樊明明，呂玉金，吳玉臣

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450046）

雞球蟲病是一種原蟲病，由艾美耳科艾美耳屬的球蟲寄生在雞的腸道上皮細(xì)胞內(nèi)引起，是養(yǎng)雞業(yè)中十分常見且危害極嚴(yán)重的疾病之一。全球每年因球蟲病帶來(lái)的損失高達(dá)15～20億美元[1]。其中，美國(guó)每年的經(jīng)濟(jì)損失為6.4億美元[2]。而我國(guó)每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)25億元人民幣[18]。在研制及球蟲疫苗之前，應(yīng)首先熟悉雞球蟲不同階段抗原的免疫原性，才能將球蟲的保護(hù)性抗原編碼基因片段克隆到表達(dá)載體，進(jìn)而研制出免疫效果顯著的新型疫苗。

1 雞球蟲抗原的研究

1.1 無(wú)性生殖階段抗原

1.1.1 微線蛋白

研究發(fā)現(xiàn)，微線蛋白約有20種，目前有5種被報(bào)道，RT-PCR分析顯示，在孢子化6h后EtMIC-3、4、5出現(xiàn)，而在孢子化12h后EtMIC-1、2才能被檢出。EtMIC-1是一種糖蛋白G相關(guān)蛋白，分子量10～11萬(wàn)，在巨型艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)了一種和Et-MICI-1相似的蛋白，與其有高度序列同源性。Et-MIC-2為分子量50ku的微線蛋白，研究表明[3]，其主要參與溶膜入侵過程。EtMIC-3主要對(duì)子孢子入侵培養(yǎng)細(xì)胞有抑制作用。EtMIC-4的分子量為21.8萬(wàn)，其免疫原性有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于EtMIC-5免疫原性相關(guān)報(bào)道還未見到，據(jù)推測(cè)其編碼蛋白約100ku大小。此外，Tomley克隆了EtMICI(Et100)，其與禽類各種球蟲的同源性都很高，且有與灰色血栓形成蛋白、備解素等相似的基因序列，說明其既與入侵有關(guān)，還可能和裂殖子的運(yùn)動(dòng)及逸出相關(guān)。

1.1.2 折光體蛋白

球蟲在子孢子階段和第一代裂殖體階段均含有折光體，SO7是被報(bào)道較早的一種折光體蛋白，其分子質(zhì)量為26ku。CheY.SO7是一種重組抗原，其分子質(zhì)量為36ku。研究發(fā)現(xiàn)，其在構(gòu)型上表現(xiàn)為天然抗原的B細(xì)胞表位存在缺失或部分缺失，這也直接導(dǎo)致了其免疫原性主要來(lái)自細(xì)胞免疫。此外，重組抗原CheY.SO7能夠誘發(fā)抗多種球蟲感染的交叉保護(hù)反應(yīng)[4～5]，這一結(jié)果通過用兔抗CheY.SO7血清免疫7種主要雞球蟲的孢子化卵囊得到了充分的證實(shí)，因?yàn)樗鼈兌己邢鄳?yīng)的免疫優(yōu)勢(shì)多肽。

1.1.3 熱休克蛋白

熱休克蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或線粒體內(nèi)，能夠參與蛋白質(zhì)的生物合成、折疊和分泌，同時(shí)還可以與新生成的尚未折疊的前體蛋白相粘附，促進(jìn)相應(yīng)蛋白質(zhì)在基質(zhì)中的移動(dòng)和折疊。Hsp的分子量為7萬(wàn)，是E.maxima子孢子階段的抗原，免疫原性良好，能夠顯著刺激E.maxima感染雞T淋巴細(xì)胞的增殖，是宿主抗體和T淋巴細(xì)胞的靶目標(biāo)。EaHsp也是E.acervulina的熱休克蛋白之一，與Hsp70具有一定的同源性。

1.1.4 表面抗原

有子孢子表面抗原和裂殖子表面抗原。子孢子表面抗原目前已知的有Wisher等鑒定的125I標(biāo)記的表面抗原和35S-蛋氨酸標(biāo)記和未標(biāo)記的細(xì)胞漿和內(nèi)膜成分，主要抗原成分有32～45個(gè)，分子質(zhì)量9～33ku不等，其中15%的抗原具有免疫原性。TA4是E.tenella子孢子的表面糖蛋白，其生成過程起始于亂囊開始孢子化的16～20h，可能與蟲體侵入宿主細(xì)胞有關(guān)。xMzp5-7是E.tenella是一種表面蛋白，分子量為33ku，主要作用是能夠激活球蟲感染期的免疫應(yīng)答反應(yīng)，不僅可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，還可以被宿主自然感染后恢復(fù)期的血清識(shí)別，3-1E是E.acervulina的表面抗原，由170個(gè)氨基酸組成，在子孢子與裂殖子生殖階段都存在，長(zhǎng)度1086 bp，有一個(gè)閱讀框；重組的3-1E蛋白也可以介導(dǎo)細(xì)胞免疫，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)IFN-γλ的生成。

1.2 有性生殖階段抗原

有性生殖階段抗原包括未孢子化卵囊抗原、配子體和合子。GAM56、GAM82和GAM230是分子質(zhì)量分別為56ku、82ku和230ku的E.maxima配子體特異性蛋白。它們能夠抑制E.maxima的發(fā)育，也可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其中GAM56和GAM82還參與卵囊壁的形成，但是只在大配子表達(dá)。

1.3 新發(fā)現(xiàn)抗原

1.3.1 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（LDH）是E.acervulina蛋白，分子質(zhì)量為37ku，也可同時(shí)在E.tenella和E.maxima表達(dá)，但這3種艾美耳球蟲的LDH相似性只有66%～80%，表明其具有遺傳多樣性。LDH是只能在細(xì)胞內(nèi)合成的一種蛋白，該蛋白在球蟲的卵囊、子孢子、裂殖體、裂殖子時(shí)期都有相似的表達(dá)。

1.3.2 EmTFP250

EmTFP250是E.maxima無(wú)性繁殖階段的大分子蛋白，宿主免疫后，其后代會(huì)產(chǎn)生明顯的對(duì)球蟲保護(hù)作用。Wit combe等研究發(fā)現(xiàn)，EmTFP250和E.tenella的EMIC4有71%的同源性。并且至少有4種艾美耳球蟲中都含有EmTFP250基因，這提示了該抗原潛在的交叉免疫作用。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EmTFP250有很好的免疫原性。

2 球蟲疫苗及其免疫效果

2.1 球蟲活疫苗

球蟲活疫苗能夠替代抗球蟲藥物控制球蟲病[6]。它的作用機(jī)理主要是通過低水平的感染，使雞對(duì)再感染產(chǎn)生一定程度的抵抗力，進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)性免疫力。

2.1.1 球蟲活疫苗的分類

目前已報(bào)道的球蟲活疫苗有強(qiáng)毒和弱毒卵囊苗[7]。目前報(bào)道使用的有Coccivac疫苗（美國(guó)）、nmucox疫苗（加拿大）以及離子載體類耐藥菌株的強(qiáng)毒疫苗；而Paracox疫苗（英國(guó)）和Livacox疫苗（捷克）則屬于弱毒苗。近年來(lái)，陸續(xù)有些學(xué)者嘗試選育耐藥的弱毒株[8]，在1995年，索勛等人首次提出球蟲晚熟系概念，以期為球蟲病免疫預(yù)防提供新蟲系，為研究球蟲生活史調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考材料[9]。

2.1.2 球蟲活疫苗的免疫效果

2.1.2.1 強(qiáng)毒苗的免疫效果。Edgar是一種強(qiáng)毒苗，內(nèi)含8種雞球蟲的混合孢子化卵囊，主要通過飲水或拌料給4～10日齡雞接種，這種混合孢子化卵囊也就是世界上最早的商品化的球蟲疫苗。這種疫苗的接種方式為投服，投服時(shí)間上可以是每天、也可以是一次性，還可以按周投服但劑量上需要把握，不同的方式和劑量，所獲得的免疫力效果也有差別，且不易把握，這也是強(qiáng)毒苗的主要缺點(diǎn)。

2.1.2.2 弱毒苗的免疫效果。隨著發(fā)展，學(xué)者們開始研究致弱蟲苗即弱毒活苗。通常由野外分離的強(qiáng)毒株進(jìn)行致弱后的弱毒蟲株研制而成，能保證良好的免疫原性，有降低了致病力，不會(huì)對(duì)腸道造成嚴(yán)重的損傷，但是制作過程較為繁瑣。德國(guó)，英國(guó)，荷蘭，意大利等地對(duì)早熟株免疫進(jìn)行了田間試驗(yàn)，效果比強(qiáng)毒株令人滿意；中熟株疫苗試驗(yàn)[10]結(jié)果表明：其免疫效果受溫度、濕度的影響較大，6周齡的雞免疫時(shí)，保持溫度20℃～28℃，墊料濕度25%～30%時(shí)免疫效果良好，其球蟲病死亡率為0.01%～0.34%，總死亡率也低于2.5%，免疫后不使用抗球蟲藥，到24周齡時(shí)，雞的成活率達(dá)93%以上；晚熟株疫苗有較好的穩(wěn)定性；混合株球蟲疫苗滴服免疫效果更佳，基本上能夠達(dá)到100%的保護(hù)效果，對(duì)小雞的生長(zhǎng)保護(hù)也也有一定的效果。

2.2 基因工程苗及其免疫效果

弱毒疫苗相對(duì)比較安全，但制作過程繁瑣不易，而強(qiáng)毒疫苗在使用時(shí)存在有一定的風(fēng)險(xiǎn)，劑量難控制，對(duì)使用技術(shù)要求較高。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)將抗原蛋白的基因插入動(dòng)物基因組中，可以構(gòu)建基因工程疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫，從而獲得抗原蛋白，可以克服傳統(tǒng)疫苗制作繁瑣和毒力不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。

以色列雅貝克公司從巨型艾美耳球蟲的配子體中分離而得的亞單位疫苗CoxAbic，含有3種主要抗原，分子質(zhì)量分別為230ku，82ku，56ku。其可以通過肌肉注射的方式，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體進(jìn)入卵黃，進(jìn)而孵化后對(duì)雛雞的感染產(chǎn)生被動(dòng)保護(hù)[12]。這也進(jìn)一步說明如果配子(母)細(xì)胞抗原作為母源免疫在雞球蟲病控制中有價(jià)值，那么用以載體構(gòu)建的裸DNA疫苗來(lái)免疫產(chǎn)蛋雞將有重大的意義。

部分試驗(yàn)研究表明，以沙門桿菌作為表達(dá)載體的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)局部和全身體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]。杜愛芳等人[13]通過把重組質(zhì)粒pcDNA3-5401轉(zhuǎn)入致弱沙門菌中表達(dá)制得DNA疫苗，攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，帶有pcDNA3-5401的沙門菌能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而抵抗柔嫩艾美耳球蟲強(qiáng)毒攻擊，但是，沙門菌的穩(wěn)定性和生物安全性還有待進(jìn)一步研究。李安興等人[14]對(duì)B-I株SO7重組抗原進(jìn)行免疫試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，小劑量(10g)免疫雞時(shí)基本不產(chǎn)生免疫保護(hù)力，大劑量(100μg)SO7重組抗原免疫雞時(shí)，能夠產(chǎn)生部分免疫作用；而采用混合免疫方法，即先用SO7重組抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，再用球蟲活苗(強(qiáng)毒株和弱毒株)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，則會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)加強(qiáng)的功效，其保護(hù)效果與用球蟲活苗2次免疫的效果相同。這種方法降低了成本，減少球蟲活苗的用量，同時(shí)還可以減少免疫后雞的卵囊排出量，降低了環(huán)境的污染程度，減少了重復(fù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。Kopko等[15]首次用DNA(pcDNA3.SO7)免疫接種雞，發(fā)現(xiàn)相比用活卵囊和重組蛋白抗原(CheY-SO7)免疫的雞而言，盲腸病變減輕和相對(duì)體重增加。丁熙成等[16]用pET載體經(jīng)原核表達(dá)的EtMIC-2，通過口服、肌注不同劑量工程活菌和菌體裂解蛋白的方式，免疫7、14日齡雞兩次，1 周后再用 E.tenella、E.acervuzina、E.maxima 攻毒，證明經(jīng)原核表達(dá)的的EtMIC-2基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)E.tenella的額保護(hù)作用最強(qiáng)，其它兩種也有保護(hù)作用，但程度稍弱，且口服方式比肌注方式效果明顯。秦睿玲[17]用柔嫩艾美耳球蟲子孢子kMzp5-7基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物，分別給7日齡、14日齡和28日齡的海蘭小公雛通過口服工程活菌和肌肉注射菌體純化蛋白兩種方式連續(xù)3次免疫，結(jié)果也顯示口服方式的免疫效果優(yōu)于肌注免疫組。Lillehoj等[18]用3-1E cDNA與編碼雞細(xì)胞因子(IL-8或IL-15)的cDNA聯(lián)合免疫雞，發(fā)現(xiàn)對(duì)十二指腸內(nèi)皮的CD3+T細(xì)胞有明顯的增殖作用。

3 展望

綜上所述，隨著科技和相關(guān)生物學(xué)科的發(fā)展，關(guān)于雞球蟲各方面的研究都進(jìn)入到細(xì)胞和分子層面，但是球蟲復(fù)雜的生活史依然給相關(guān)研究帶來(lái)了一定的困難，其抗原蛋白的種類、其免疫原性以及保護(hù)性免疫機(jī)制等，都亟須進(jìn)一步的發(fā)展，通過這些基礎(chǔ)性的研究進(jìn)一步摸清球蟲的分子生物學(xué)特性，篩選球蟲不同階段的關(guān)鍵保護(hù)性抗原以及球蟲對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響和免疫應(yīng)答機(jī)制等問題，為球蟲病的防治提供新的更加有效的途徑。