陳麗娥，謝謝，王識華

(1.海南省第三人民醫(yī)院病理科，海南 三亞 572000； 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)三亞康復(fù)療養(yǎng)中心健康管理部，海南 三亞 572000)

乳腺癌作為一種女性多發(fā)惡性腫瘤，約占全部女性惡性腫瘤的20%，國內(nèi)患病率約為26/10萬[1]。目前，乳腺癌的早期診斷方法包括臨床體格檢查、影像學(xué)檢查、血清學(xué)標(biāo)志物等，但這些傳統(tǒng)診斷技術(shù)的敏感性和特異性不高，因此乳腺癌早期仍有相對較高的誤診和漏診率，這也是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不佳的重要原因之一[2-3]。為找到更為敏感且準(zhǔn)確的診斷標(biāo)志物，近年與乳腺癌早期診斷相關(guān)的分子生物學(xué)逐漸成為研究重點(diǎn)。膜泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的主要方式，轉(zhuǎn)運(yùn)時細(xì)胞膜常以囊泡的形式存在，包裹蛋白質(zhì)、核酸、多糖等一系列物質(zhì)[4]，其中也包含外泌體。外泌體是一類活細(xì)胞自體分泌的囊泡小體，這類囊泡小體包裹核酸、蛋白質(zhì)及RNA等物質(zhì)[5]，直徑為40～100 nm[6]。外泌體包含起源細(xì)胞的遺傳信息，其釋放進(jìn)入外循環(huán)后，在循環(huán)系統(tǒng)均勻并穩(wěn)定存在，這種獨(dú)特的分布特性使其成為乳腺癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測的新型腫瘤標(biāo)志物[7-8]。現(xiàn)就外泌體在乳腺癌病理診斷中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體的來源、結(jié)構(gòu)及功能

外泌體是一類多形性囊泡樣小體，可由多種細(xì)胞分泌，廣泛分布于尿液、血液、滲出液、唾液等多種體液中，甚至在孕產(chǎn)婦的羊水中也有分布，且水平相對較高[9-10]。外泌體這種廣泛分布的納米級囊泡結(jié)構(gòu)小體參與了內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞及信息傳遞，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。細(xì)胞所處的組織部位不同，其分泌的外泌體內(nèi)容物也有所不同，且相關(guān)內(nèi)容物在組成、功能等方面也存在顯著差異。有研究指出，這種不同組織部位導(dǎo)致細(xì)胞外泌體內(nèi)容物的生物學(xué)差異與各組織所處外環(huán)境差異有關(guān)[12]。外泌體的生成受跨膜區(qū)蛋白超家族成員(如CD9、CD63)的調(diào)控，其他特異性細(xì)胞蛋白也參與了外泌體的生成和釋放[13-14]。在腫瘤細(xì)胞生成的外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子-β、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)配體等免疫抑制蛋白和腫瘤抗原。腫瘤細(xì)胞分泌并釋放的外泌體內(nèi)含有高水平的微RNA(microRNA，miRNA)，該水平的miRNA能夠參與腫瘤的自身調(diào)控，同時還能對細(xì)胞外RNA的穩(wěn)定產(chǎn)生保護(hù)作用，轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA與信使RNA至其他細(xì)胞或組織內(nèi)，可產(chǎn)生調(diào)控作用[15-16]。在肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤組織及細(xì)胞中均檢測到miRNA或相關(guān)蛋白分子[17-18]。故推測外泌體可能與惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2 乳腺癌的發(fā)生與外泌體

既往研究指出，惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的異常改變有關(guān)[19]。腫瘤干細(xì)胞能夠加速腫瘤細(xì)胞的增殖，推動腫瘤細(xì)胞向不同類型分化；介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，推動惡性腫瘤疾病后續(xù)一系列如浸潤、轉(zhuǎn)移、增殖等不良情況的發(fā)生。在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體還會對腫瘤周圍新生血管的生成產(chǎn)生影響，加速腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，外泌體的這種促新生血管形成機(jī)制主要受體內(nèi)乙酰肝素酶、組織含氧量等因素的影響[20]。

Clayton和Tabi[21]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅能夠加速惡性腫瘤細(xì)胞周圍正常細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡；還能通過調(diào)節(jié)與免疫逃亡反應(yīng)相關(guān)的受體(如自然殺傷細(xì)胞2族成員D受體)，抑制機(jī)體對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)共同培育乳腺癌腫瘤細(xì)胞外泌體與外周血淋巴細(xì)胞時，自然殺傷細(xì)胞2族成員D受體陽性細(xì)胞的檢出數(shù)量顯著減少，認(rèn)為淋巴細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量的減少可能介導(dǎo)了乳腺癌惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的識別和供給[22]。在之后的研究中還發(fā)現(xiàn)，使用乙酰肝素酶刺激乳腺癌細(xì)胞可導(dǎo)致外泌體大量分泌，這一結(jié)果也為臨床證實(shí)外泌體參加了腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成提供了依據(jù)，同時也提示外泌體可能參與并推動了惡性腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23]。此外，也有研究認(rèn)為外泌體會影響腫瘤微環(huán)境，加速腫瘤轉(zhuǎn)化，參加腫瘤各個發(fā)展階段，加速病情惡化[24]。

3 乳腺癌早期診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志物

目前，乳腺癌的診斷主要依賴體格檢查、病理檢查、影像學(xué)檢查及血清學(xué)標(biāo)志物。乳腺癌的標(biāo)志物大致分為3類:①組織學(xué)標(biāo)志物，如孕激素、雌激素、人類表皮生長因子2等[25]；②基因型標(biāo)志物，較其他標(biāo)志物的敏感性和特異性高[26]；③血清學(xué)標(biāo)志物，如癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原549-muc-1等，但其特異性均不十分理想[27]。Zhang等[28]認(rèn)為，檢測唾液中外泌體的水平能夠?qū)θ橄侔┰缙谧龀鰷?zhǔn)確判斷。該研究指出，乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體通過唾液腺分泌后，其蛋白、RNA、核酸等內(nèi)容物將發(fā)生蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變，并進(jìn)一步提高表達(dá)狀態(tài)，推測外泌體包含的miRNA可用于乳腺癌的早期診斷。

4 外泌體與乳腺癌的診斷

傳統(tǒng)的乳腺癌檢查手段有乳腺鉬靶檢查和乳腺X線檢查，但這些檢查手段受乳腺腫瘤大小及病理分型的限制，且可能會對女性身體產(chǎn)生不良影響[29]。乳腺癌患者發(fā)病后機(jī)體將大量合成并分泌外泌體，外泌體水平激增，不同體液中外泌體攜帶的分子也有所不同，蛋白質(zhì)、核酸等的含量顯著增加[30]。外泌體作為乳腺癌早期診斷及監(jiān)測方法已被逐漸被認(rèn)可，目前用于乳腺癌診斷的外泌體標(biāo)志物包括外泌體核酸、外泌體蛋白質(zhì)。除可用于惡性腫瘤疾病的早期診斷外，外泌體還能用于腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移的評估。組織缺氧能加速惡性腫瘤細(xì)胞釋放外泌體，在相對缺氧的惡性腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的外泌體將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的增長與繁殖，惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與上皮細(xì)胞發(fā)生作用后，可間接加速腫瘤細(xì)胞的生長與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[31]。

4.1外泌體核酸 腫瘤的發(fā)生與起源均依靠具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞，這類細(xì)胞往往能加速腫瘤的增殖，推動腫瘤細(xì)胞向不同類型分化。研究認(rèn)為，外泌體miRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物的前景廣泛，甚至可能改變?nèi)橄侔┰缙谠\斷與管理的手段[12]。Hannafon等[32]的研究納入了16例經(jīng)病理診斷確診為乳腺癌的患者和16例接受常規(guī)檢查證實(shí)無乳腺可疑病變的健康女性，分離健康女性與乳腺癌患者的血漿外泌體，在分離出的外泌體中提取總RNA，并選擇至少3種特異性分泌的miRNA行實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿外泌體miR-21和miR-1246的表達(dá)較健康女性顯著增加。Eichelser等[33]分析了12例健康女性與50例乳腺癌患者血清外泌體中miR-372、miR-101的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，乳腺癌患者血清外泌體miR-372、miR-101的表達(dá)水平均明顯升高，提示外泌體miRNA可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，若乳腺癌患者雌激素受體和孕激素受體均為陰性，則其體液中外泌體miR-373的水平將顯著高于雌激素受體和孕激素受體均為陽性的患者[34]。該研究認(rèn)為，血清外泌體miR-373有望成為高侵襲性乳腺癌早期診斷的重要標(biāo)志物[34]。目前，關(guān)于乳腺癌早期采用外泌體miRNA作為血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)研究較多，但有關(guān)外泌體環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA是否能用于乳腺癌早期的診斷報道較少，這可能與環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA等在外泌體內(nèi)的表達(dá)水平相對較低、檢測難度大等有關(guān)，故外泌體環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA等是否可作為乳腺癌診斷及監(jiān)測的標(biāo)志物還需進(jìn)行更為深入的研究。

4.2外泌體蛋白質(zhì) 除外泌體核酸可用于乳腺癌的診斷外，外泌體蛋白質(zhì)在乳腺癌的早期診斷中也有較高價值。在早期乳腺癌患者的血清中，外泌體Survivin-2B呈高表達(dá)，但在高級別乳腺癌患者中，血清外泌體Survivin-2B則呈低表達(dá)甚至無表達(dá)，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者也未見高表達(dá)，甚至是無表達(dá)[35]。該研究認(rèn)為，血清外泌體Survivin-2B可作為早期乳腺癌血清生物標(biāo)志物及預(yù)后預(yù)測評估的重要指標(biāo)[35]。Moon等[36-37]分析乳腺癌患者細(xì)胞外囊泡表面生物分子的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Del-1蛋白、纖連蛋白在乳腺癌患者血漿細(xì)胞外囊泡上呈高表達(dá)，可考慮將其作為乳腺癌早期檢測評估的指標(biāo)。細(xì)胞外囊泡主要包括微泡和外泌體，但是外泌體還是微泡上存在的Del-1蛋白、纖連蛋白與乳腺癌相關(guān)至今尚未明確，有待深入研究。Lee等[38]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清外泌體表面的CD47呈高表達(dá)，不僅如此，乳腺癌患者血清外泌體中血管內(nèi)皮生長因子受體、CD63、CD24也呈高表達(dá)，其中外泌體CD24高表達(dá)可能參與了乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有研究證實(shí)，發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，體內(nèi)循環(huán)外泌體表皮生長因子樣重復(fù)折疊1結(jié)構(gòu)蛋白3呈高表達(dá)，該蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能主要通過整合素黏著斑激酶介導(dǎo)，這種被整合素黏著斑激酶所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將提高癌細(xì)胞的侵襲性，加速惡性腫瘤細(xì)胞向其他重要臟器及組織的轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移等[39]。此外，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，血漿外泌體骨膜素呈高表達(dá)[40]。可見，骨膜素與表皮生長因子樣重復(fù)折疊1結(jié)構(gòu)蛋白3聯(lián)合可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌診斷的標(biāo)志物。也有研究認(rèn)為，乳腺癌患者血漿熱激蛋白90α呈高表達(dá)，故該蛋白也可作為乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物，對乳腺癌的早期診斷有一定的指導(dǎo)價值[41]。目前關(guān)于外泌體熱激蛋白是否與乳腺癌有直接關(guān)系的研究不多，也無較多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持，未來需進(jìn)一步驗(yàn)證。

雖然目前關(guān)于外泌體蛋白質(zhì)、外泌體核酸與乳腺癌相關(guān)性的研究已經(jīng)較為深入和成熟，但這些外泌體蛋白質(zhì)及外泌體核酸與乳腺癌臨床病理分型、分期、分化程度、轉(zhuǎn)移情況等的相關(guān)性仍缺乏相對全面且系統(tǒng)的研究，且各外泌素蛋白質(zhì)及外泌素核酸用于乳腺癌診斷的價值也尚未達(dá)成共識，各外泌素蛋白質(zhì)及核酸檢測是否能兼具檢測成本低、檢出率高等優(yōu)勢也尚無相關(guān)研究加以驗(yàn)證，這些均是未來需要研究與解決的問題，這對提高外泌體在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用極為關(guān)鍵。

5 小 結(jié)

外泌體及其相關(guān)內(nèi)容物可用于乳腺癌的早期診斷，且敏感性和特異性均較傳統(tǒng)生物標(biāo)志物更理想。一方面，外泌體可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，經(jīng)處理后的外泌體能夠特異性靶向乳腺腫瘤細(xì)胞，延長化療藥物的半衰期，進(jìn)一步提高化療效果；另一方面，在正常乳腺癌細(xì)胞中，外泌體會誘導(dǎo)致癌特性，在乳腺癌化療敏感癌細(xì)胞中誘導(dǎo)對化療藥物的耐藥。外泌體在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的這些作用尚未被系統(tǒng)且全面的證實(shí)。結(jié)合外泌體的低免疫原性的特性，未來可將其作為納米載體，進(jìn)行多中心、大樣本、長時間的研究，以期為乳腺癌等惡性腫瘤疾病的診斷、基因治療、免疫治療、預(yù)后評估等提供新方向，以提高惡性腫瘤疾病的診治效果。