劉雙嶺，孔菲，劉剛，孔瑩，全愛君

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院針灸科，哈爾濱 150001)

腦出血是指原發(fā)性腦實質出血，占急性腦血管病的20%～30%，急性期病死率為30%～40%，在急性腦血管病中病死率最高[1]。2007—2017年，全球范圍內腦出血住院人數(shù)增加了18%，1990—2010年，全球腦出血的發(fā)病率上升了約47%[2]。腦出血后腦損傷是臨床治療的難點，腦神經(jīng)功能缺損致殘率高，嚴重影響患者身心健康，也對其家庭造成了沉重的精神和經(jīng)濟負擔,因此深入研究腦出血后腦損傷的病理機制具有重要意義。目前研究普遍認為，腦出血后腦損傷包括血腫直接壓迫和刺激的原發(fā)性腦損傷以及血腫周圍半暗帶區(qū)缺血缺氧的繼發(fā)性腦損傷[3]。腦出血發(fā)生后，腦內血流自動調節(jié)系統(tǒng)出現(xiàn)繼發(fā)性的功能障礙，導致大面積神經(jīng)血管單元缺血缺氧和灰白質結構不可逆的破壞，最終神經(jīng)元細胞死亡[4]。腦出血發(fā)生后腦組織內某些蛋白、酶類的表達水平升高或降低，促進或抑制神經(jīng)損傷。目前的研究熱點集中在腦出血發(fā)生后細胞分子信號轉導通路對腦損傷的作用，既包括血腦屏障破壞、通透性增強加重的腦水腫及神經(jīng)損傷[5]，也包括神經(jīng)炎癥、血液中的神經(jīng)毒性侵襲、細胞凋亡、氧化應激反應等因素對神經(jīng)損傷的影響[6]?，F(xiàn)就腦出血后腦損傷病理機制的研究進展予以綜述，為尋找腦出血新的治療靶點和臨床研究提供依據(jù)和參考。

1 血腦屏障破壞及腦水腫形成

1.1血腦屏障破壞 血腦屏障是一種由微血管內皮細胞、周皮細胞和星形膠質細胞等組成緊密連接的高度選擇性生物屏障，能夠阻止某些有害物質由血液進入腦組織。血腦屏障破壞是腦損傷開始的標志，與血腦屏障破壞相關的通路或蛋白有外因子/β聯(lián)蛋白(β-catenin)通路、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)等。

Wnt蛋白能夠誘導細胞增殖及組織生長,Wnt途徑中的關鍵開關是β-catenin[7]。Wnt與受體結合促使β-catenin入核激活靶基因，引發(fā)緊密連接蛋白3細胞應答，緊密連接蛋白3是構成血腦屏障的重要成分，因此激活Wnt/β-catenin通路可維持血腦屏障結構完整，有腦保護作用[8-9]。另有研究證實，大鼠腦出血模型中細胞凋亡數(shù)量與Wnt/β-catenin通路的表達呈顯著正相關，說明Wnt/β-catenin通路不僅影響組織細胞增殖，也調節(jié)著細胞凋亡與增殖之間的平衡[10]。這提示可以尋找Wnt/β-catenin通路的調節(jié)因子，并以這些調節(jié)因子作為新的靶點來設計藥物，促進腦組織中緊密連接蛋白3細胞的增殖抑制其凋亡，從而保護血腦屏障。GSK-3β具有促凋亡特征，腦出血后GSK-3β表達增加，GSK-3β可促進下游β-catenin磷酸化，且GSK-3β與β-catenin呈負相關[11]。應用GSK-3β抑制劑鋰治療腦出血大鼠可增加β-catenin活性和緊密連接蛋白1和3的表達，從而減輕血腦屏障損害[12]。這表明，可以設計抑制GSK-3β的藥物來增加腦組織中β-catenin以及升高緊密連接蛋白1和3的水平，為腦出血后腦保護的治療提供新方案。

MMP-9可分解構成血腦屏障的膜周蛋白和膠原等細胞外基質，腦出血后MMP-9表達水平升高，增加了炎癥因子聚集并促進白細胞向腦實質擴散，進一步破壞血腦屏障[13]。腦卒中早期黏附于血管內皮的中性粒細胞釋放的MMP-9可導致內皮細胞和星形膠質細胞的基底層降解，破壞血腦屏障并加重腦損傷；而腦卒中恢復期內皮細胞、神經(jīng)元、膠質細胞釋放的小劑量MMP-9可重塑基膜并恢復細胞間接觸，重建血腦屏障[14]。腦卒中后血腦屏障破壞的治療窗口非常短，其后的修復功能占主導地位，但目前血腦屏障的功能重塑機制研究并不全面，MMP-9在腦出血急性期及恢復期可能因濃度不同而表現(xiàn)出功能差異，因此其在腦內釋放的定量與定性研究仍需深入展開。

1.2腦水腫形成 在腦水腫的研究中，水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)的研究比較廣泛[15]。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質細胞表面調節(jié)水轉運的一種蛋白，是星形膠質細胞表面正常的組成成分。AQP4參與腦內水液代謝并可破壞內皮細胞和緊密連接,因此腦出血后AQP4表達增多可加重腦水腫。Zhong等[16]的實驗發(fā)現(xiàn)，香芹酚可抑制腦出血大鼠血腫周圍AQP4的表達，減弱出血后腦水腫引起的腦損傷，表明AQP4的抑制劑是治療腦出血后腦水腫的一個研究方向。此外，AQP4還具有抗細胞水腫能力，人參皂苷的抗水腫活性是由AQP4來介導，當AQP4基因沉默表達時引起的星形膠質細胞腫脹不能被人參皂苷減輕[17]。AQP4可能對中樞細胞的水液代謝有雙向調節(jié)作用，高表達時增強質膜通透性使細胞入水增多，同時也作用于細胞出水，但對其在細胞水運中發(fā)揮不同作用的機制仍需進一步研究。另有研究指出，AQP4除腦內水運外，還參與腦內氧氣交換和能量代謝，AQP4四聚體的中心孔可滲透氧氣，參與腦內氧的擴散[18]。今后可以從AQP4的激活途徑、生物化學變化、氧氣輸送、調節(jié)腦內能量代謝等方面繼續(xù)深入研究，探索減輕神經(jīng)水腫及腦保護的新原理。

總之，血腦屏障結構與功能的破壞促使腦水腫加重，腦水腫又會導致大腦組織發(fā)生水電解質平衡紊亂、能量代謝改變等一系列病理生理變化，進一步破壞血腦屏障。兩者均加劇了繼發(fā)腦損傷，而上述通路或蛋白為尋找腦出血新的治療靶點提供了參考依據(jù)。

2 炎癥反應與氧化應激

2.1炎癥反應 腦出血后腦組織因炎癥刺激釋放的酶和致炎因子可加重腦神經(jīng)損傷，但同時也釋放清除炎癥的因子，促進細胞功能修復[19]。促炎細胞因子有白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-7、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和Toll樣受體-4等[20]；抗炎細胞因子有IL-10、IL-4和轉化生長因子-β(tansforming growth factor-β,TGF-β)等[21]。IL-6在急性炎癥反應中起促進作用，是早期腦出血臨床癥狀加重的獨立因素[22]。TNF-α在腦出血后表達顯著增加，并誘導其下游蛋白促進炎癥因子表達，TNF-α與腦組織損傷呈正相關[23]。Fu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，茶黃素能減輕腦出血大鼠炎癥細胞因子TNF-α的表達，并可激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路，介導TNF-α、IL-6等促炎細胞因子表達，同時這些促炎細胞因子又進一步活化NF-κB通路，加重腦損傷。IL-10可抑制TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的表達，并通過上調炎癥細胞因子拮抗劑表達來發(fā)揮抗炎效應[25]。TGF-β是調節(jié)細胞生長和分化的因子，可抑制炎癥細胞的激活和多種炎癥介質的釋放，并參與損傷后組織修復。Taylor等[26]證實，腦出血后72 h血清TGF-β1水平升高的患者轉歸明顯改善。

腦出血后炎癥反應的變化一直是腦損傷研究的熱點問題。促炎和抗炎細胞因子均不是單一存在，腦出血發(fā)生后兩者一直有此消彼長的動態(tài)變化。如何在早期抑制促炎細胞因子及后期促進抗炎細胞因子的釋放是今后研究的關鍵，且多種因子間的協(xié)同作用也值得更深入研究，這些研究成果將為治療腦出血后炎性腦損傷提供新的理論依據(jù)。

2.2氧化應激 氧化應激是指體內氧化和抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。氧化應激發(fā)生時所產(chǎn)生的大量活性氧類會損壞血腦屏障、介導髓鞘脫失和軸索損傷，并且能激活多種信號通路誘發(fā)加重自身免疫炎癥和神經(jīng)細胞凋亡。目前，對超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等的研究較多見。SOD水平與自由基含量呈負相關，SOD水平越高機體清除自由基的能力越強。丙二醛是自由基產(chǎn)生的脂質過氧化產(chǎn)物，反映了氧化損傷程度，SOD活性與丙二醛含量常聯(lián)合檢測[27]。Wang等[28]將脂聯(lián)素基因注入腦出血模型大鼠，24 h后檢測顯示SOD增加，丙二醛減少，說明脂聯(lián)素過表達可抑制中樞系統(tǒng)氧化應激，減輕腦損傷。GSH-PX能反映機體抗氧化水平，催化還原性谷胱甘肽氧化。研究者往往采用多角度的方法，將GSH-PX結合其他指標聯(lián)合檢測，以得到更為嚴謹、精準的預期結果[29]。MAPK作用于氧化應激的啟動與識別，與腦損傷呈正相關，使用MAPK相關蛋白阻斷劑可起到腦保護作用，且聯(lián)合阻斷劑效果更佳[30]。這提示，多重阻斷氧化應激反應相關信號通路是減少腦損傷的研究思路之一。此外，腦出血發(fā)生后活性氧自由基生成和清除的平衡失調，大量自由基可以通過損傷DNA、影響信號轉導以及參與基因表達調控等途徑加重神經(jīng)損傷，因此未來研究方向可以從抑制氧化或增加抗氧化雙重角度出發(fā)，尋找治療腦出血后腦損傷的藥物。

腦出血后的炎癥反應與氧化應激關系密切，炎癥通過氧化應激造成腦損傷，而氧化應激刺激下又促使炎癥進一步發(fā)展，加重了神經(jīng)血管損傷和神經(jīng)功能缺損[31]。未來可以將炎癥與氧化應激反應中相互作用的蛋白通路作為靶點篩選藥物，為尋找減輕腦損傷的有效治療方案提供研究依據(jù)。

3 自噬與細胞凋亡

3.1自噬 自噬是一種通過溶酶體降解途徑實現(xiàn)真核細胞回收的過程。腦出血后腦損傷可啟動機體保護機制，導致自噬現(xiàn)象顯著增強[32]。有關自噬的蛋白研究主要涉及蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase R-like extracellular regulated kinase,PERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)和自噬的啟動基因Beclin-1等。PERK通路高度參與細胞的自噬活動，激活PERK途徑可減少蛋白質合成，促進細胞碎片降解，減少細胞凋亡，促進神經(jīng)元存活[33]。 PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路具有抑制神經(jīng)細胞自噬與凋亡作用[34]。腦組織再灌注損傷時可將PI3K 激活，活化下游效應分子Akt，下傳信號到mTOR，活化的mTOR可抑制細胞自噬、凋亡[35]。腦出血后細胞過度自噬可導致腦損傷，自噬的啟動基因Beclin-1起到促進自噬體形成的作用。硫化氫預處理抑制了腦出血后自噬標志物Beclin-1的活化，提示Beclin-1的抑制劑可能在腦出血后腦損傷治療中具有潛在的應用價值[36]。

3.2凋亡 腦出血后凋亡相關調控的研究開展較早，實驗研究中多涉及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)和NF-κB等蛋白通路。其中Bcl-2抗凋亡，Bax促凋亡，caspase-3是細胞凋亡最終效應因子，Bax表達增加抑制Bcl-2作用。正常腦組織內Bcl-2與Bax表達含量相當，但腦出血發(fā)生后兩者比例失調，如何將過表達的Bax含量降低并提高被抑制的Bcl-2表達是腦保護的重要問題。Ma等[37]研究重組活化凝血因子Ⅶ對腦出血大鼠腦損傷的治療作用發(fā)現(xiàn)，實驗組Bcl-2高表達，Bax低表達，證實重組活化凝血因子Ⅶ通過促進Bcl-2和抑制Bax表達對腦出血后損傷神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。這表明可以篩選抑制促凋亡因子及增強抗凋亡因子的藥物來進行研究，并關注兩者的動態(tài)變化規(guī)律，尋找藥物協(xié)同作用的靶點。

NF-κB信號轉導通路可調節(jié)Bax和Bcl-2的表達變化，具有抗凋亡和促凋亡的雙重特性。NF-κB能上調抗凋亡基因及促凋亡基因：Bcl-2上有NF-κB結合位點，NF-κB活化后，線粒體膜上的Bcl-2基因表達增加，線粒體膜的通透性降低，抑制了線粒體凋亡途徑；細胞缺血缺氧時，激活NF-κB上調了促凋亡基因Bax表達，引起凋亡[38]。目前，對于NF-κB在腦血管病急性期及恢復期促凋亡或抗凋亡作用的機制研究尚不夠深入，因此可以進一步完善NF-κB神經(jīng)細胞凋亡動態(tài)變化的雙向調節(jié)作用研究，設計一些腦出血后不同時間點阻斷或促進NF-κB通路表達的藥物實驗，來尋找減輕腦出血后腦損傷的新治療方案。自噬與凋亡互相影響，自噬可以誘發(fā)凋亡，凋亡又可以激活自噬通路。兩者在腦出血后腦損傷的病理發(fā)展進程中聯(lián)系緊密、互為因果。未來可以從減少神經(jīng)細胞過度自噬及抑制凋亡的共同影響因子等角度進行深入研究，篩選腦出血后腦保護的治療藥物。

4 鐵過載

腦內血腫是影響患者生存率和生存質量的重要因素，在血腫周圍超負荷的鐵可以加速神經(jīng)炎癥，加劇神經(jīng)元丟失，加重腦繼發(fā)性損傷。腦出血后不久，中性粒細胞一方面釋放出破壞性分子增強腦損傷；另一方面也釋放有益分子，包括清除鐵的乳鐵蛋白來減輕鐵介導的腦損傷[39]。鐵螯合劑米諾環(huán)素可顯著降低血腫周圍區(qū)域的鐵過載，并進一步減少了腦腫脹、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元丟失、延遲性腦萎縮和神經(jīng)功能缺損等[40-41]。Liu等[42]發(fā)現(xiàn)，腦出血后腦皮質、基底節(jié)神經(jīng)元和星形膠質細胞均可以表達銅藍蛋白，它能將有毒的亞鐵(Fe2+)氧化為毒性較小的三價鐵(Fe3+)，說明通過強氧化劑改變價態(tài)也可以達到減弱亞鐵毒性目的，這是腦出血后鐵過載治療的一個新思路。

5 小膠質細胞

小膠質細胞占腦內所有細胞總數(shù)的5%～10%，是腦組織內特有的固有免疫細胞。小膠質細胞的活化狀態(tài)與腦內受損部位的嚴重程度密切相關，腦出血后小膠質細胞活化可體現(xiàn)有害與有益雙重作用，表現(xiàn)為破壞性M1表型和保護性M2表型[43]。腦出血發(fā)生后，小膠質細胞開始活化，進而分泌促進中性粒細胞和單核細胞浸潤的細胞因子和趨化因子[44]。腦出血前期出現(xiàn)M1型小膠質細胞可釋放促炎細胞因子和自由基，損害大腦的修復與再生，后期轉變?yōu)镸2型小膠質細胞，通過增強吞噬作用減少腦部炎癥，促進大腦的修復與再生[45]。Schreibman等[46]研究了有關等滲甘露醇作用于腦出血大鼠模型的靶點,證實小膠質細胞活化在用藥后減少，為定期重復使用滲透治療藥物可減少腦出血后神經(jīng)炎癥提供了依據(jù)。另有研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內酯可抑制NF-κB信號通路激活并影響小膠質細胞的凋亡，體內TNF-α和IL-6的水平均明顯降低，表明穿心蓮內酯可減輕腦出血后繼發(fā)腦損傷[47]。今后可以設計抑制腦出血早期腦內激活小膠質細胞的藥理實驗，篩選減輕腦出血后腦損傷的新藥物及方法。活化的小膠質細胞參與了炎癥反應與免疫應答機制，加速神經(jīng)細胞凋亡。腦出血后小膠質細胞發(fā)揮不同作用的機制值得深入研究，有待解決的問題是如何更快地促使腦損傷后小膠質細胞從M1型轉向M2型。

6 其 他

腦出血后腦損傷的病理機制還涉及谷氨酸毒性、凝血酶系統(tǒng)、長鏈非編碼RNA失調、蛋白質組學和腦內能量代謝變化等方面。腦出血后興奮性毒性的谷氨酸表達過量，可影響腦出血后腦損傷[48]。腦出血后凝血酶系統(tǒng)被激活，凝血酶原信使RNA表達上調，局部凝血酶表達驅動了神經(jīng)元損傷[49]。

長鏈非編碼RNA主要參與轉錄激活等細胞多種調控過程。微陣列描述實驗性腦出血后期的長鏈非編碼RNA圖譜可發(fā)現(xiàn)，腦出血后遺癥可能涉及線粒體基質、G蛋白偶聯(lián)受體活性降低以及嗅覺傳導受損等[50]。這些失調的長鏈非編碼RNA和信使RNA可能是腦出血后腦損傷治療的新靶標。神經(jīng)蛋白質組學方法可以鑒定腦卒中后腦損傷病理生理過程中產(chǎn)生的候選生物標志物，現(xiàn)已證明出血性腦卒中蛋白與自噬、局部缺血、壞死、細胞凋亡、鈣蛋白酶激活和細胞因子分泌有關[51]。蛋白質組學可以精準篩選靶蛋白關鍵信息，Liu等[52]對腦出血中的蛋白質變化進行了綜合評估，并研究了腦出血后的能量代謝，首次發(fā)現(xiàn)氮代謝途徑在腦代謝中的核心位置，并初步探索腦出血能量代謝構建的蛋白質網(wǎng)絡。這提示腦損傷從分子通路水平到組織代謝水平均應給予足夠重視，由蛋白質組學和能量代謝角度觀察腦出血后腦損傷病理變化將是未來的研究方向。

7 小 結

腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理途徑包括血腦屏障的破壞及腦水腫形成，氧化應激和炎癥反應、自噬與細胞凋亡、小膠質細胞活化、腦內能量代謝及蛋白質組學改變、興奮性毒性、鐵沉積等[53]。這些病理途徑相互作用，單一論證腦出血后腦損傷病機是不充分的。Wang等[6]研究表明，褪黑素可通過影響細胞凋亡、炎癥、氧化應激、DNA損傷、腦水腫和血腦屏障損傷來改善腦出血引起的繼發(fā)性腦損傷癥狀。Qi等[54]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可下調凋亡因子caspase-3以及促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，證實二甲雙胍可成為臨床治療腦出血的潛在藥物。未來對腦出血后腦損傷的研究可從同一靶點的不同角度展開，如MMP-9在腦出血急性期及恢復期釋放濃度不同因而功能不同；AQP4可能對中樞細胞的水液代謝具有雙向調節(jié)作用；NF-κB通路在促凋亡或抗凋亡作用中的動態(tài)變化；腦出血后小膠質細胞發(fā)揮不同作用對腦損傷影響等。多角度研究還包括體內腦出血動物模型及體外細胞培養(yǎng)、引入基因敲除的實驗模型、增加激動劑與抑制劑等，并采用多重分組論證藥物及療法的作用靶標。相信未來對腦出血后腦損傷的研究會有更多的新角度與方法，并且這些研究成果會有效服務于臨床。