陸金春

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210037）

精液檢驗為臨床實驗室尤其是男科實驗室或生殖醫(yī)學(xué)實驗室最基本的項目，可用于確定男性生育狀態(tài)，是不育評估的第一步[1]。除常規(guī)檢驗外，精液檢驗還包括精子形態(tài)學(xué)及存活率、精子DNA完整性、精子膜完整性、精漿生化、精漿或精子表面抗精子抗體、精液彈性蛋白酶及脫落細(xì)胞等特殊檢查。精液常規(guī)檢驗是一組理學(xué)和顯微鏡檢驗的結(jié)合，包括精液顏色、氣味、量、pH值、液化、黏稠度、精子濃度與總數(shù)、精子活力及有無精子凝集等。

精液檢驗的每個項目對男性生育力的綜合評估都是必不可少的[2]，其結(jié)果準(zhǔn)確與否直接關(guān)系到患者治療方案的選擇。為保證精液檢驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，必須進(jìn)行規(guī)范化檢驗。我們將從精液檢驗規(guī)范化的重要性、具體要求和相關(guān)質(zhì)量控制措施等方面進(jìn)行闡述，為臨床實驗室從事精液檢驗的人員以及實驗室負(fù)責(zé)人提供參考。

1 精液檢驗規(guī)范化的重要性

精液檢驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠直接關(guān)系到臨床醫(yī)生的準(zhǔn)確診斷和輔助生殖技術(shù)治療措施的選擇[2]、實驗室及檢驗人員的自身信譽以及實驗室的可持續(xù)發(fā)展。為避免誤診和漏診，保證科研和流行病學(xué)的調(diào)查質(zhì)量規(guī)范化檢驗十分關(guān)鍵。

目前，許多已發(fā)表的關(guān)于精液分析的文獻(xiàn)結(jié)果之間并不一致，原因可能與統(tǒng)計學(xué)方法運用不當(dāng)、檢驗方法不規(guī)范、檢測結(jié)果變異較大等有關(guān)[3-4]。因此，BJ?RNDAHL等[5]提出，所有撰寫精液分析相關(guān)論文的作者，必須說明檢驗方法是否依照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）手冊[6]、檢測人員是否經(jīng)過培訓(xùn)、有無參加室間質(zhì)量評價等，如作者沒有遵循WHO手冊，在投稿論文中，應(yīng)對所用方法提供偏差和不確定度說明，表明其所投論文檢驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2 精液檢驗規(guī)范化的具體要求

精液檢驗規(guī)范化在方法學(xué)上應(yīng)做到科學(xué)、合理，在樣本留取、檢驗項目名稱、檢驗項目具體操作等方面亦應(yīng)如此[7]。

2.1 選擇科學(xué)、合理的檢驗項目是精液檢驗規(guī)范化的前提

要規(guī)范一個檢驗項目，首先檢驗原理必須科學(xué)，性能必須經(jīng)過充分評估，且應(yīng)經(jīng)驗證適合應(yīng)用于臨床[8]。然而，臨床實驗室使用的檢驗項目，尤其是一些相對較新的項目，在未經(jīng)充分評估和驗證后就進(jìn)入臨床，其價值常被臨床醫(yī)生質(zhì)疑。

如對于反映精子DNA損傷的精子DNA碎片化指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）[9]的測定，最常用的方法為流式細(xì)胞術(shù)的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法，此法存在設(shè)門不規(guī)范，計算方法存疑等缺陷，并引入了目前尚存在爭議的高DNA可染色性參數(shù)[10]。盡管不斷有臨床醫(yī)生和檢驗人員提出質(zhì)疑[11]，但因儀器分析過程完全封閉且有文獻(xiàn)支持，許多男科實驗室仍在采用。又如反映男性生殖道隱性感染的精液彈性蛋白酶檢驗[12]，其試劑盒檢測原理為：酶標(biāo)抗α1抗胰蛋白酶抑制劑抗體和抗彈性蛋白酶抗體與精液樣本中彈性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶抑制劑復(fù)合物結(jié)合。這說明此法檢測的是精液樣本中彈性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶抑制劑復(fù)合物，而精液中與α1抗胰蛋白酶抑制劑結(jié)合的彈性蛋白酶為失活的酶，炎癥過程起作用的卻是游離彈性蛋白酶[11]，該法雖存在明顯缺陷，但仍有臨床實驗在采用。因此，為保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，每個精液檢驗項目用于臨床樣本檢測前，必須進(jìn)行科學(xué)性和臨床價值評估[13]。

2.2 精液樣本留取的規(guī)范化是保證樣本檢測結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)

隨著精液檢驗自動化的發(fā)展，結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性越來越高，但樣本采集如不符合要求，結(jié)果仍無效，甚至?xí)`導(dǎo)臨床，因此檢驗前規(guī)范化樣本留取非常重要。

精液樣本規(guī)范化留取主要體現(xiàn)在以下幾個方面[6，14]。（1）留取前應(yīng)禁欲2～7 d，禁欲時間過短，精液量和精子總數(shù)會相應(yīng)降低；禁欲時間過長，精液量和精子總數(shù)會明顯增多，但精子活力會降低。如是復(fù)查或觀察療效，禁欲天數(shù)最好相同，這樣檢驗結(jié)果才具有可比性。（2）不可采取避孕套或性交中斷法，前者含殺精劑，影響精子活力檢驗，后者受女性分泌物影響，應(yīng)采用手淫法留取。如留取精液確實非常困難，可采用特制無毒避孕套留取。（3）留取精液樣本的完整性，是保證精液檢驗結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵，精液樣本前段或后段任一部分丟失都會影響檢測結(jié)果。應(yīng)采用干燥、清潔、無毒、廣口的專用采樣杯留樣，且及時加蓋，切忌使用痰杯、尿液杯和試管留樣。（4）樣本留取應(yīng)在實驗室附近安靜、舒適且有一些視頻刺激的專用取精室進(jìn)行，切忌在衛(wèi)生間留取，因沒有足夠性刺激，精液很難充分留取，對精液質(zhì)量也有影響。如患者留取確實困難，可在家或賓館留取。需在1 h內(nèi)保溫運送至實驗室，或在配偶幫助下留取，但用于輔助生殖的精液樣本只能在生殖醫(yī)學(xué)中心專用取精室留取。（5）精液樣本留取前，應(yīng)仔細(xì)詢問患者狀況，有無發(fā)熱、服用藥物、飲酒、吸煙及特殊工作環(huán)境等，如有，應(yīng)在報告中注明。樣本留取后應(yīng)置于37 ℃孵箱液化。（6）留取用于精液培養(yǎng)或輔助生殖的樣本前，患者需清洗雙手、陰莖，將精液樣本留于無菌采樣杯中，及時送檢。

2.3 精液檢驗項目名稱的規(guī)范化

在相關(guān)文獻(xiàn)和臨床實驗室工作實踐中，許多精液檢驗項目名稱應(yīng)用不規(guī)范[15]，例如：（1）“精子密度”應(yīng)為“精子濃度”，因為精子是可計數(shù)的，而密度是質(zhì)量相對體積的概念；（2）“精子活率”應(yīng)為“精子活動率”或“精子存活率”，精子活動率是所計數(shù)精子中能運動精子的比例，精子存活率是所計數(shù)精子中活精子的比例，兩者含義不同，且精子存活率結(jié)果應(yīng)高于精子活動率，因為活的精子可以不動；（3）“精子活力”為精子運動能力的分級，不是單一指標(biāo)，而是包括前向運動精子百分比、非前向運動精子百分比和不運動精子百分比3項；精子活動率為活動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比，為前向運動精子百分比和非前向運動精子百分比之和，但“精子活力”常被錯誤地等同于“精子活動率”；（4）“圓細(xì)胞”被錯誤地等同于“白細(xì)胞”，圓細(xì)胞只是形態(tài)上的概念，精液中的脫落細(xì)胞基本為圓形，包括來自睪丸的各類生精細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞和血細(xì)胞，出現(xiàn)不同細(xì)胞提示不同臨床意義，通過染色法完全可區(qū)分“圓細(xì)胞”。另外，“精子前向運動率”、“精子正常形態(tài)率”、“無精癥”、“少精癥”等也常用，但應(yīng)分別稱其為“前向運動精子百分比”、“正常形態(tài)精子百分率”、“無精子癥”或“無精液癥”、“少精子癥”或“少精液癥”等。

2.4 精液檢驗操作要求的規(guī)范化

要做到精液檢驗規(guī)范化，首先必須按最新指南、標(biāo)準(zhǔn)或共識執(zhí)行。目前，精液分析最權(quán)威的指南是WHO發(fā)布的第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[6]。在此基礎(chǔ)上，臨床實驗室應(yīng)結(jié)合自身實驗條件，編寫適合的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operation procedure，SOP）。每個檢驗項目均應(yīng)編寫含具體操作細(xì)節(jié)的SOP，使SOP真正做到“做你所寫、寫你所做”，使新檢驗人員按SOP即可獨立操作，且檢驗結(jié)果在允許誤差范圍內(nèi)。

精液檢驗操作規(guī)范化的具體要求[14]包括以下幾方面。（1）檢驗前，樣本必須充分混勻，以保證所取的任何一部分精液、精漿均能代表整體，混勻時應(yīng)輕柔地上下顛倒或旋轉(zhuǎn)，以免產(chǎn)生氣泡影響取樣準(zhǔn)確性[14]。（2）精液量用稱重法測量，不用刻度量筒法或目測估算法，使用可去皮電子天平[14]。（3）不液化或液化不全、黏稠度增加的精液樣本必須通過反復(fù)抽吸或用糜蛋白酶、菠蘿蛋白酶處理，否則會影響精子活力及運動參數(shù)分析，也會影響準(zhǔn)確取樣、精子與精漿的有效分離[7]。（4）分析精子濃度、活力及形態(tài)時，應(yīng)隨機(jī)選擇視野，所選視野應(yīng)遍布整個分析區(qū)域，避免來回移動視野，防止重復(fù)檢驗[14]。（5）分析精子濃度、活力和形態(tài)時，均需檢驗2次，每次檢驗精子數(shù)不低于200個，且2次結(jié)果應(yīng)在95%可信區(qū)間內(nèi)，然后取均值報告。如2次檢驗結(jié)果超過95%可信區(qū)間，必須重做[14]。（6）分析精子活力時，高濃度（＞50×106/mL）樣本必須用自身精漿稀釋后再分析精子活力，因為高濃度精子碰撞機(jī)會明顯增加，而碰撞會改變精子運動軌跡，導(dǎo)致活力分析結(jié)果出現(xiàn)偏差；分析視野應(yīng)距邊緣至少5 mm，以避免邊緣效應(yīng)；因精子對溫度比較敏感，故應(yīng)使整個分析系統(tǒng)處于37 ℃恒溫狀態(tài)；因隨時間延長檢測結(jié)果會受影響[7，13]，應(yīng)在樣本收集后1 h內(nèi)完成分析。（7）使用計算機(jī)輔助精液分析（computer-assisted sperm analysis，CASA）系統(tǒng)分析精子濃度和活力時，必須進(jìn)行人工校正，以保證所分析精子數(shù)與實際精子數(shù)一致[16]。（8）樣本用于精子形態(tài)學(xué)分析時，應(yīng)離心洗滌，離心速度必須控制在500～800×g，以防精子損傷，而在獲取精漿樣本時，離心速度必須不低于3 000×g，離心15 min，以免精漿中殘余精子或細(xì)胞對生化檢驗結(jié)果產(chǎn)生影響。（9）進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析時，所用電腦顯示屏必須為標(biāo)屏，帶有標(biāo)尺，如使用CASA系統(tǒng)必須進(jìn)行人工校正。（10）進(jìn)行抗精子抗體檢測時，如用酶聯(lián)免疫吸附試驗，陽性結(jié)果應(yīng)采用另一試劑盒復(fù)檢，如仍為陽性，可報告結(jié)果；如復(fù)檢為陰性，可采用混合抗球蛋白反應(yīng)法（mixed antiglobulin reaction，MAR）或免疫珠試驗（immunobead test，IBT）復(fù)檢，最終結(jié)果應(yīng)以MAR或IBT為準(zhǔn)。（11）精子會消耗果糖導(dǎo)致精漿果糖假性降低，檢測精漿果糖時，精液常規(guī)分析完成后應(yīng)立即將精子與精漿分離。（12）對有疑問的結(jié)果，首先應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢，然后根據(jù)SOP排除可能影響因素。此外，不同檢驗項目要求關(guān)注不同細(xì)節(jié)，如孵育時間、溫度、試劑盒室溫平衡、涂片干燥、樣本處理等，一些細(xì)節(jié)可能會直接影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 精液檢驗的質(zhì)量控制措施

目前，仍缺乏精液檢驗的室間質(zhì)量評價組織，因此建立適當(dāng)?shù)氖覂?nèi)質(zhì)量控制措施就很必要。（1）用于精液量檢驗的天平必須每年校驗1次；（2）用于精液pH值檢驗的試紙必須用pH6.0～10.0的精密試紙，且必須用不同標(biāo)準(zhǔn)pH值溶液進(jìn)行驗證；（3）用于精子濃度、活力分析的精子計數(shù)池深度每半年或1年必須校正1次；計數(shù)池使用1～2年或損壞后應(yīng)立即更換[7]；（4）精子濃度用定值乳膠珠進(jìn)行每日質(zhì)量控制，在CASA分析儀安裝完畢及維修后，首次使用精子計數(shù)池，同一實驗室不同CASA分析儀比較時均需使用定值乳膠珠質(zhì)控品進(jìn)行驗證；（5）精子活力分析可用自帶刻錄功能的CASA分析儀制備視頻錄像，并用于每日質(zhì)量控制；（6）精子形態(tài)學(xué)分析可用預(yù)染玻片、未染玻片或同一精液樣本進(jìn)行每日質(zhì)量控制，分別用于評價精子形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、染色操作以及整個形態(tài)學(xué)分析過程對結(jié)果的影響；（7）精漿生化檢測可用同一精漿樣本分裝的凍融樣本作為質(zhì)控品；（8）抗精子抗體可用分裝凍融的陰性和陽性精漿樣本作為質(zhì)控品；（9）使用流式細(xì)胞儀檢測精子DFI等項目前，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球?qū)α魇郊?xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)；（10）每份樣本，尤其是用于無有效質(zhì)控品的精液檢驗項目的樣本，均應(yīng)重復(fù)檢驗2次，2次檢驗結(jié)果差異在可接受范圍內(nèi)，才可取均值報告結(jié)果。

需要注意的是，自制室內(nèi)質(zhì)控品每日需與精液樣本一起分析，且應(yīng)確保結(jié)果在控。如一批質(zhì)控品即將用完或失效，需提前制備新的質(zhì)控品，且制備的新質(zhì)控品應(yīng)用原質(zhì)控品監(jiān)控。室內(nèi)質(zhì)量控制要繪制質(zhì)控圖，并定期分析。在質(zhì)量控制結(jié)果失控時，要及時查找原因，尤其要關(guān)注環(huán)境、試劑、儀器、器材有無更改，質(zhì)量控制結(jié)果在控后，方可進(jìn)行常規(guī)樣本檢驗，失控原因和具體解決措施應(yīng)有詳細(xì)記錄。

有關(guān)精液檢驗室間質(zhì)量評價工作，目前我國已有一些嘗試，但效果有限，這一情況已引起我國生殖檢驗專家、相關(guān)試劑生產(chǎn)者和行政主管部門的關(guān)注，并已著手進(jìn)行相關(guān)研究，期待在不久的將來會有專門從事精液檢驗室間質(zhì)量評價的機(jī)構(gòu)出現(xiàn)。

4 展望

隨著男科學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，新的精液檢驗項目，尤其是精子功能檢驗項目，如精子線粒體膜電位、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)、精子活性氧、精子表面凝集素、精子與透明帶結(jié)合、精子穿卵能力檢測等[17]已被引入臨床，并逐步發(fā)展成為常規(guī)檢驗項目。隨著人工智能的引入，將精液量、pH值、黏稠度、精子濃度、精子活動率、形態(tài)學(xué)等整合在一起的自動化精液檢驗系統(tǒng)亦可能面世。建立科學(xué)、合理的檢測方法進(jìn)行充分的性能評估和廣泛的臨床驗證是保證精液檢驗規(guī)范化的前提；建立規(guī)范化SOP和相應(yīng)質(zhì)控措施是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的有效措施。

總之，隨著精液檢驗的自動化、儀器設(shè)置最優(yōu)化的發(fā)展[13，18-19]，規(guī)范化工作將更易實施，但是教育、培訓(xùn)（尤其是手把手培訓(xùn)）、質(zhì)量控制將是保證所有實驗室對精液進(jìn)行規(guī)范檢驗并保持長期穩(wěn)定的重要舉措[20]。