覃文聘，高鵬，牛麗娜，焦凱

(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院黏膜病科，西安 710032)

異位礦化是指在肌肉、肌腱和韌帶等軟組織內(nèi)快速形成異位骨的疾病[1]，大多由創(chuàng)傷性因素引起，常發(fā)生在髖、肘及肩等關(guān)節(jié)周圍的囊外組織中，導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直或血管和神經(jīng)受壓，嚴(yán)重限制關(guān)節(jié)活動并引起運(yùn)動疼痛，從而影響患者生存質(zhì)量[2]。目前，異位礦化主要采取輻射預(yù)防和外科切除治療[3]，然而治療后復(fù)發(fā)率較高[4]。此外，上述治療也會導(dǎo)致關(guān)節(jié)運(yùn)動永久性受限、組織局部缺陷等并發(fā)癥。因此，需進(jìn)一步研究異位礦化的發(fā)生機(jī)制，以達(dá)到優(yōu)化預(yù)防及治療的目的。以往研究顯示，多種發(fā)病機(jī)制參與了異位礦化的發(fā)生，如軟組織損傷導(dǎo)致的反復(fù)出血機(jī)化、局部微循環(huán)缺氧、遺傳因素及神經(jīng)調(diào)節(jié)異常等[5]。研究表明，骨基質(zhì)損傷后釋放的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有誘導(dǎo)異位礦化的能力，損傷區(qū)BMP-2可促進(jìn)感覺神經(jīng)分泌P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)等感覺神經(jīng)肽，這些感覺神經(jīng)肽的釋放導(dǎo)致活化的血小板、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集到損傷部位，最終啟動軟骨成骨過程；另外，活化的血小板、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等的功能也與神經(jīng)的重構(gòu)有關(guān)[5]?，F(xiàn)就外周神經(jīng)促進(jìn)創(chuàng)傷后組織異位礦化的研究進(jìn)展予以綜述。

1 神經(jīng)炎癥的作用

神經(jīng)炎癥機(jī)制在誘發(fā)異位成骨中的關(guān)鍵作用已被證明[2,6]。神經(jīng)炎癥是由感覺神經(jīng)釋放感覺神經(jīng)肽(P物質(zhì)[7]和CGRP[8])介導(dǎo)，并作用于周圍的靶細(xì)胞(如肥大細(xì)胞)而產(chǎn)生的炎癥級聯(lián)。BMP-2常在創(chuàng)傷后釋放入血，其已被證明能直接誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元釋放神經(jīng)炎癥相關(guān)蛋白P物質(zhì)和CGRP等，并能誘導(dǎo)新生血管[9]。Salisbury等[10]利用腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達(dá)細(xì)胞建立小鼠異位礦化模型，在病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24 h開始，每間隔一天從組織中分離出蛋白，通過酶聯(lián)免疫吸附測定對組織內(nèi)P物質(zhì)和CGRP進(jìn)行定量檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平在誘導(dǎo)異位礦化后24 h內(nèi)明顯升高，在誘導(dǎo)后72 h和6 d再次升高。另有體外研究顯示，在加入重組BMP-2后，感覺神經(jīng)元培養(yǎng)基中的P物質(zhì)和CGRP水平快速升高[11]。為了進(jìn)一步證明P物質(zhì)在誘導(dǎo)異位礦化中的作用，Kan等[12]用P物質(zhì)受體——神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑RP-67580和對照溶劑磷酸鹽緩沖液分別處理Nse-BMP-4異位礦化模型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RP-67580處理組的異位礦化誘導(dǎo)率顯著低于對照組，表明P物質(zhì)對于誘導(dǎo)異位礦化具有重要作用。由于感覺神經(jīng)元末梢均有瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，TRPV1作為一種受到多種微環(huán)境因素刺激后釋放疼痛調(diào)節(jié)劑的疼痛離子通道，在異位礦化中起作用。Salisbury等[10]以TRPV1敲除小鼠及野生小鼠為研究對象，建立BMP-2誘導(dǎo)的異位礦化模型。結(jié)果顯示，與野生小鼠相比，TRPV1敲除小鼠異位骨形成量減少，且由BMP-2介導(dǎo)的P物質(zhì)和CGRP增加也顯著受到抑制，表明BMP-2能通過激活感覺神經(jīng)TRPV1，促進(jìn)其釋放P物質(zhì)和CGRP，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生，從而促進(jìn)異位礦化[10]。

在神經(jīng)炎癥過程中釋放的P物質(zhì)和CGRP兩種感覺神經(jīng)肽，已被證明能分別招募肥大細(xì)胞定位于周圍神經(jīng)和促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒[13]。Salisbury等[10]分別使用肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑色甘酸和對照試劑磷酸鹽緩沖液對小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，再采用BMP-2誘導(dǎo)異位礦化，10 d后對兩組的新生骨進(jìn)行量化比較，結(jié)果顯示，色甘酸處理小鼠的異位成骨體積較對照小鼠顯著減小，表明肥大細(xì)胞脫顆粒在誘導(dǎo)異位礦化發(fā)生中具有重要作用。肥大細(xì)胞脫顆粒后釋放多種降解酶，包括乳糜酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶等，促進(jìn)了包括神經(jīng)在內(nèi)的多種類型的組織重構(gòu)。此外，許多神經(jīng)末梢均有各種肥大細(xì)胞釋放的蛋白受體，在肥大細(xì)胞脫顆粒后被激活，進(jìn)一步促進(jìn)P物質(zhì)和CGRP的釋放，構(gòu)成一個促進(jìn)神經(jīng)炎癥的正反饋環(huán)路[5]。另外，肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的血清素(5-羥色胺)與骨重建有密切聯(lián)系[14]。血清素與其受體的結(jié)合會導(dǎo)致去甲腎上腺素的釋放，去甲腎上腺素可激活β腎上腺素能受體信號通路并促進(jìn)棕色脂肪組織在神經(jīng)周圍的迅速發(fā)生，從而進(jìn)一步促進(jìn)骨生成[15]。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)的明膠酶，其被證明與神經(jīng)炎癥和血神經(jīng)屏障的開放有關(guān)[13]。Rodenberg等[16]在BMP誘導(dǎo)異位礦化的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后48 h內(nèi)異位礦化部位的神經(jīng)血管周圍MMP-9高表達(dá)，7 d后微計(jì)算機(jī)斷層成像檢測到MMP-9定位的異位礦化形成部位，說明MMP-9在異位礦化形成中十分重要。Suehiro等[17]分別于傷后即刻與傷后1 d測定7例腦創(chuàng)傷患者全身動脈和頸內(nèi)靜脈血中的MMP-9和白細(xì)胞介素-6水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頸內(nèi)靜脈中的MMP-9和白細(xì)胞介素-6水平與腦外傷炎癥嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。Hackel等[18]運(yùn)用高滲鹽水處理大鼠，使MMP-9的非催化性血栓素結(jié)構(gòu)域與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1結(jié)合，觸發(fā)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化，誘導(dǎo)形成血神經(jīng)屏障的緊密連接蛋白claudin-1下調(diào)，提示MMP-9與血神經(jīng)屏障開放有關(guān)。Davis等[19]建立了腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)異位礦化的大鼠和小鼠模型并進(jìn)行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9無論在大鼠還是小鼠的異位礦化部位48 h內(nèi)均有較高的表達(dá)，但在小鼠體內(nèi)，MMP-9被激活，而在大鼠體內(nèi)，MMP-9未被激活。同時(shí)，該研究在骨骼遠(yuǎn)端直接將腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達(dá)細(xì)胞注入肌肉中，小鼠體內(nèi)會出現(xiàn)異位礦化而大鼠體內(nèi)不會出現(xiàn)。上述結(jié)果提示，MMP-9的激活對異位礦化至關(guān)重要。

可見，組織創(chuàng)傷導(dǎo)致局部BMP的大量釋放，其可直接促進(jìn)感覺神經(jīng)肽釋放，導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒和神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放，從而促進(jìn)局部神經(jīng)炎癥發(fā)生，同時(shí)通過促進(jìn)MMP-9的表達(dá)開放血神經(jīng)屏障。

2 神經(jīng)干細(xì)胞的作用

在異位礦化的形成過程中，關(guān)于骨祖細(xì)胞的來源有多種說法，包括來源于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞[20]、肌肉纖維之間的間質(zhì)細(xì)胞[21]、經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞[22]等。Lazard等[23]通過給小鼠肌內(nèi)注射腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)異位礦化，然后通過免疫組織化學(xué)方法追溯骨祖細(xì)胞來源，并用熒光激活細(xì)胞分類和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對其進(jìn)行定量和進(jìn)一步表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)存在于外周神經(jīng)內(nèi)膜的claudin-5陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，又稱SP7，一種成骨標(biāo)志物)抗體、血小板源性生長因子受體(參與神經(jīng)膠質(zhì)-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的神經(jīng)干或祖細(xì)胞標(biāo)志物)、musashi家族蛋白(一種在完全分化的細(xì)胞中不表達(dá)，但對神經(jīng)干細(xì)胞具有高度特異性的RNA結(jié)合蛋白)和酪氨酸激酶受體2(內(nèi)皮標(biāo)志物)；48 h后這些細(xì)胞在神經(jīng)內(nèi)消失，隨后出現(xiàn)在血液和新骨形成處，證明骨祖細(xì)胞來源于周圍神經(jīng)內(nèi)膜的祖細(xì)胞。Olmsted-Davis等[24]通過建立三苯氧胺調(diào)控的Wnt1-Cre重組酶與td番茄紅(Tomato red，TR)受體基因雜交的譜系追蹤小鼠，即一種由三苯氧胺調(diào)控的TR系追蹤小鼠來追蹤細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)膜起源，同時(shí)使用抗體PS(phosphoSmad)1、 5和8檢測對BMP-2有反應(yīng)的細(xì)胞。在運(yùn)用腺病毒轉(zhuǎn)染的BMP-2過表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)異位礦化模型中觀察到，少量的PS陽性細(xì)胞存在神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)；在周圍神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)表達(dá)成骨細(xì)胞的特異性因子——SP7陽性細(xì)胞，在空腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的周圍神經(jīng)中未觀察到SP7陽性細(xì)胞；且觀測到SP7、Dlx5(一種成骨細(xì)胞特異性因子)和PS在Wnt1+(TR+)細(xì)胞中表達(dá)。另外，Olmsted-Davis等[24]還對異位礦化患者標(biāo)本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)異位礦化部位附近的神經(jīng)內(nèi)膜含有大量的PS陽性細(xì)胞，異位礦化患者的神經(jīng)和骨組織中均存在SP7陽性細(xì)胞。上述結(jié)果表明，異位礦化的祖細(xì)胞來源于神經(jīng)內(nèi)膜。

骨祖細(xì)胞在發(fā)生后如何到達(dá)新骨形成部位并最終發(fā)揮作用引起了科研工作者的廣泛興趣。骨祖細(xì)胞要離開神經(jīng)就必須穿過血神經(jīng)屏障，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的祖細(xì)胞表面表達(dá)緊密連接分子claudin-5，但卻不參與構(gòu)成任何緊密連接結(jié)構(gòu)，推測claudin-5的表達(dá)很可能為其穿過血神經(jīng)屏障提供了一種方式[23]。祖細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)后會在幾秒鐘之內(nèi)遍布全身，研究證實(shí)在機(jī)體受到創(chuàng)傷后，血液循環(huán)中會很快出現(xiàn)神經(jīng)來源的骨祖細(xì)胞[13,25]。骨祖細(xì)胞最終定位在新骨形成部位，從循環(huán)滲出到特定部位的過程要通過一種特殊分化的血管，這些血管被鑒定為H血管，其特征為標(biāo)志物CD31和內(nèi)皮黏蛋白的高表達(dá)[26]。Ramasamy等[27]研究發(fā)現(xiàn)，骨祖細(xì)胞選擇性地定位在H型毛細(xì)血管附近，但在骨干L型毛細(xì)血管(表達(dá)較低水平的CD31和內(nèi)皮黏蛋白)周圍不存在，進(jìn)一步證實(shí)了H血管在骨祖細(xì)胞到達(dá)新骨形成部位的重要作用。

3 外周神經(jīng)對棕色脂肪組織的調(diào)節(jié)作用

在BMP-2誘導(dǎo)的異位礦化模型中，神經(jīng)、血管和肌肉等軟組織也發(fā)生了一系列變化，其中棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)的出現(xiàn)是最早變化之一[5]。BAT是一種由冷暴露引起的獨(dú)特脂肪組織，其特征為表達(dá)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)和血管內(nèi)皮生長因子。與電子傳遞鏈中的標(biāo)準(zhǔn)ATP酶不同，UCP1能將ATP酶從電子傳遞鏈復(fù)合物中解離出來，使用于ATP合成的能量會以熱能的形式釋放。周圍神經(jīng)中的小直徑傳入神經(jīng)對熱刺激做出反應(yīng)，誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并最終促進(jìn)神經(jīng)炎癥發(fā)生[14]。此外，UCP1具有非常高的催化效率，能迅速消耗氧氣，加之局部熱量產(chǎn)生導(dǎo)致微環(huán)境中氧氣的溶解度下降，最終造成細(xì)胞缺氧，從而有效促進(jìn)了形成軟骨凝結(jié)[28]。同時(shí)缺氧的BAT會激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α通路，上調(diào)BMP、血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)纖毛蛋白-1等的表達(dá)[29-30]，促進(jìn)成骨與成血管在異位礦化過程中的耦合[31]。

與異位礦化關(guān)系密切的棕色脂肪細(xì)胞不同于正常生理狀態(tài)下的棕色脂肪細(xì)胞，它們是短暫存在的，且來源于神經(jīng)。Salisbury等[32]對患者的異位礦化病理組織進(jìn)行檢測也發(fā)現(xiàn)，異位礦化中的棕色脂肪細(xì)胞表達(dá)UCP1，且表達(dá)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α，但對正常棕色脂肪細(xì)胞的特征性標(biāo)記CD137、TBX1(T-Box 1)、HOXC9(homeobox C9)的檢測為陰性，同時(shí)也缺乏關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PRDM16(PR domain-containing protein 16)的表達(dá)。這些結(jié)果表明，異位礦化組織內(nèi)的棕色脂肪細(xì)胞與機(jī)體本身的棕色脂肪細(xì)胞起源不同。在用三苯氧胺調(diào)控的TR系追蹤小鼠來追蹤細(xì)胞起源的實(shí)驗(yàn)中，Lazard等[23]采用BMP-2誘導(dǎo)異位礦化的小鼠模型進(jìn)行研究，在誘導(dǎo)異位礦化5 d后，對組織進(jìn)行免疫染色，證實(shí)大部分UCP陽性細(xì)胞同時(shí)TR陽性，提示棕色脂肪細(xì)胞可能來自神經(jīng)內(nèi)膜細(xì)胞。Salisbury等[15]采用BMP-2誘導(dǎo)異位礦化的小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在BMP-2處理2 d后，坐骨神經(jīng)內(nèi)存在β3腎上腺素能受體陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞也表達(dá)神經(jīng)遷移標(biāo)志物CD75；在處理4 d后，坐骨神經(jīng)內(nèi)的β3腎上腺素能受體陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，同時(shí)在周圍的軟組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了β3腎上腺素能受體陽性UCP1陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)神經(jīng)引導(dǎo)因子顫蛋白；在阻斷肥大細(xì)胞脫粒誘導(dǎo)的神經(jīng)重構(gòu)后，UCP1特異性RNA和蛋白表達(dá)完全消失，說明棕色脂肪細(xì)胞不僅起源于神經(jīng)，且受神經(jīng)炎癥調(diào)控。Salisbury等[5]認(rèn)為，肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的血清素會刺激損傷部位的交感神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)一步影響B(tài)AT的生成。另有研究發(fā)現(xiàn)，BAT的產(chǎn)生受交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[5]。Lowell和Spiegelman[33]將交感神經(jīng)在冷暴露或藥物刺激下對BAT的影響歸納為急性和慢性，UCP-1活性在幾秒鐘內(nèi)增加，而UCP-1蛋白的增加、線粒體的生物發(fā)生及BAT的增生和肥大發(fā)生在數(shù)小時(shí)或數(shù)天之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在犬和靈長類動物中使用β3腎上腺素能受體激動劑可以增加BAT含量[33]；臨床研究發(fā)現(xiàn)，嗜鉻細(xì)胞瘤成年患者體內(nèi)存在更多的棕色脂肪沉積，這些結(jié)果支持交感神經(jīng)在BAT的誘導(dǎo)、發(fā)生過程起重要作用[33]。

4 小 結(jié)

創(chuàng)傷后組織異位礦化的過程與外周神經(jīng)密切相關(guān)，主要包括神經(jīng)炎癥的作用、神經(jīng)干細(xì)胞的作用和神經(jīng)對棕色脂肪細(xì)胞的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致血神經(jīng)屏障開放、骨祖細(xì)胞遷移至新骨形成部位和BAT造成周圍低氧環(huán)境并促進(jìn)新生血管長入。雖然異位礦化被認(rèn)為是一個異常的病理性礦化過程，但事實(shí)上其可能反映周圍神經(jīng)系統(tǒng)維持正常骨結(jié)構(gòu)和功能的重要生理機(jī)制。生理狀態(tài)下，周圍神經(jīng)系統(tǒng)將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)以調(diào)節(jié)正常骨骼的日常重構(gòu)；病理狀態(tài)下，BMP的釋放刺激感覺神經(jīng)，啟動了一個超過正常水平的骨和軟組織再生程序，可能導(dǎo)致不正確的部位出現(xiàn)骨質(zhì)沉積，即形成異位礦化。因此，通過靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、神經(jīng)干細(xì)胞和棕色脂肪細(xì)胞的作用可能成為臨床阻斷創(chuàng)傷后組織異位礦化的重要策略；此外，對異位礦化相關(guān)形成機(jī)制的研究亦可為牙、骨等硬組織缺損的治療提供參考。