楊雷鵬 郭京波

摘 要：以鮮姜汁為原料，經(jīng)酵母W.anomalus J12-7發(fā)酵，研究其對(duì)生姜抗氧化活性的影響。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇姜汁添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為自變量，以抗氧化活性的響應(yīng)值，采用Box-Behnken Design響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝，確立最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加381μL鮮姜汁，接種1%種子液，28.7℃溫度下培養(yǎng)60h，發(fā)酵后姜汁總抗氧化活性較發(fā)酵前提高約63.67%。據(jù)此，為開(kāi)發(fā)高附加值鮮姜產(chǎn)品提供新思路。

關(guān)鍵詞：鮮姜汁;發(fā)酵;抗氧化活性;響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：TB ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2020.04.093

生姜，是姜屬植物姜（Zinggiber Ofcinale Rosc）的根莖。在日常生活中，主要作為一種常見(jiàn)的香辛料被廣泛使用。生姜中含有多種生物化學(xué)成分，包括揮發(fā)性的姜精油以及具有刺激性氣味的姜酚、姜辣素、姜酮等，具有抗氧化、清除人體內(nèi)自由基，降血糖、降低膽固醇、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗過(guò)敏等功效。鮮姜汁是無(wú)硫鮮姜去皮洗凈后，研磨過(guò)濾而得到的金黃色半透明液體，有濃郁姜香味，充分保留生姜中的活性物質(zhì)和獨(dú)特氣味，是天然的食品添加劑和防腐劑。但是由于鮮姜汁自身特有的姜辣味，加上鮮姜汁中高生物活性成分相對(duì)較少，難以富集和提取，限制了鮮姜汁的市場(chǎng)應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于生姜的研究，主要集中在提高生姜中高生物活性成分含量等的方面，通過(guò)一系列物理、化學(xué)等的實(shí)驗(yàn)步驟，將生姜中低生物活性成分的物質(zhì)（如姜酚）轉(zhuǎn)化為高生物活性物質(zhì)（如姜烯酚），轉(zhuǎn)化效率較低，且成本高昂，而通過(guò)微生物發(fā)酵的方式提高生姜生物活性的相關(guān)研究目前仍處在起步階段，對(duì)于其研究相對(duì)較少。

酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種之一，可以利用不同原料，在不同發(fā)酵條件下通過(guò)自身代謝合成人們生產(chǎn)生活所需的各種產(chǎn)物，如酒精、L-乳酸、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶等，以及一些具有特殊功能的次生代謝產(chǎn)物，如異低聚麥芽糖等。近些年來(lái)，隨著人們對(duì)于微生物研究的持續(xù)深入，酵母菌作為工程菌，有望在未來(lái)在不斷拓展到化工、環(huán)保等其他領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)以鮮姜汁為底物進(jìn)行酵母發(fā)酵，通過(guò)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以酵母發(fā)酵鮮姜汁總抗氧化活性為指標(biāo)，分析酵母發(fā)酵對(duì)于鮮姜汁抗氧化活性的影響，為高抗氧化活性鮮姜汁的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)以及天然生姜資源的利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

酵母菌株：W.anomalus J7-2，山西師范大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏;無(wú)硫生姜：購(gòu)于臨汾市堯都區(qū)堯豐市場(chǎng)。

試劑：PDA培養(yǎng)基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;DPPH，ABTS，TPTZ、水溶性維生素E，北京伊諾凱科技有限公司;甲醇，冰醋酸，水合乙酸鈉，過(guò)硫酸鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;FeCl3·6H2O，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。（以上所有試劑，無(wú)特別說(shuō)明外，均為分析純）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電子天平，上海精科;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，上海博訊;HPX-9272 MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海一恒;5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)基因有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮮姜汁制備

取適量無(wú)硫鮮姜，去皮洗凈，晾干后切成小塊，混入少量石英砂，用研缽研磨成汁，400目紗布過(guò)濾后即得到生姜原液。將生姜原液與水按照1∶4比例進(jìn)行稀釋，攪拌混勻后，將鮮姜汁置于冰箱中，4℃冷藏，備用。

1.2.2 酵母菌種活化及種子液制備

取上述W.anomalus J7-2酵母菌株，將其接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)48h，將新活化的酵母菌株恒溫培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，控制OD600吸光值約為0.8±0.01。

1.2.3 發(fā)酵預(yù)處理

在20mL的PDA液體培養(yǎng)基中，接種1%酵母菌種子液，添加不同量的鮮姜汁（1：4）作為發(fā)酵底物，28℃恒溫培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液移入離心管中，殘?jiān)?mL蒸餾水洗滌后移入離心管，6000r/min離心20min后取出，用醫(yī)用注射器吸取上清液各2mL，用蒸餾水定容至10mL，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè);以PDA液體培養(yǎng)基中添加與實(shí)驗(yàn)組相對(duì)應(yīng)的鮮姜汁量作為空白對(duì)照。

1.2.4 酵母發(fā)酵鮮姜汁的單因素試驗(yàn)

在20mLPDA中添加適量鮮姜汁，接入1%酵母種子液，選擇姜汁添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。采用控制變量法，固定發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為60h，向培養(yǎng)基分別添加不同量鮮姜汁，與酵母共發(fā)酵后測(cè)定總抗氧化活性（Total Antioxidant Capacity， TAC）;固定鮮姜汁添加量為360μL，發(fā)酵時(shí)間為60h，測(cè)定培養(yǎng)基分別在不同溫度梯度下發(fā)酵后的總抗氧化活性;固定姜汁添加量360μL，發(fā)酵溫度確定為30℃，測(cè)定培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時(shí)間下的總抗氧化活性。

1.2.5 酵母發(fā)酵鮮姜汁的響應(yīng)面分析

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇姜汁添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間三者為自變量，發(fā)酵后姜汁的總抗氧化活性為響應(yīng)值，使用Design-Export10.0軟件中Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化方案設(shè)計(jì)，利用方差分析（ANOVA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的模型擬合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算最高抗氧化活性及對(duì)應(yīng)相關(guān)因素的最佳水平。

1.2.6 酵母發(fā)酵鮮姜汁的抗氧化活性評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定發(fā)酵后培養(yǎng)液的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及Fe3+還原能力（FRAP），計(jì)算總抗氧化活性（TAC），單位為μmol TE/g Ginger juice。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 姜汁添加量對(duì)抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養(yǎng)基中分別添加200μL、220μL、240μL、260μL、280μL、300μL、320μL、340μL、360μL、380μL、400μL鮮姜汁，接種1%種子液，28℃下發(fā)酵48h后測(cè)定總抗氧化活性。結(jié)果表明，在220-300μL姜汁添加量范圍內(nèi)，隨著姜汁添加量的增加，總抗氧化活性無(wú)明顯變化;在320-360μL范圍內(nèi)總抗氧化活性隨著姜汁添加量的增加而增加，在添加量為360μL時(shí)達(dá)到最大值，為3340.95±169.05μmol TE /g Ginger juice;當(dāng)添加量大于360μL時(shí)，總抗氧化活性開(kāi)始下降，可能是由于姜汁添加量過(guò)多，酵母生長(zhǎng)受到抑制，從而抗氧化活性降低。因此選擇360μL姜汁添加量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加360μL鮮姜汁，接種1%種子液，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃溫度下培養(yǎng)48h后測(cè)定總抗氧化活性。測(cè)試結(jié)果表明，隨著溫度的升高，姜汁的抗氧化活性逐漸增強(qiáng);當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，姜汁抗氧化活性最強(qiáng)，達(dá)到4759.72±237.99μmol TE /g Ginger juice;當(dāng)溫度高于30℃后，姜汁抗氧化活性明顯下降，說(shuō)明該溫度下酵母代謝受到抑制，導(dǎo)致總抗氧化活性下降。因此選擇30℃作為發(fā)酵溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加360μL鮮姜汁，接種1%種子液， 30℃溫度下分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后測(cè)定總抗氧化活性。結(jié)果表明，在姜汁添加量為360μL，30℃培養(yǎng)時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，姜汁總抗氧化活性不斷增加;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60h時(shí)，姜汁總抗氧化活性最高，達(dá)到3530.52±176.53μmol TE /g Ginger juice;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)60h后，總抗氧化活性變化不大，原因可能是由于酵母在發(fā)酵到60h之后，酵母總體生長(zhǎng)平緩，并開(kāi)始進(jìn)行酒精發(fā)酵。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為60h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 W.anomalus J12-7發(fā)酵鮮姜汁響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇姜汁添加量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3），利用Box-Behnken Design進(jìn)行三水平三因素的響應(yīng)面優(yōu)化方案設(shè)計(jì)，即將上述17組實(shí)驗(yàn)的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果輸入到Design-Export軟件中，進(jìn)行回歸方程模型的建立，經(jīng)過(guò)分析后認(rèn)為，該實(shí)驗(yàn)的回歸方程模型為：TAC=4004.95+110.61X1-99.94X2+63.84X3+68.81X1X2+106.24X1X3-40.97X1X3-1111.40X12-371.63X22-136.80X32。該回歸方程表示過(guò)W.anomalus J12-7發(fā)酵后，鮮姜汁總氧化活性（TAC）與三個(gè)自變量之間所存在的函數(shù)關(guān)系。

對(duì)該優(yōu)化試驗(yàn)方案進(jìn)行方差分析后認(rèn)為，該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型的回歸效應(yīng)極顯著（P<0.01），回歸方程置信度高達(dá)99.9%;失擬項(xiàng)不顯著（P=0.0751>0.05），表明模型擬合程度較好;復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9895，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與該模型符合程度較高;AdjR2=0.9760，表明模型可以用來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

根據(jù)模型所給出的理論最優(yōu)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將優(yōu)化后測(cè)得的結(jié)果與優(yōu)化前所測(cè)抗氧化活性最高組進(jìn)行比較，得出W.anomalus J12-7發(fā)酵鮮姜汁的最優(yōu)工藝參數(shù)為：姜汁添加量381μL、發(fā)酵溫度28.7℃、發(fā)酵時(shí)間為60h，總抗氧化活性為4324.27±216.21μmol TE /g Ginger juice。

3 結(jié)論

本文主要通過(guò)W.anomalus J12-7酵母菌發(fā)酵鮮姜汁，測(cè)定發(fā)酵后姜汁的抗氧化活性;通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化確定W.anomalus J12-7的最佳發(fā)酵條件為：20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加381μL鮮姜汁，接種1%種子液，28.7℃溫度下培養(yǎng)60h，發(fā)酵后的姜汁總抗氧化活性較發(fā)酵前提高約63.67%。結(jié)果表明，W.anomalus J12-7可以有效提升鮮姜汁的抗氧化活性，改善發(fā)酵風(fēng)味，在食品工業(yè)中，可用于生產(chǎn)具有高抗氧化活性的生姜保健黃酒及其一系列高附加值產(chǎn)品。

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