胡泰然，雷鐵池

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科，武漢 430060)

皮膚黑色素瘤是一種最具侵襲性和致命性的皮膚癌癥，被認(rèn)為是一種由遺傳易感和環(huán)境暴露等病因引發(fā)的多因素疾病，大多數(shù)由黑色素細(xì)胞形成的痣和色素斑惡變而來(lái)，其在皮膚癌癥相關(guān)死亡率中的占比較高。晚期黑色素瘤極具侵襲性，可經(jīng)血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)療法和放射療法具有特征性抵抗，預(yù)后較差[1-3]。既往研究表明，黑色素瘤的形成不僅僅與單一的惡性細(xì)胞有關(guān)，還與腫瘤基質(zhì)及腫瘤基質(zhì)細(xì)胞所構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等[4]。其中，CAFs是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細(xì)胞之一，近年來(lái)，CAFs與腫瘤細(xì)胞的相互作用一直受到人們的廣泛關(guān)注。有證據(jù)表明，CAFs通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的直接或間接接觸，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，使CAFs成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[5]。同樣，在黑色素瘤發(fā)病過(guò)程中，正常成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts，NFs)可在黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下活化形成CAFs，并與黑色素瘤細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、致密結(jié)構(gòu)形成、血管形成、轉(zhuǎn)移甚至耐藥[3]。因此，總結(jié)并闡明黑色素瘤與CAFs間的相互作用機(jī)制對(duì)黑色素瘤治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)具有重要意義?，F(xiàn)就黑色素瘤發(fā)病過(guò)程中與CAFs間的相互作用予以綜述。

1 黑色素瘤中CAFs的起源和形成

1.1NFs與CAFs的特征 正常組織中的成纖維細(xì)胞是非上皮、非免疫性細(xì)胞，表現(xiàn)出經(jīng)典的紡錘形形態(tài)，具有可能的間充質(zhì)譜系起源，通常以單細(xì)胞的形式存在于間質(zhì)中，偶爾存在于毛細(xì)血管附近，與基膜無(wú)關(guān)聯(lián)。NFs通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，其代謝和轉(zhuǎn)錄組學(xué)活性極低。NFs具有分化為活化的成纖維細(xì)胞的能力，并可在隨后基于適當(dāng)?shù)拇碳ぎa(chǎn)生其他間充質(zhì)譜系細(xì)胞[5]。

此外，CAFs還可指活化的成纖維細(xì)胞或活化的肌成纖維細(xì)胞，包括腫瘤相關(guān)的間充質(zhì)干細(xì)胞，其表型與NFs完全不同，而與肌成纖維細(xì)胞非常相似[5-6]。活化后的成纖維細(xì)胞可以獲得更多的分泌表型、更強(qiáng)的增殖特性、專門(mén)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑能力、強(qiáng)大的自分泌活化和動(dòng)態(tài)免疫信號(hào)調(diào)節(jié)功能，進(jìn)一步增加了腫瘤纖維化和腫瘤微環(huán)境的動(dòng)態(tài)復(fù)雜性[4,7]。雖然CAFs和NFs均表達(dá)成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物，但α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、S100A4蛋白和成纖維細(xì)胞活化蛋白α等活化標(biāo)志物分子僅在CAFs中表達(dá)[6]。

1.2NFs對(duì)早期黑色素瘤的抑制作用 在黑色素瘤發(fā)展的早期階段，NFs似乎與CAFs的功能相反，使用體外共培養(yǎng)模型時(shí)，NFs對(duì)來(lái)源于原發(fā)性黑色素瘤病變的腫瘤細(xì)胞有抑制性影響[8]。另有研究表明，當(dāng)黑色素瘤第一次發(fā)生時(shí)，基質(zhì)中靜息的成纖維細(xì)胞會(huì)形成屏障，并分泌一些細(xì)胞因子和化學(xué)因子，如γ干擾素、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α，它們相互作用并抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。此外，皮膚NFs形成的物理屏障也能阻止黑色素瘤細(xì)胞遷移并侵入周?chē)M織[3]。因此，NFs似乎抑制黑色素瘤在癌前病變時(shí)期的生長(zhǎng)和進(jìn)展。

1.3黑色素瘤主要以旁分泌方式促使CAFs的形成 隨著黑色素瘤的發(fā)展，黑色素瘤細(xì)胞分泌多種化學(xué)因子，誘導(dǎo)NFs細(xì)胞向黑色素瘤遷移、包圍，并滲入生長(zhǎng)的黑色素瘤體[4]。這些信號(hào)還誘導(dǎo)基質(zhì)中NFs的表觀遺傳和生化變化，從而形成CAFs。黑色素瘤中產(chǎn)生的血小板衍生生長(zhǎng)因子CC刺激NFs向腫瘤的募集，并促使NFs活化為CAFs[9-10]。黑色素瘤中分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β能誘導(dǎo)NFs分化和活化成為CAFs，且Nodal蛋白作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，具有與之類似的功能[11]。

黑色素瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡也可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程為CAFs。細(xì)胞外囊泡是由真核細(xì)胞釋放或脫落到腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外細(xì)胞器，如外泌體和細(xì)胞微泡等。它們含有各種生物活性蛋白、信使RNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)，可在惡性細(xì)胞、CAFs、間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞間被相互攝取，成為細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵[12]。黑色素瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞微泡可介導(dǎo)NFs向CAFs轉(zhuǎn)變，并調(diào)節(jié)血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)，從而增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞與CAFs的黏附；在缺氧刺激下，黑色素瘤細(xì)胞微泡在成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)更多胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化，導(dǎo)致血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)增加，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的黏附作用[13]。Dror等[14]報(bào)道，由黑色素瘤細(xì)胞分泌并被成纖維細(xì)胞吸收的黑素體miR-211可激活促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，并誘導(dǎo)NFs重編程為CAFs。此外，黑色素瘤細(xì)胞釋放的外泌體miR-155可以促進(jìn)NFs中CAFs特異性活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和成纖維細(xì)胞活化蛋白的表達(dá)[15]。由此可見(jiàn)，黑色素瘤細(xì)胞主要以旁分泌形式影響NFs的表觀遺傳，并使其活化成為CAFs。

2 CAFs促進(jìn)黑色素瘤的生長(zhǎng)

各種體內(nèi)外模型已證實(shí)CAFs對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、CXC趨化因子配體1、胰島素樣生長(zhǎng)因子2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3等參與了CAFs與黑色素瘤細(xì)胞之間的交互作用，上述細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)炎癥發(fā)生、刺激黑色素瘤生長(zhǎng)[3,10]。使用腫瘤異種移植模型對(duì)黑色素瘤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與NFs相比，CAFs能顯著促進(jìn)與其共注射的黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可過(guò)度表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤環(huán)境的產(chǎn)生[16]。因此，調(diào)節(jié)CAFs促進(jìn)黑色素瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制受到人們的關(guān)注。

在原位皮膚癌模型中，皮膚成纖維細(xì)胞中雄激素受體表達(dá)的下調(diào)能誘導(dǎo)CAFs活化的早期步驟，并增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的致瘤性。雄激素受體能抑制CAFs效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[17]。在軟瓊脂集落形成試驗(yàn)中，CAFs通過(guò)產(chǎn)生可溶性因子支持黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；當(dāng)阻斷CAFs中的β聯(lián)蛋白信號(hào)時(shí)，B-Raf激酶活化的同源性磷酸酶及張力蛋白可顯著抑制缺陷小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長(zhǎng)。由β聯(lián)蛋白消融導(dǎo)致的死亡CAFs可以釋放促凋亡或生長(zhǎng)抑制因子，從而誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡[16]。因此，皮膚成纖維細(xì)胞中的雄激素受體和β聯(lián)蛋白在調(diào)控CAFs促進(jìn)黑色素瘤生長(zhǎng)的信號(hào)通路中均發(fā)揮重要作用。

3 CAFs有助于黑色素瘤致密結(jié)構(gòu)的形成和耐藥

黑色素瘤細(xì)胞主動(dòng)募集成纖維細(xì)胞并刺激其分泌ECM，進(jìn)而促進(jìn)ECM的運(yùn)動(dòng)。在結(jié)構(gòu)上，與僅存在黑色素瘤細(xì)胞的瘤體相比，黑色素瘤細(xì)胞與CAFs形成的共培養(yǎng)瘤體更小、更緊湊、更有條理。CAFs促成黑色素瘤致密結(jié)構(gòu)形成的大致過(guò)程為：病程早期，發(fā)病部位只存在少量的游離黑色素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。隨后，黑色素瘤細(xì)胞刺激成纖維細(xì)胞，使其獲得功能過(guò)度活化的特征，形成CAFs。除增殖性和運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)外，CAFs還釋放了更多的生長(zhǎng)因子和蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶)，并增加ECM蛋白(如纖維粘連蛋白、肌腱蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白Ⅳ等)的表達(dá)，從而獲得強(qiáng)大的ECM生物合成和沉積能力。隨后，游離的黑色素瘤細(xì)胞遷移到ECM中穩(wěn)定下來(lái)，形成固定的黑色素瘤細(xì)胞，并分裂產(chǎn)生新的游離黑色素瘤細(xì)胞。在分裂的過(guò)程中，固定癌細(xì)胞會(huì)在空間上進(jìn)行自我封閉，最終形成封閉的隔室[3-5,10]。因此，實(shí)體瘤致密、纖維化的本質(zhì)被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)和ECM蛋白沉積的直接結(jié)果，這一結(jié)果可以防止治療性藥物到達(dá)黑色素瘤組織核心的黑色素瘤細(xì)胞處，從而促成腫瘤的耐藥性。

4 CAFs協(xié)助黑色素瘤進(jìn)行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程

在黑色素瘤中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表現(xiàn)為從上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泄δ苄蚤g充質(zhì)表型的惡性黑素細(xì)胞，這一過(guò)程被認(rèn)為具有驅(qū)動(dòng)黑色素瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能和侵襲性質(zhì)的作用。EMT的重要標(biāo)志包括上皮鈣黏素表達(dá)的下調(diào)和神經(jīng)鈣黏素表達(dá)的增加。正常黑素細(xì)胞存在于靠近基膜的表皮中，形成表皮黑色素單元，其中含有一個(gè)黑素細(xì)胞和多達(dá)36個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞。正常生理情況下，由于上皮鈣黏素的表達(dá)，黑素細(xì)胞黏附于角質(zhì)形成細(xì)胞，導(dǎo)致黑素細(xì)胞生長(zhǎng)、樹(shù)突形成和黑色素瘤相關(guān)細(xì)胞表面分子的表達(dá)受限。隨著黑素細(xì)胞的突變，惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖速度加快，且上皮鈣黏素的表達(dá)向神經(jīng)鈣黏素轉(zhuǎn)換。不同類型黏附分子間的表達(dá)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞與鄰近角質(zhì)形成細(xì)胞之間失去接觸，并與表達(dá)神經(jīng)鈣黏素的CAFs相結(jié)合，促使黑色素瘤細(xì)胞遠(yuǎn)離角質(zhì)形成細(xì)胞并侵入下方真皮，通過(guò)血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)遷移至遠(yuǎn)處組織，并建立轉(zhuǎn)移[3,5,18]。

除上皮鈣黏素和神經(jīng)鈣黏素外，其他的EMT標(biāo)志物(Snail1、Snail2、鋅指E盒結(jié)合蛋白1、鋅指E盒結(jié)合蛋白2、Twist和Claudin-1等)也在黑色素瘤的EMT過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)上調(diào)上皮標(biāo)志物(上皮鈣黏素)和下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物(鋅指E盒結(jié)合蛋白1和鋅指E盒結(jié)合蛋白2)顯示，CAFs失活后，黑色素瘤細(xì)胞中的EMT過(guò)程受阻[16]。細(xì)胞極性的喪失是EMT過(guò)程的關(guān)鍵，而緊密連接蛋白Claudin-1積極參與維持上皮細(xì)胞的頂端-基底極性，因此，CAFs失活后Claudin-1表達(dá)增加進(jìn)一步證明CAFs促進(jìn)了EMT過(guò)程。此外，阻斷CAFs中β聯(lián)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，黑色素瘤細(xì)胞中鋅指E盒結(jié)合蛋白1和Snail的表達(dá)下調(diào)，且與Claudin-1表達(dá)增加相關(guān)[16,19]?？梢?jiàn)，β聯(lián)蛋白不僅在CAFs促進(jìn)黑色素瘤生長(zhǎng)中十分關(guān)鍵，而且在EMT過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。

5 CAFs與黑色素瘤通過(guò)相互作用促進(jìn)腫瘤血管生成

黑色素瘤是高度血管化的腫瘤，因?yàn)镃AFs可通過(guò)分泌一些促血管生成因子作用于黑色素瘤，以促進(jìn)腫瘤血管生成，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2以及基質(zhì)金屬蛋白酶等蛋白水解酶[15,20]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2可與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散和遷移[15]。CAFs分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶13可通過(guò)釋放ECM中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤血管生成，從而增加鱗狀細(xì)胞癌或黑色素瘤的侵襲[21]；而CAFs分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶9是一種促血管生成的ECM重構(gòu)酶，能幫助重建ECM，以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)ECM構(gòu)成的結(jié)構(gòu)屏障[15]。

另一方面，黑色素瘤也通過(guò)旁分泌方式加強(qiáng)CAFs的促腫瘤血管生成作用。如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子可由CAFs表達(dá)，并在黑色素瘤中過(guò)表達(dá)，能誘導(dǎo)基質(zhì)和腫瘤中CAFs的活化，并進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮標(biāo)志物CD31/血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)水平升高，最終增加腫瘤血管的體積[22]。此外，黑色素瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR-155可以直接傳遞到成纖維細(xì)胞中，誘導(dǎo)CAFs的形成并抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子1的表達(dá)[15]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子1表達(dá)的抑制會(huì)導(dǎo)致Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路的激活以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的過(guò)度表達(dá)，觸發(fā)CAFs的促血管生成作用[15,23]。

6 CAFs誘導(dǎo)黑色素瘤轉(zhuǎn)移并參與轉(zhuǎn)移前龕的形成

活化的CAFs在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中不可或缺，是轉(zhuǎn)移病變形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。CAFs分泌的分泌型卷曲相關(guān)蛋白2能激活黑色素瘤細(xì)胞中的多步信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致β聯(lián)蛋白和小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的減少，最終使腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移增加[24]。同時(shí)，CAFs還可以通過(guò)影響原發(fā)腫瘤ECM的硬度增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲，并可能產(chǎn)生ECM軌跡，以指導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲[25-27]。

另外，在黑色素瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中，CAFs參與了轉(zhuǎn)移前龕的形成，并介導(dǎo)了轉(zhuǎn)移部位繼發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移前龕是可能發(fā)生腫瘤繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的部位所形成的微環(huán)境，主要由CAFs、浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組成。轉(zhuǎn)移前龕必須創(chuàng)造一個(gè)支持性微環(huán)境，以便經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)此處的惡性腫瘤細(xì)胞駐留、生長(zhǎng)和建立第二個(gè)腫瘤[28-30]。在黑色素瘤中，CAFs參與了轉(zhuǎn)移前龕的形成，并通過(guò)與腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移前龕中不同類型細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)各種促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程[31]。首先，黑色素瘤原發(fā)部位的CAFs可通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)移，直接或間接刺激遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移位點(diǎn)中黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[5,32]。對(duì)自發(fā)性黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型的研究顯示，成纖維細(xì)胞在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中被激活為CAFs：由轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞分泌的外泌體在肺成纖維細(xì)胞中激發(fā)肺成纖維細(xì)胞的活化，進(jìn)而引發(fā)CAFs促炎基因的表達(dá)，發(fā)揮促炎功能[31]。轉(zhuǎn)移到肝臟的黑色素瘤則依賴于肝星狀細(xì)胞(肝臟駐留成纖維細(xì)胞)激活形成CAFs來(lái)支持腫瘤血管的生成[33]。

7 小 結(jié)

黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)分泌各種化學(xué)因子、細(xì)胞外囊泡等誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞活化成為CAFs；同時(shí)，CAFs也反過(guò)來(lái)直接或間接地影響黑色素瘤的進(jìn)展，兩者之間的相互作用機(jī)制可以為黑色素瘤治療提供新思路：CAFs表達(dá)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子對(duì)于B-Raf激酶抑制性抵抗的黑色素瘤可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)；引發(fā)CAFs促血管生成啟動(dòng)的外泌體，miR-155可成為黑色素瘤抗血管生成療法的潛在靶標(biāo)；以黑色素瘤細(xì)胞和CAFs為共同目標(biāo)的組合治療有希望成為克服治療抗性的新策略。在黑色素瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡中，除miRNA外，其他組分對(duì)促進(jìn)CAFs形成的作用，以及CAFs在黑色素瘤免疫逃逸中發(fā)揮的作用，仍需要進(jìn)一步研究的證實(shí)。