鄧玉皎，李 娜，朱文革，代志軍,3*

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病醫(yī)院（西安 710004）

2.喬治華盛頓大學(xué)生化與分子生物學(xué)系（華盛頓 20052）

3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科（杭州 310003）

乳腺癌是女性發(fā)病率第一、死亡率第二的癌癥[1]，其疾病負(fù)擔(dān)在全球范圍內(nèi)均較重[2]。它的發(fā)生是遺傳、環(huán)境等多因素協(xié)同作用的結(jié)果[3]。從基因到蛋白質(zhì)存在轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后水平的調(diào)控過程，研究表明組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度并不完全符合[4]。據(jù)報道，基因與翻譯后蛋白質(zhì)的表達(dá)水平之間的相關(guān)性僅為0.4-0.5，基因無法解釋一切表型。蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Posttranslational modifications，PTM）是指對翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價加工的過程，通過在一個或多個氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)，可以改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和活性狀態(tài)，亞細(xì)胞定位及蛋白相互作用。目前已知的PTM有300多種，但只有少數(shù)被研究，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、N-糖基化、琥珀酰化、丙酰化等[5]。PTM是增加蛋白質(zhì)多樣性的關(guān)鍵機(jī)制，其復(fù)雜性和動態(tài)性是蛋白質(zhì)研究的難點(diǎn)[6]。蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍、最重要的一種PTM，約30%的人類蛋白質(zhì)組被磷酸化，幾乎參與細(xì)胞所有的生命活動過程，如細(xì)胞分裂、蛋白分解、信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和蛋白相互作用等[7]。與其他PTM相似，磷酸化是一個可逆的生物化學(xué)過程，激酶和磷酸酶在磷酸化位點(diǎn)水平上競爭以調(diào)節(jié)磷酸化狀態(tài)。然而，磷酸化蛋白質(zhì)的豐度低，通常低至1%，而且同一個蛋白質(zhì)中也可能存在不同的磷酸化類型，其精準(zhǔn)分析困難大。磷酸化蛋白組學(xué)是蛋白組學(xué)的一個分支，其核心挑戰(zhàn)是蛋白質(zhì)組中低豐度磷酸化多肽的富集和高靈敏的檢測手段?，F(xiàn)對近年來磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳腺癌診斷及治療研究中的進(jìn)展作一綜述。

1 磷酸化蛋白組學(xué)技術(shù)的研究現(xiàn)狀

1.1 磷酸化多肽樣本的前處理

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需要高分離效率、高靈敏度、高通量、寬動態(tài)范圍分析技術(shù)的支持[8]。一般由三大技術(shù)所支撐：蛋白質(zhì)提取與純化、質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）技術(shù)鑒定蛋白、以及利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)的比對分析[9]。提取磷酸化蛋白的組織樣本及細(xì)胞均需用蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑進(jìn)行保存及處理，避免反復(fù)凍融，嚴(yán)格冰上操作，采用劇烈變性條件，盡量加快處理速度，以減少磷酸化多肽的降解及損失。蛋白提取后需用適當(dāng)?shù)牡鞍酌福ㄒ鹊鞍酌缸畛Ｓ茫┫盖兄蟮碾亩斡捎谠贑末端攜帶了堿性氨基酸，生成的多肽混合物中的磷酸化多肽進(jìn)行特異性富集，之后進(jìn)行質(zhì)譜分析。將質(zhì)譜信息與選定的蛋白數(shù)據(jù)庫相匹配，可以確定肽段序列和結(jié)合的磷酸化位點(diǎn)[10]。

1.2 定量蛋白質(zhì)組技術(shù)概況

蛋白定量技術(shù)和修飾富集技術(shù)相結(jié)合，可以一次性實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜樣品中的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模修飾定性和定量分析[11]。定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)包括靶向定量和非靶向定量技術(shù)。靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)包括多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（Multiple reaction monitoring，MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要方法可分為無標(biāo)記法、代謝標(biāo)記法、等壓標(biāo)記法和靶向法，例如氨基酸代謝結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記（Tandem mass tags，TMT）、等壓標(biāo)記法（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）等[12]。TMT和iTRAQ定量準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)分組分析；樣品混合上機(jī)，節(jié)省機(jī)時成本；但需要標(biāo)記試劑，有樣本數(shù)的限制。Lable-free定量技術(shù)無需昂貴的標(biāo)記試劑，操作簡單；無樣品數(shù)限制，適合大樣本量的定量分析；可以實(shí)現(xiàn)有或無的比較；對實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜平臺的技術(shù)穩(wěn)定性要求高，否則定量結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

1.3 磷酸化多肽富集技術(shù)進(jìn)展

基于MS的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以一次識別數(shù)千條磷酸化多肽[13]，間接包含關(guān)于蛋白激酶活性的全面信息[14]。雖然母離子掃描等串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以直接從多肽混合物中選擇性地分析磷酸化肽段并進(jìn)行序列分析，但是實(shí)際生物樣本中磷酸化蛋白的化學(xué)計量值低且含量少，淹沒在大量非磷酸化的肽段中。同時磷酸化多肽本身所具的負(fù)電性又使其在正離子模式的質(zhì)譜分析中信號受到抑制，磷酸化多肽的信號豐度會比其相應(yīng)未磷酸化肽段的豐度要低很多，在復(fù)雜樣本中磷酸化多肽的檢測非常困難[15]。因此，復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物樣本必須在分析前能夠?qū)α姿峄嚯倪M(jìn)行選擇性分離或富集。目前磷酸化多肽的富集手段包括固定化金屬親和層析（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）、金屬氧化物親和層析（Metal oxide affinity chromatography，MOAC），免疫親和純化抗體富集法，離子交換層析（B Ion Exchange and Mixed Mode Chromatography Ion exchange, IEX）和親水相互作用色譜法（Hydrophilic interaction chromatography, HILIC）[16-17]。

許多基于化學(xué)的層析方法已經(jīng)被用來富集含有絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）的磷酸化多肽。IMAC 是利用固定在樹脂上的金屬離子，例如Fe3+、 Zr4+或Ga3+，最新的有Gd3+、La3+、Ho3+、Ce4+和 Er3+，它們可以高選擇性地螯合帶負(fù)電的磷酸化多肽。Fe3+-IMAC可以優(yōu)先富集酸性磷酸肽，而Ti4+-IMAC更適合富集堿性磷酸肽。IMAC的弱點(diǎn)是不能很好地結(jié)合含有多個堿性氨基酸殘基的磷酸肽；另一個限制是單磷酸化多肽的回收率相對較低，這是由于與多磷酸化肽相比，單磷酸化肽與金屬陽離子的相互作用較弱。除了IMAC，MOAC也利用了金屬陽離子，以金屬氧化物的形式作為磷酸鹽的結(jié)合位點(diǎn)。相對于IMAC，MOAC中的金屬陽離子與鄰近的氧陰離子形成穩(wěn)定的鍵，因此對低pH值和洗滌劑更有耐受性。金屬陽離子和實(shí)驗(yàn)條件對MOAC的選擇性都有影響，包括肽珠負(fù)載率，以及負(fù)載緩沖、 洗滌緩沖和洗脫緩沖液?；诙趸仯═iO2）的MOAC也被廣泛用于磷酸化多肽的富集，其與IMAC方法分別富集不同范圍的磷酸化多肽，兩者結(jié)合可以提高磷酸化蛋白的覆蓋率。與固相IMAC相比，新提出的PolyMAC可以在均勻的水環(huán)境中與磷酸肽結(jié)合，避免了固相的不均勻性，具有螯合時間快，重現(xiàn)性高，選擇性從復(fù)雜混合物回收磷酸肽，有報道稱其比TiO2法產(chǎn)量更高。

IEX方法，包括強(qiáng)陽離子交換法，強(qiáng)陰離子交換法，靜電排斥液相相互作用色譜，可以同時富集和分離磷酸化多肽。HILIC法利用磷酸化多肽強(qiáng)烈的親水性在色譜圖的中間部分進(jìn)行洗脫，隨后使用IMAC或TiO2進(jìn)行富集。雖然細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組中絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化是主要的修飾，但由于修飾殘基的尺寸較小，因此抗原性較低，無法獲得針對絲氨酸或蘇氨酸殘基的選擇性抗體?；诿庖哂H和的方法主要用于富集酪氨酸磷酸化肽，主要通過抗體富集。與占磷酸化蛋白99%以上的絲、蘇氨酸修飾不同，酪氨酸磷酸化（pTyr）的蛋白所占比例較小，占比不到0.5%?？筽Tyr抗體由于其在純化pTyr上的特殊特異性，一直是一種不可替代的工具，與pSer和pThr相比，pTyr肽的豐度極低，但是，抗體應(yīng)用非常昂貴。酪氨酸磷酸化多肽富集難度較大，新型富集方法有pTyr100抗體與蛋白G瓊脂糖非共價偶聯(lián)，從胰蛋白酶化蛋白提取物中直接免疫沉淀含有pTyr的多肽等。除了pTyr-特異性抗體外，磷酸蛋白結(jié)合元件（尤其是Src同源性（SH2）結(jié)構(gòu)域）也被用于富集含有pTyr-的蛋白和肽段。使用IMAC或TiO2對免疫沉淀組分進(jìn)一步分離，可以去除非特異性磷酸化多肽?；瘜W(xué)富集法和磷酸化酪氨酸多肽免疫沉淀法的聯(lián)合使用可以實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白組較全的覆蓋率[11]。還有一些新興的富集技術(shù)，例如分子印跡聚合物， 羥基磷灰石色譜等。

1.4 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)采集方法

用于獲取磷酸化蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)采集方法是影響MS實(shí)驗(yàn)中生成數(shù)據(jù)類型的關(guān)鍵因素。迄今為止，大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究都是在數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）模式下進(jìn)行的，但其檢測偏向于高豐度多肽且具有相當(dāng)大的不可再生性。而選擇反應(yīng)監(jiān)測/多重反應(yīng)監(jiān)測（SRM/MRM），只檢測具有已知裂解譜的預(yù)先指定肽段的存在和豐度。這種靶向方法部分克服了DDA的缺點(diǎn)，但不適合大規(guī)模研究。目前，數(shù)據(jù)非依賴采集技術(shù)（DIA）的應(yīng)用被逐漸推廣，其不限制于目標(biāo)肽段，數(shù)據(jù)采集無偏向性，全景式掃描，數(shù)據(jù)可回溯，結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好，可以用于未知蛋白的探索和大樣本量的研究[18-19]。單針分析由于其吞吐量和周轉(zhuǎn)時間，以及可重復(fù)性、可擴(kuò)展性和對并行處理和自動化的適應(yīng)性，更適合臨床分析。

2 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的研究進(jìn)展

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展研究過程中的應(yīng)用越來越廣泛。體外和細(xì)胞磷酸化蛋白水平的測定識別出CDK5的活性底物，發(fā)現(xiàn)CDK5介導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)CRMP2A的磷酸化引起癌變[20]。多蛋白靶標(biāo)的高通量化學(xué)篩選和質(zhì)譜分析提示，CDK1可以通過磷酸化直接調(diào)控FOXA1，是BT474細(xì)胞系中與FOXA1相互作用的因子[21]。線粒體蛋白組學(xué)為蛋白定位分析提供了可能。通過2D-DIGE分析并比較乳腺癌細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)譜，質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)BRCA1突變狀態(tài)與定位于線粒體的特定區(qū)域的HIF-1α有關(guān)[22]。基于磷酸化蛋白組學(xué)質(zhì)譜分析的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)的研究揭示CK2結(jié)合位點(diǎn)的磷酸化對PGRMC1的激活至關(guān)重要，對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[23]。研究者利用親和純化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，結(jié)合MS與人293T細(xì)胞鑒定出與A3B相互作用的細(xì)胞蛋白，提示DNA脫氨酶APOBEC3B干擾CDK4介導(dǎo)的Cyclin D1的核導(dǎo)入，促進(jìn)癌變[24]。通過iTRAQ標(biāo)記和串聯(lián)質(zhì)譜測定四種乳腺癌細(xì)胞系與正常對照細(xì)胞系的差異蛋白表達(dá)譜，確定了腫瘤生物標(biāo)記物，并在每種乳腺癌細(xì)胞系提出了一套獨(dú)特的多肽，可以對不同亞型的乳腺癌進(jìn)行分類[25]，從而做到精準(zhǔn)診療。TNBC是一種異質(zhì)性較大，臨床侵襲性較強(qiáng)的疾病，目前缺乏有效的靶向治療手段。Wu等使用定量高分辨率傅里葉變換質(zhì)譜分析了26個TNBC細(xì)胞系的磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)組。從969個蛋白中鑒定出1 789個酪氨酸磷酸化肽段，為TNBC中酪氨酸激酶通路激活狀態(tài)的異質(zhì)性提供了新的見解[26]。

蛋白激酶調(diào)控異常導(dǎo)致下游相關(guān)信號通路異常激活或失活，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移。采用蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸激酶陣列、mRNA測定、免疫組織化學(xué)等方法，研究者發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，DeltaNp63激活EGFR信號誘導(dǎo)黏附喪失[27]。還有研究者通過多組學(xué)分析識別出DNA損傷反應(yīng)蛋白ATM是細(xì)胞因子產(chǎn)生的驅(qū)動因素，可以增加免疫浸潤，發(fā)現(xiàn)了不同的驅(qū)動因素導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤的癌癥譜系，促進(jìn)免疫療法在不同腫瘤的臨床應(yīng)用[28]。為了闡明控制腫瘤細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞和隨后的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的信號，Locard-Paulet等進(jìn)行了磷酸化蛋白組學(xué)分析，繪制轉(zhuǎn)移MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞接觸時觸發(fā)的細(xì)胞特異性蛋白磷酸化水平變化。細(xì)胞特異性磷酸化蛋白質(zhì)組分析提供了腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞之間接觸啟動信號的雙向圖譜，進(jìn)一步闡明了癌細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的機(jī)制[29]。Koh等對表達(dá)活性H-Ras的侵襲性MCF10A人乳腺上皮細(xì)胞和表達(dá)活性N-Ras的非侵襲性細(xì)胞的脂質(zhì)筏蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析，鑒定出脂筏蛋白flotillin-1是H-Ras激活和乳腺癌細(xì)胞侵襲的重要調(diào)控因子[30]。Law等使用磷酸化突變體細(xì)胞株進(jìn)行免疫印跡分析、親和純化，以評估CDCP1蛋白磷酸化和/或蛋白復(fù)合物的形成。通過蛋白條帶切除和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)CDCP1通過促進(jìn)EGFR和Src在細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)接觸部位的活化而促進(jìn)黏附的喪失[31]?；谫|(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有助于乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)激酶譜動態(tài)變化的追蹤和深入研究。

3 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與乳腺癌標(biāo)志物的研究進(jìn)展

目前，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以用于乳腺癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[32]。Urasaki等在乳腺癌細(xì)胞系中檢測了MEK1、MEK2和ERK1/2的PTM譜，然后用納米流控蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)pMEK1（Thr286）磷酸化亞型，它是乳腺癌細(xì)胞周期調(diào)控負(fù)反饋磷酸化的生物標(biāo)志物[33]。研究表明，組蛋白H1磷酸化可能作為乳腺和其他癌癥的臨床生物標(biāo)志物。Chen等使用了自上而下的質(zhì)譜分析工作流程來識別和定量與乳腺細(xì)胞在細(xì)胞周期中的進(jìn)展相關(guān)的H1蛋白形態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)組蛋白H1.2多個位點(diǎn)磷酸化在M期相對于S期顯著增加，表明磷酸化是細(xì)胞周期依賴的，可以作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物[34]。Chen等提出了一種從人血漿中分離和識別胞外囊泡中的磷酸化蛋白作為區(qū)分疾病和健康狀態(tài)的潛在標(biāo)記的策略。利用無標(biāo)記定量磷酸化蛋白組學(xué)，可以從人類血漿中分離的胞外囊泡的磷酸化蛋白中篩選乳腺癌的候選標(biāo)志物[35]。Roth等對在表皮生長因子培養(yǎng)中刺激的未轉(zhuǎn)化乳腺上皮細(xì)胞（MCF10A）進(jìn)行了磷酸化蛋白組學(xué)SILAC分析，進(jìn)一步通過酵母雙雜交和共免疫沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LAD1是響應(yīng)EGF的肌動蛋白動力學(xué)的絲狀蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)劑，是侵襲性乳腺腫瘤的標(biāo)志物[36]。

4 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與乳腺癌治療及耐藥的研究進(jìn)展

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在乳腺癌預(yù)后、治療靶點(diǎn)以及治療效果預(yù)測等方面應(yīng)用前景廣泛。利用反相蛋白陣列技術(shù)對6個不同表型乳腺癌細(xì)胞系的MAPKs蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析后，研究者發(fā)現(xiàn)MAPKs水平與預(yù)后相關(guān)[37]。ER陽性乳腺腫瘤占所有乳腺癌病例的70%。雖然內(nèi)分泌治療在輔助治療或復(fù)發(fā)的情況下是有效的，但耐藥性使得藥物療效削弱。Cuesta等對ER陽性MCF7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)ER通過DEPTOR調(diào)控mTOR活性。該研究為雙PI3K/mTOR抑制劑聯(lián)合內(nèi)分泌治療作為ER陽性晚期乳腺癌患者的一線治療提供了支持[38]。他莫昔芬是一種ER拮抗劑，是治療乳腺癌的重要藥物。然而，大量的病人表現(xiàn)出新生或獲得性耐藥性。為了研究耐藥機(jī)制，Wu等對三苯氧胺耐藥的細(xì)胞系進(jìn)行了定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。隨后的基因集富集分析顯示FAK2不僅在他莫西芬耐藥細(xì)胞中被過度磷酸化，而且轉(zhuǎn)錄上調(diào)。通過特異性siRNA敲低或小分子抑制劑抑制FAK2，可以抑制體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤的形成，提示FAK2是激素難治性乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[39]。Cheng等通過整合腫瘤基因組圖譜中的mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和反相蛋白陣列中的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，闡明了PIK3CA在乳腺癌發(fā)生及耐藥性產(chǎn)生過程中的功能[40]。目前，獲得性的曲妥珠單抗耐藥仍然是HER2陽性患者的治療難題。Nunes等使用SILAC的定量蛋白質(zhì)組學(xué)比較曲妥珠單抗敏感與耐藥細(xì)胞的蛋白質(zhì)組譜圖，發(fā)現(xiàn)在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞（BT474-TR）中，自噬相關(guān)蛋白9A（ATG9A）是一個下調(diào)蛋白，其缺失可使HER2從溶酶體靶向降解中逃逸[41]。Chang等使用SILAC細(xì)胞中的氨基酸，對拉帕替尼敏感和耐藥細(xì)胞株（SKBR3和SKBR3-lr）進(jìn)行了磷酸化蛋白組學(xué)分析，并進(jìn)一步分析了信號通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)后，確定PAK2作為治療靶點(diǎn)，并驗(yàn)證PAK2敲除和PAK抑制劑治療具備使拉帕替尼耐藥細(xì)胞再敏化的作用[42]。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在癌癥化療耐藥及放療抵抗等機(jī)制的研究應(yīng)用中具備很大潛力。電離輻射廣泛應(yīng)用于癌癥治療，然而，癌細(xì)胞往往會產(chǎn)生輻射抵抗，這就削弱了癌癥放射治療的效果。定量評估抗輻射腫瘤細(xì)胞相對于輻射敏感性腫瘤細(xì)胞的整個激酶組的變化，可能為明確腫瘤適應(yīng)性輻射耐藥性的機(jī)制和發(fā)現(xiàn)有效預(yù)防和治療腫瘤輻射耐藥性的新靶點(diǎn)提供重要支持?；贛RM的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析耐輻射MCF-7/C6乳腺癌細(xì)胞的激酶組特征，發(fā)現(xiàn)CHK1、CDK1、CDK2和DNA依賴性蛋白激酶過表達(dá)，為放療抵抗性癌細(xì)胞的再敏化和抵消電離輻射的有害影響提供潛在靶點(diǎn)[43]。通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Heerma等發(fā)現(xiàn)在RK-33或DDX3敲除后，參與線粒體翻譯和呼吸電子傳輸通路的蛋白顯著下調(diào)。DDX3與RK-33通過抑制線粒體翻譯導(dǎo)致乳腺癌的放療增敏，從而導(dǎo)致細(xì)胞的氧化磷酸化能力降低和ROS水平增加[44]。

5 展望

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為蛋白活性功能及其動態(tài)變化機(jī)制研究提供支持，但其仍面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，磷酸化蛋白組學(xué)的復(fù)雜性高，多肽濃度動態(tài)范圍廣，由于理化性質(zhì)和技術(shù)限制，其高度動態(tài)和短暫性質(zhì)的磷酸化多肽難以準(zhǔn)確捕捉。由于每種富集方法都有其自身的優(yōu)勢和局限性，因此將互補(bǔ)的方法組合成多維混合策略是有益的。其次，磷酸化蛋白的豐度通常很低，而且磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計量數(shù)很低，被高豐度的非磷酸化的異構(gòu)體所掩蓋，其分析核心是專用的富集程序，高選擇性地分離磷酸肽。另一個挑戰(zhàn)是樣本管理，樣本收集或處理任何延遲可能導(dǎo)致磷酸化蛋白的變化。同一瘤體不同區(qū)域的蛋白水平是一致的，但蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的加入對樣品中磷酸化多肽的水平有一定影響，樣品前處理很大程度決定了結(jié)果的質(zhì)量。磷酸化蛋白水平存在顯著差異，反映了細(xì)胞信號的空間異質(zhì)性，對來自多個活組織切片的磷酸化蛋白組數(shù)據(jù)集的解釋提出了重大挑戰(zhàn)。

磷酸化蛋白組學(xué)質(zhì)譜會產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，開發(fā)更好的分析計算方法是必須的。處理大量磷酸蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集的一個主要挑戰(zhàn)是找到有效的方法來提取關(guān)鍵磷酸化多肽的相互作用。目前，大多數(shù)磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)來源于組織和較高的細(xì)胞數(shù)量，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)為單細(xì)胞分辨率的蛋白分析提供了可能，但其技術(shù)難度大，單細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集相關(guān)技術(shù)還十分不成熟。磷酸化蛋白質(zhì)的空間分布，包括組織中異質(zhì)受體的表達(dá)和激活，以及細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的分區(qū)化還需要進(jìn)一步研究。此外，一個蛋白可能在一個給定的時間內(nèi)以多個磷酸異構(gòu)體存在。這些異構(gòu)體它們的磷酸化位點(diǎn)的排列和占用都不同。因此，對這些磷酸化異構(gòu)體的整體表征是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。同時，還需結(jié)合多組學(xué)及免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白及其相關(guān)蛋白相互作用功能，為蛋白質(zhì)動態(tài)變化提供有力支持。