生物活性核酸遞送到視網(wǎng)膜內(nèi)多層的能力表明無細(xì)胞療法可能有益于缺血性或退行性神經(jīng)眼病的治療。

3.2 促進(jìn)血管生成研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜視盤旁和脈絡(luò)膜血管密度在急性和慢性NAION患者中顯著減少。 Song等[22]用光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)(optical coherence tomography angiography,OCTA)檢測到NAION患者視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周圍和視神經(jīng)盤的血管密度顯著低于正常組，證實(shí)了此類疾病中視網(wǎng)膜和視盤中的血液灌注不足和微血管的丟失。而缺血后損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素之一就是血管新生。已經(jīng)證明MSCs 外泌體在心肌缺血/再灌注損傷、腦損傷模型中表現(xiàn)出血管保護(hù)作用[23-24]。MSC-exosomes被血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VEC)有效吸收,實(shí)驗(yàn)顯示這些外泌體通過ERK/Akt信號刺激VEC遷移和血管形成[25]；全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，MSC-exosomes表達(dá)涉及血管生成的多種因子，包括核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)相關(guān)的信號蛋白，而NF-κB信號傳導(dǎo)被鑒定其為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)。對促血管生成因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducing factor,EMMPRIN)的水平較高，敲除此基因后VEC 的促血管生成作用明顯減弱。因此，MSC-exosomes強(qiáng)大的促血管生成作用主要是通過外泌體的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(matrix metalloproteinase inducing factor,MMPRIN) 實(shí)現(xiàn)的[26]。外泌體攜帶的miRNA 在MSCs介導(dǎo)的缺血后內(nèi)皮細(xì)胞功能修復(fù)和血管生成中也起重要調(diào)控作用，Saif 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-424 通過靶向cullin 2 促進(jìn)血管新生。研究證明，接觸模擬缺血微環(huán)境可以提高一些促血管發(fā)生蛋白和功能性miRNA 在 MSCs及其外泌體中的表達(dá)，這些 MSCs及其外泌體含有強(qiáng)大的促血管再生成分，能夠誘導(dǎo)血管再生。Moisseiev等[28]研究結(jié)果顯示，玻璃體內(nèi)注射來自低氧條件下培養(yǎng)的人MSC-exosomes能顯著減少氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型中的視網(wǎng)膜缺血，并促進(jìn)新生血管形成；Lv等[29]證實(shí)，在低氧條件下低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)過表達(dá)的MSCs 分泌外泌體增強(qiáng)血管生成和血管通透性。總的來說，MSC-exosomes或經(jīng)處理后含有較強(qiáng)大的血管生成旁分泌效應(yīng)物有望彌補(bǔ)MSCs的不足，成為治療AION及相關(guān)疾病的有效治療策略[30]。

3.3 抑制氧化應(yīng)激和減少細(xì)胞凋亡NAION患者由于短后睫狀動(dòng)脈灌注減少引起視神經(jīng)損傷，之后導(dǎo)致RGCs的凋亡和視神經(jīng)萎縮[31]。Dreixler等[32]已經(jīng)確定，在具有急性缺血-再灌注損傷的動(dòng)物眼中，玻璃體內(nèi)注射MSCs導(dǎo)致RGC層的保存，這種效果可以通過玻璃體內(nèi)注射條件培養(yǎng)基來復(fù)制，培養(yǎng)基通過減弱缺血后細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)基因表達(dá)來預(yù)防缺血后視網(wǎng)膜細(xì)胞丟失。以往研究證明，靜脈注射MSCs通過抑制細(xì)胞凋亡和減少炎癥反應(yīng)來挽救視網(wǎng)膜激光損傷，但其較少遷移到受損的視網(wǎng)膜，推測主要是通過分泌營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)眼內(nèi)微環(huán)境在神經(jīng)保護(hù)中起作用。類似地，Yu等[33]進(jìn)一步使用同樣激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷動(dòng)物模型比較玻璃體內(nèi)注射MSC-exosomes和MSCs的效果，發(fā)現(xiàn)MSC-exosomes對受損視網(wǎng)膜的保護(hù)作用與抑制損傷、減少細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的程度與MSCs相當(dāng)，并表明MSC-exosomes部分通過下調(diào)MCP-1改善激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。此外，Xiao等[34]在大鼠氧-葡萄糖剝奪模型誘導(dǎo)的缺血缺氧性CNS少突膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs衍生的miR-134外泌體通過負(fù)向調(diào)節(jié)caspase-8依賴性凋亡途徑抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。因此，MSCs 衍生的外泌體部分地充當(dāng)將miRNA轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端受體細(xì)胞的載體，改變其miRNA表達(dá)來介導(dǎo)受體細(xì)胞的抗凋亡功能。MSC-exosomes也能增強(qiáng)有益miRNA表達(dá)，刺激軸突向外生長，從而改善缺血后神經(jīng)的功能恢復(fù)。

3.4 免疫調(diào)節(jié)作用研究顯示，在NAION缺血性梗死后存在多核型白細(xì)胞的浸潤和巨噬細(xì)胞的吞噬和清除作用，揭示了細(xì)胞免疫反應(yīng)參與視神經(jīng)的損傷[35]。然而，早期NAION后炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致持續(xù)或甚至進(jìn)行性視神經(jīng)功能障礙，如果發(fā)生后一種效應(yīng)，針對性地減少早期炎癥反應(yīng)可能引起NAION患者的視力改善。Doeppner等[36]發(fā)現(xiàn)MSC-exosomes在小鼠中風(fēng)模型中改善神經(jīng)恢復(fù)，增加神經(jīng)發(fā)生和血管生成，并參與了缺血后免疫反應(yīng)。體內(nèi)研究表明，人臍帶MSCs外泌體可以通過下調(diào)炎性細(xì)胞因子如TNF-α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、IL-6和γ干擾素(interferon，IFN-γ)來改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)；有研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSC-exosomes通過減少眼內(nèi)T細(xì)胞亞群和其他炎癥細(xì)胞的浸潤，大大降低了正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的強(qiáng)度，從而保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和挽救視網(wǎng)膜功能[25]。此外,MSC-exosomes也已經(jīng)在創(chuàng)傷性腦損傷模型中進(jìn)行了測試，結(jié)果表明MSC-exosomes部分通過減少神經(jīng)炎癥來增強(qiáng)新生成的內(nèi)皮細(xì)胞和新形成的未成熟和成熟神經(jīng)元，從而改善創(chuàng)傷性腦損傷后的功能恢復(fù)[24]。鑒于外泌體被認(rèn)為是含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA和RNA的復(fù)雜“活”結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能以多種方式協(xié)同作用。總之，NAION相關(guān)的炎癥問題與潛在治療有關(guān)，而MSC-exosomes不僅具有低免疫原性，而且能夠激活免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，傳遞miRNA至靶細(xì)胞從而維持組織穩(wěn)態(tài)，因此有望在缺血性視神經(jīng)病變中提供有益的治療效果。

4 結(jié)語

NAION是一種對患者視力具有破壞性結(jié)果的常見神經(jīng)眼科疾病，伴有病理生理學(xué)機(jī)制上的不明確，以及其他關(guān)于眼睛受累和治療策略有爭議的研究數(shù)據(jù)。盡管MSCs移植在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用，但與活細(xì)胞相比，MSC-exosomes更穩(wěn)定，可保留，可避免異基因免疫排斥、不必要的分化和小血管阻塞等風(fēng)險(xiǎn)。MSC-exosomes與MSCs非常相似地通過各種作用機(jī)制保護(hù)視神經(jīng)和促進(jìn)軸突再生，這在眼前部缺血性視神經(jīng)病變中是一種非常有吸引力的新型非細(xì)胞治療方法，值得進(jìn)一步眼科學(xué)方面的的探索。此外，外泌體還可以作為載體提供具有現(xiàn)成遞送能力的更集中的促進(jìn)組織愈合因子的來源。然而，需要在AION模型中進(jìn)一步研究以確定是否可以觀察到這些外泌體的有益作用，在將該療法轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用之前，需要額外的長期安全性信息和劑量反應(yīng)評估。此外，高質(zhì)量高效率的分離提純技術(shù)和必須明確不同組織外泌體中各種生物活性物質(zhì)的確切機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間均仍是目前外泌體研究領(lǐng)域需要進(jìn)一步深入探討的問題；仔細(xì)選擇最有效的組織源性外泌體和適合特定生物樣品的分離技術(shù)，最終可以滿足涉及外泌體診斷和治療的臨床應(yīng)用的需求。