張?chǎng)?王新濤

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，哈爾濱 150081)

近年來(lái)，由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因?qū)е麓竺娣e骨缺損的患者越來(lái)越多，故如何治療骨缺損成為骨科醫(yī)師有待解決的問(wèn)題。Hayrapetyan等[1]發(fā)現(xiàn)，骨組織在一定范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的再生能力。當(dāng)前骨缺損的治療主要依靠自體、同種異體和異種骨移植等，但均未取得良好效果。骨組織工程學(xué)由Grane等[2]于1995年提出。骨組織工程學(xué)是將支架與細(xì)胞和細(xì)胞因子復(fù)合，隨后將構(gòu)建好的骨組織工程支架移植到骨缺損區(qū)域，以新生骨組織替代支架材料，從而修復(fù)骨缺損[3]，其包括支架載體、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子3個(gè)基本要素。其中支架作為一種臨時(shí)的、人工的細(xì)胞外基質(zhì)，能夠促進(jìn)新骨形成[4]，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化有直接影響[5]。理想的骨組織工程支架應(yīng)具備適宜的孔隙率及表面積比、較好的生物相容性、表面活性及與臨床應(yīng)用匹配的外形，并能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附及血管、神經(jīng)的生長(zhǎng)[6-7]。骨組織支架材料包括生物陶瓷、天然生物材料、人工合成材料等。應(yīng)用常規(guī)技術(shù)制備的骨組織工程支架仍存在許多缺點(diǎn)，如支架無(wú)法個(gè)體化制備，無(wú)法控制支架孔隙率、孔徑大小、孔隙之間的連通率，且細(xì)胞在支架載體上的黏附率低[8]。經(jīng)過(guò)不斷的嘗試，研究者最終將三維打印技術(shù)應(yīng)用到骨組織工程中，制備出了理想的骨組織工程支架?，F(xiàn)對(duì)三維打印技術(shù)在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 三維打印技術(shù)

三維打印技術(shù)也稱增材制造，是根據(jù)CT、磁共振成像等數(shù)據(jù)重建模型或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)，通過(guò)將材料精確的分層堆積，快速打印出與骨缺損區(qū)域幾乎完全相同的三維多孔高活性骨修復(fù)支架[9]。該技術(shù)由美國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)90年代研制成功，其機(jī)制是以能夠固化的材料分層疊加的方式實(shí)現(xiàn)快速成型的技術(shù)[10]。

三維打印技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、快速及可定制等優(yōu)點(diǎn)，其越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在影像學(xué)和數(shù)字化醫(yī)學(xué)的幫助下，醫(yī)師可以利用三維打印技術(shù)打印所需要的特定模型，從而獲得更加全面的信息。臨床醫(yī)師可以通過(guò)模型進(jìn)行模擬性手術(shù)，從而制訂更全面、更優(yōu)化的手術(shù)方案，縮短手術(shù)時(shí)間，提高成功率，減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生[11-12]。Xu等[13]以三維圖像數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用三維打印方法成功制備了樞椎椎體，同時(shí)成功進(jìn)行了三維打印人工椎體置換、頸椎椎體全切脊柱重建術(shù)，術(shù)后患者恢復(fù)良好。在醫(yī)學(xué)中，最常用的技術(shù)為熔融沉積建模(fused deposition modeling，F(xiàn)DM)、選擇性激光燒結(jié)(selective laser sintering，SLS)和立體光刻(stereolithography，SLA)[14]。

1.1FDM FDM是一種以擠出為基礎(chǔ)的技術(shù)，其是將熱塑性塑料或復(fù)合長(zhǎng)絲加熱到半熔融狀態(tài)，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的噴嘴擠出。目前，關(guān)于FDM的優(yōu)點(diǎn)和局限性仍存在爭(zhēng)議。Liu等[15]報(bào)道，F(xiàn)DM技術(shù)可以利用醫(yī)用級(jí)丁腈苯乙構(gòu)建堅(jiān)固的骨模型、植入物，丁腈苯乙是一種可以在手術(shù)前進(jìn)行適當(dāng)消毒的材料。但Garg和Mehta[14]報(bào)道，雖然FDM比SLS和SLA速度更快、價(jià)格更低，但該技術(shù)的準(zhǔn)確性較低，而且由于所用材料的熔點(diǎn)低，在手術(shù)前消毒方面存在一定困難。因此，建議僅在術(shù)前使用FDM。目前，還不能確定FDM是否可以在術(shù)中使用。

1.2SLA SLA是一種基于還原聚合的印刷，當(dāng)激光束射入光固化液體樹(shù)脂后，樹(shù)脂逐層固化-從液體轉(zhuǎn)向固體聚合物(稱為光聚合)-直到三維結(jié)構(gòu)打印完成。SLA是第一個(gè)獲得專利的三維打印技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各個(gè)醫(yī)療領(lǐng)域。個(gè)性化設(shè)計(jì)、大規(guī)模定制、利用最大化和制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力是SLA作為一種制造技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)。SLA打印機(jī)可以生產(chǎn)出表面光滑的物體，但是光致聚合物建筑材料相對(duì)昂貴。Li等[16]采用間接SLA法制備了微孔β磷酸三鈣，并采用該工藝制備了樹(shù)脂模具，填充了熱固性陶瓷水基懸浮液，用于陶瓷凝膠澆注。采用熱處理工藝去除樹(shù)脂模具。結(jié)果表明，燒結(jié)后的β磷酸三鈣材料具有理想的孔隙率、形狀和較高的強(qiáng)度。也有研究通過(guò)紫外光激光以分層方式光固化液體樹(shù)脂來(lái)制備3D物體[17-18]。SLA的主要優(yōu)點(diǎn)為制備出的3D物體具有更好的表面光潔度和更高的精度[19]。

1.3SLS 在SLS中，高能激光束產(chǎn)生局部熱源，該熱源將粉末材料部分熔化并融合成所需的圖案。熱源一次熔合一層，直到生成三維結(jié)構(gòu)。在SLS中，金屬合金和陶瓷是使用最多的材料。SLS技術(shù)具有很高的精度，可以打印小至(0.5±0.2) mm的三維模型[15]。然而，Liaw和Guvendiren[20]指出，由于粉末材料處于半熔融狀態(tài)，故SLS的最終產(chǎn)品具有粗糙、研磨的表面和多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此，SLS打印通常需要更多的后處理。Hoffmann等[21]采用SLS技術(shù)制備鎳鈦合金多孔支架，然后將打印好的支架與間充質(zhì)干細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以沿著成骨譜系增殖、分化，具有良好的生物活性，能夠縮短患者恢復(fù)期。

2 三維打印技術(shù)與骨組織工程

三維打印技術(shù)通過(guò)影像學(xué)收集骨缺損的數(shù)據(jù)，借助計(jì)算機(jī)的輔助，設(shè)計(jì)出較為理想的三維立體結(jié)構(gòu)，再選用理想的材料，制備出合適的骨組織工程支架。與傳統(tǒng)方法相比，三維打印技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：全自動(dòng)化，操作簡(jiǎn)便、打印速度快，可以重復(fù)打??；無(wú)需特殊工具，能夠根據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行個(gè)體化制備；能夠打印出具有理想的孔隙率和孔徑的支架；多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及基因均能夠同步打印到支架的指定部位[22-23]。

2.1三維打印生物材料 近年來(lái)，骨組織工程及再生醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步,三維打印技術(shù)在開(kāi)發(fā)和制造由仿生天然和合成材料組成的仿生支架方面應(yīng)用更加廣泛。骨組織工程中的打印材料需具有一定的機(jī)械性能、骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性，同時(shí)具備良好的生物降解性，一般可分人工合成多聚體類、生物陶瓷、天然高分子聚合物等。

2.1.1人工合成多聚體類 以聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物為代表的人工合成多聚體，具有良好的生物相容性，無(wú)毒的降解產(chǎn)物，可通過(guò)體內(nèi)代謝排出，但這些材料在親水性及機(jī)械強(qiáng)度等方面存在不足[7]。較早的組織工程支架大多經(jīng)紡織技術(shù)將聚羥基乙酸等材料的纖維制造成骨架。由于該支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，力學(xué)性能不足，不能用于硬組織培養(yǎng)。而Pati等[24]應(yīng)用多個(gè)噴頭打印出聚己內(nèi)酯/聚乳酸/β磷酸三鈣復(fù)合生物材料支架，并將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)，將干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)附著于支架上，然后保留細(xì)胞外基質(zhì)并去除干細(xì)胞，制備出聚己內(nèi)酯/聚乳酸/β磷酸三鈣/細(xì)胞外基質(zhì)支架，該支架既可以達(dá)到生物力學(xué)要求，又可以加速生物礦化過(guò)程。Xu等[25]通過(guò)熱致相分離與三維打印技術(shù)制造了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/天然珍珠的復(fù)合三維支架，該支架具有較高的孔隙率、合適的孔徑和一定機(jī)械性能，將其與骨髓干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，干細(xì)胞能夠進(jìn)行良好的增殖與分化，證明其具有生物相容性和骨誘導(dǎo)性，能達(dá)到骨組織工程中支架的要求。

2.1.2生物陶瓷 磷酸鈣鹽陶瓷是骨組織工程支架應(yīng)用最多的材料，其中羥基磷灰石和磷酸三鈣最具代表性。羥基磷灰石有良好的骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、生物相容性、無(wú)細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其還能刺激成骨生長(zhǎng)因子(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白)的內(nèi)源性表達(dá)，并增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性，但其也有脆性大、不易塑型和不易降解等不足[26-28]。Adel-Khattab等[29]以含有鈣磷酸鈣的二氧化硅為材料，以Schwartzwalder Somers方法和3D打印技術(shù)制備支架，在體外檢測(cè)了支架的機(jī)械性能和物理性質(zhì)(孔隙率、壓縮強(qiáng)度、溶解度)，同時(shí)將兩種方法制備的支架與鼠成骨細(xì)胞(MT3T3-E1)共同培養(yǎng)7 d發(fā)現(xiàn)，Schwartzwalder Somers方法制備的支架總孔隙率(86.9%)明顯高于3D打印技術(shù)制備的支架(50%)，但3D打印技術(shù)制備的支架內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)更多，擁有更高的抗壓強(qiáng)度和二氧化硅釋放功能，表明3D打印技術(shù)制備的支架具有良好的機(jī)械和生物學(xué)特性。Roohani-Esfahani等[30]采用三維打印的方法制備了具有六方孔結(jié)構(gòu)的微晶玻璃支架。與具有相同孔隙率的陶瓷-玻璃支架相比，其所制造的支架具有150倍的強(qiáng)度，表明這些支架具有優(yōu)異的承載和節(jié)段性骨缺損治療能力。

2.1.3天然高分子聚合物 天然高分子聚合物，也稱為生物衍生材料，存在于自然界中，可以通過(guò)物理或化學(xué)方法提取。這些聚合物已廣泛應(yīng)用于許多工業(yè)領(lǐng)域，如食品、紡織品、紙張、木材、黏合劑。天然高分子聚合物包括膠原、藻酸鹽、淀粉等，它們具有良好的生物相容性及細(xì)胞識(shí)別信號(hào)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、黏附及分化。天然高分子聚合物、具有良好的水溶性，且容易與黏結(jié)劑結(jié)合，可以廣泛用于3D生物技術(shù)打印的組織工程支架。但它們難以大量獲取，降解時(shí)難以控制，缺乏一定的機(jī)械強(qiáng)度，不足以作為理想的支架載體，但可作為良好的添加劑[31]。近年來(lái)有學(xué)者將其應(yīng)用于骨組織工程中，Yu等[32]以納米羥基磷灰石和聚(酯脲)為材料，通過(guò)熔融沉積模型打印出孔隙率為75%的三維多孔支架，隨后將MC3T3-E1細(xì)胞與該支架復(fù)體外復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在羥基磷灰石含量高的支架中，通過(guò)提高堿性磷酸酶活性、增加成骨細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)以及促進(jìn)礦化，細(xì)胞能夠長(zhǎng)期處于高分化狀態(tài)，羥基磷灰石表面能夠賦予支架骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，使該支架在骨組織工程方面優(yōu)于其他聚合物支架。Ren等[33]通過(guò)生物打印Ⅱ型膠原水凝膠構(gòu)建具有梯度軟骨細(xì)胞密度的工程化帶狀軟骨，Ⅱ型膠原具有維持軟骨細(xì)胞表型的能力，并在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用。3D打印的帶狀軟骨具有梯度細(xì)胞外基質(zhì)分布，其與軟骨細(xì)胞密度呈正相關(guān)。

2.2三維打印細(xì)胞和細(xì)胞因子 現(xiàn)有制備組織工程骨的方法大多是在支架上接種細(xì)胞，細(xì)胞與支架在體外共同培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，移植到患者體內(nèi)，隨著細(xì)胞的增殖、分化以及支架的降解，最后以新生骨組織替代支架材料。但此種方法只是將細(xì)胞與支架整合到一起，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果[34]。三維打印技術(shù)可將細(xì)胞接種在支架的指定位置，還可以將細(xì)胞因子添加到支架中，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和黏附，這樣能夠同步控制打印支架材料、細(xì)胞和細(xì)胞因子[35]。

細(xì)胞是骨組織工程的三大要素之一，其用于三維打印主要考慮以下幾個(gè)因素:①能夠在體外大量培養(yǎng)；②支架中的細(xì)胞還具有增殖和分化能力；③打印后的細(xì)胞具有活性；④細(xì)胞類型不同且之間存在差異；⑤多種細(xì)胞共同參與組織發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[36-39]。隨著三維打印技術(shù)的不斷成熟，細(xì)胞打印也取得了一定的進(jìn)展。Li等[40]應(yīng)用三維打印技術(shù)，以羥丙基甲殼素為生物墨水，成功打印人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)打印出的細(xì)胞存活率>90%且表現(xiàn)出較高的增殖效率。與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)相比，在三維印刷結(jié)構(gòu)中形成的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞團(tuán)表現(xiàn)出更高的均勻性。采用新的雙熒光標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建物中的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞聚集物更傾向于原位增殖而不是多細(xì)胞聚集。同時(shí)發(fā)現(xiàn)三維打印的細(xì)胞具有產(chǎn)量高、聚集性均勻等特點(diǎn)。Cui等[41]將活的軟骨細(xì)胞與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯混合，成功制造出能夠打印的生物墨水，同時(shí)結(jié)合紫外光，制備出水凝膠修復(fù)支架。結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞在水凝膠軟骨支架中呈現(xiàn)均勻分布，且直接紫外光照射打印的支架細(xì)胞的存活率較先沉積后光照聚合打印的支架細(xì)胞高26%。Gao等[42]通過(guò)噴墨打印技術(shù)，將懸浮聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、生物活性玻璃和羥基磷灰石的納米顆粒3種混合的物質(zhì)共同打印，成功制備支架。與單純聚乙二醇二甲基丙烯酸酯支架相比，該復(fù)合支架上的細(xì)胞能夠精確到達(dá)目標(biāo)位置，細(xì)胞存活率達(dá)(86.62±6.02)%，支架中的羥基磷灰石對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和成骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有顯著的促進(jìn)作用，該支架細(xì)胞毒性最小。

細(xì)胞因子有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等作用。有研究將打印好的支架與生物活性因子相復(fù)合，再植入到動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行骨缺損的修復(fù)[43]。且利用三維打印同步裝配細(xì)胞因子具有很多優(yōu)點(diǎn)，它能夠準(zhǔn)確地構(gòu)建接近人體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。Ritz等[44]以聚乳酸為材料，采用三維打印技術(shù)打印出形狀為多孔籠狀的支架載體，并在籠中添加基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1，該支架較單純的聚乳酸支架的內(nèi)毒素污染低，機(jī)械穩(wěn)定性較好，同時(shí)利于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)新生血管形成。Cooper等[45]采用噴墨印刷技術(shù)進(jìn)行支架打印，通過(guò)噴墨濃度來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子在支架個(gè)別位置上的濃度；不需要定制模板來(lái)創(chuàng)建特定的模式，實(shí)驗(yàn)周轉(zhuǎn)時(shí)間相對(duì)較快；噴墨打印的分辨率足以產(chǎn)生較快的細(xì)胞生物反應(yīng)。

3 問(wèn)題與展望

三維打印是一種新型數(shù)字化成型技術(shù)，它的出現(xiàn)為骨缺損的修復(fù)提供了一種全新的方法，但目前三維打印技術(shù)還存在許多缺點(diǎn)和不足：①在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域三維打印技術(shù)的打印、所需材料及設(shè)備費(fèi)用較高，這導(dǎo)致其不能進(jìn)行大批量打印，從而限制了臨床應(yīng)用。②對(duì)于骨組織，單純的水凝膠、膠原打印的支架載體機(jī)械性能及生物性能無(wú)法達(dá)到支架要求，雖然當(dāng)前能夠通過(guò)共印熱塑性聚合物來(lái)增加機(jī)械強(qiáng)度，但是部分無(wú)機(jī)材料在不進(jìn)行高溫?zé)Y(jié)的情況下并不能取得所需的生物力學(xué)效果[46]，目前植入物是否有機(jī)械強(qiáng)度仍存在爭(zhēng)議。③三維組織/器官打印技術(shù)的目的均是重塑復(fù)雜器官的微觀結(jié)構(gòu)，該過(guò)程不僅耗時(shí)長(zhǎng),且對(duì)細(xì)胞數(shù)量要求巨大，細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間打印，其存活率降低的同時(shí)，打印體的生物功能也可能會(huì)發(fā)生變化。這些缺陷和不足是推動(dòng)三維打印技術(shù)的動(dòng)力，只有消除存在的缺點(diǎn)，三維打印技術(shù)才能更快的發(fā)展。相信未來(lái)三維打印技術(shù)在骨組織工程領(lǐng)域中將會(huì)更廣泛的應(yīng)用。