張萬生，謝華，薛智欣，王雪楠，吳迪，孫艷美，潘曉燕*

1吉林醫(yī)藥學院生殖醫(yī)學研究中心，吉林省吉林市 132013；2吉林醫(yī)藥學院附屬465醫(yī)院泌尿外科，吉林省吉林市 132013；3吉林市中心醫(yī)院婦科，吉林省吉林市 132602；4濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖科，山東濟寧 272029

復發(fā)性自發(fā)流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion， RSA)指與同一伴侶孕育的胚胎連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上的流產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，每一次妊娠的自然流產(chǎn)發(fā)生率為10%～15%，RSA的發(fā)生率約為1%[1]。RSA的病因十分復雜，主要包括母體子宮結構異常、胚胎染色體異常、母胎的免疫容受性缺陷、血栓形成傾向及胎盤血管形成異常等。其中，遺傳因素是引起RSA的常見原因之一。在遺傳因素方面，人們已經(jīng)通過大量的臨床研究確定了由于染色體倍性異常及染色體結構異常引起的流產(chǎn)[2]，但仍有約50%不明原因性流產(chǎn)至今無法解釋。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一些基因的多態(tài)性與RSA密切相關，且在不同人種中開展的基因分型研究確定了一些與RSA有關的高風險基因型[3-5]。 表達父系抗原的胚胎進入子宮后，首先要在母體免疫系統(tǒng)的容許下，與具有容受性的子宮內(nèi)膜建立聯(lián)系，這一過程受到母體免疫系統(tǒng)基因人類白細胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及IL-6等的精確調(diào)控[6]，這些基因的表達異常會導致植入失敗，提示母體免疫系統(tǒng)基因的多態(tài)性可能與RSA有關；其次，胎兒發(fā)育的維持需從含有豐富血管的胎盤組織中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、凝血因子Ⅴ(factor Ⅴ，F(xiàn)Ⅴ)、凝血因子Ⅻ(factor Ⅻ，F(xiàn)Ⅻ)、凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)及纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAI)等基因在調(diào)控胎盤血管形成及血液循環(huán)過程中起重要作用[7]，這些基因突變也可能增加RSA的風險。本文從母體免疫系統(tǒng)及血液系統(tǒng)基因多態(tài)性方面，對與RSA相關的基因及基因型進行綜述，以闡述RSA的發(fā)病機制，旨在為預防及治療RSA提供理論依據(jù)。

1 參與子宮內(nèi)膜容受性建立的基因多態(tài)性

子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜處于一種允許胚胎黏附、侵入的狀態(tài)，同時侵入的胚胎誘導內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生蛻膜化，最終胚胎植入子宮內(nèi)膜，完成整個著床過程[8]。在這一過程中，各種炎性細胞因子聚集在植入位點，參與免疫細胞募集后的炎癥反應[9]，使母體對植入的胚胎產(chǎn)生免疫耐受，接受具有父系抗原的胚胎侵入。因此，子宮內(nèi)膜容受性的獲得與炎癥反應密切相關，免疫細胞通過炎癥反應分泌不同的細胞因子，刺激細胞增殖及分化，并誘導組織重建。

1.1 HLA-G基因多態(tài)性 HLA-G是一類免疫耐受分子，高表達于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)層細胞，其基因定位于人第6號染色體短臂HLA-G通過抑制T細胞及NK細胞的細胞毒性作用，在半同種異源的胚胎植入過程中起重要的免疫耐受調(diào)控作用。HLA-G有3個多態(tài)位點(14-bp INDEL、+3142C-G及+3187A-G)，它們通過影響HLA-G mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控HLA-G mRNA的轉錄水平[10]。Afkhami等[11]發(fā)現(xiàn)，-14 bp/-14 bp及+14 bp/+14 bp基因型頻率在RSA人群中降低，而+14 bp/-14 bp基因型頻率在RSA人群中明顯增高。HLA-G 14 bp INDEL多態(tài)性可能與RSA有關，但仍須進一步檢測血清HLA-G水平以確定這一基因多態(tài)性的潛在影響。Hashemi等[12]發(fā)現(xiàn)HLA-G 14 bp INDEL多態(tài)性與RSA密切相關，且HLA-G 3142G＞C多態(tài)性在共顯性組(GC vs. GG，OR=2.39，95%CI 1.27～4.49，P=0.010；CC vs. GG，OR=3.28，95%CI 1.16～9.72，P=0.040)及顯性組(GC+CC vs. GG，OR=2.52，95%CI 1.37～4.64，P=0.004)提高了RSA的發(fā)生風險。Yazdani等[13]分析了100例RSA患者及100例女性健康對照者HLA-G基因啟動子區(qū)-1573T＞C及-1746C＞A單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與RSA的相關性，結果發(fā)現(xiàn)H1(ATCCAGGTACGCAA)及H2(CTTCGAGAACGCAG)這兩種單倍型與RSA存在明顯的相關性，H1降低了RSA的發(fā)生風險，而H2增加了RSA的發(fā)生風險。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在HLA-G基因啟動子區(qū)、3'-非編碼區(qū)(UTR)及5'-UTR等區(qū)域的不同基因型與RSA均有相關性[13-15]，但為了進一步得出明確的結論，需擴大樣本繼續(xù)重復這些試驗。此外，在HLA-G的其他位點也可能存在與RSA相關的重要基因型，因此仍需進一步研究 探索。

1.2 IL1RN基因多態(tài)性 炎癥反應對處于“植入窗”期的子宮內(nèi)膜起重要調(diào)控作用，炎癥反應異?？蓪е孪忍煨缘膹桶l(fā)性流產(chǎn)。IL-1β作為促炎性因子，在植入及早期胎盤發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。IL-1β過度表達會誘導流產(chǎn)的發(fā)生，IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL-1ra)可通過與IL-1β受體結合，調(diào)控IL-1β在組織中的活性[16]。 IL1RN定位在人染色體2q14區(qū)，編碼IL-1ra。有研究發(fā)現(xiàn)，在IL1RN基因第2內(nèi)含子中存在可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable numbers of tandem repeat sequence，VNTR)多態(tài)性[17]。Avila-Vergara等[18]對來自墨西哥的108例RSA患者(病例組)及103名健康女性(對照組)進行了IL1RN基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)病例組的等位基因IL1RN*2發(fā)生率為20.8%，高于對照組的5.8%，等位基因IL1RN*2通過編碼低功能的IL-1ra蛋白，異常提高了IL-1β的活性，導致RSA的發(fā)生，等位基因IL1RN*2與RSA的發(fā)生密切相關(OR=4.28，95%CI 2.2～8.4，P＜0.001)。而Hajizadeh等[19]對來自伊朗的140例RSA患者及140名健康女性進行了同樣的研究，并未發(fā)現(xiàn)IL1RN基因VNTR多態(tài)性與RSA相關。Dai等[20]在中國漢族人群體中也未發(fā)現(xiàn)IL1RN基因第2內(nèi)含子中VNTR多態(tài)性與RSA相關。因此，種族不同不僅可影響等位基因的頻率，也可影響基因多態(tài)性與疾病間的相關性。此外，還有一個重要的因素是研究的樣本量，有限的樣本量很可能會造成統(tǒng)計分析的偏差。

1.3 TNF-α及IL-6基因多態(tài)性 TNF-α及IL-6也是參與妊娠免疫調(diào)控的重要因子。TNF-α是主要由單核巨噬細胞分泌的一類促炎因子，IL-6是由Th2細胞分泌的細胞因子，可明顯促進胚胎著床，降低免疫細胞介導的免疫反應，參與妊娠的維持。RSA患者體內(nèi)具有較高的血清TNF-α水平及較低的IL-6水平，提示TNF-α及IL-6可能與RSA的發(fā)生有關[21-22]。TNF-α及IL-6的基因多態(tài)性位點分別為啟動子區(qū)-238G/A及-174G＞C。Zhao等[23]對43篇文獻中RSA患者的TNF-α -238G＞A及IL-6 -174G＞C啟動子區(qū)多態(tài)性進行Meta分析，結果發(fā)現(xiàn)，TNF-α -238G＞A在純合子組(AA vs. GG，OR=1.533，95% CI 1.022～2.301)及隱性組(AA vs. GG+AG，OR=1.571，95%CI 1.050～2.350)與RSA的發(fā)生明顯相關(P＜0.05)。對于IL-6 -174G＞C，除了隱性組(CC vs. GG+CG，OR=1.166，95%CI 0.938～1.449，P＞0.05)外，其他所有組與RSA間均存在相關性(P＜0.05)。因此，對具有RSA高危因素的女性進行TNF-α -238G＞A及IL-6 -174G＞C基因多態(tài)性篩查，可能有助于減少RSA的發(fā)生。

1.4 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)基因多態(tài)性 在胚胎植入時，處于分泌期的子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜化，細胞外基質(zhì)在MMPs的作用下發(fā)生降解及重塑。MMPs由子宮內(nèi)膜及胚胎滋養(yǎng)層細胞分泌。研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者的MMPs基因表達異常可導致母體子宮內(nèi)膜細胞外基質(zhì)異常，影響胚胎的植入及妊娠[24]。Pereza等[25]發(fā)現(xiàn)，MMP2 -735CT及MMP9 -1562CC的基因型頻率在RSA患者中明顯增高，這兩種基因型可能是引起RSA的危險因素。同樣，Li等[26]在中國人群中也發(fā)現(xiàn)MMP2 rs243865及MMP9 rs3918242的基因多態(tài)性與RSA的發(fā)生明顯相關。2017年，Bari?i?等[27]擴展了對不同MMP基因多態(tài)性的研究，但未發(fā)現(xiàn)MMP7 -181A/G及MMP12 -82A/G與RSA的發(fā)生相關。調(diào)控胚胎植入及維持妊娠的基因復雜多樣，因此，須進行大量研究以進一步探索與RSA有關的主要基因及基因型。

2 參與形成血栓前狀態(tài)的基因多態(tài)性

血栓前狀態(tài)是指多種因素引起的止血、凝血、抗凝障礙及纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)，使機體出現(xiàn)凝血功能異常增高、纖溶功能降低，形成血液的高凝狀態(tài)。母體血液高凝狀態(tài)可引起子宮胎盤部位血流狀態(tài)改變，局部組織易形成微血栓及胎盤梗死灶，使胚胎缺血缺氧，最終導致胚胎發(fā)育不良或流產(chǎn)。參與凝血、抗凝及纖溶有關的基因突變是產(chǎn)生這一病理狀態(tài)的遺傳學基礎，也是導致RSA的重要母體 因素。

2.1 參與凝血、抗凝的基因多態(tài)性 造成血栓前狀態(tài)的遺傳因素是由一些具有形成血栓傾向的基因突變引起的，其中最常見的是凝血因子Ⅴ基因Leiden(FⅤL)突變及凝血酶原基因突變。RSA患者FⅤL突變發(fā)生率為3%～42%[28]。FⅤL突變是一種常染色體顯性遺傳病，在FⅤ基因的核苷酸序列1691位點上發(fā)生了谷氨酰胺對精氨酸的錯義突變，氨基酸序列506位點的精氨酸被谷氨酰胺取代?；罨鞍證是一種天然抗凝血劑，通過在氨基酸506位點處裂解FⅤ，使FⅤ失活，阻止血液凝固。FⅤL突變可阻止FⅤ的失活，活化的FⅤ可穩(wěn)定凝血酶原復合物，增強凝血酶原的活化，最終增加血栓形成的風險。Kashif等[28]發(fā)現(xiàn)，RSA患者FⅤL突變發(fā)生率為5.4%，而在健康女性對照組中未發(fā)現(xiàn)此突變，提示FⅤL突變與RSA密切相關。Barut等[29]也發(fā)現(xiàn)雜合子型的FⅤL H1299R與RSA具有明顯相關性(P＜0.01)。但宋綠茵等[30]通過分析中國廣東地區(qū)婦女FⅤL突變情況發(fā)現(xiàn)，該突變與中國廣東地區(qū)婦女RSA的遺傳易感性無關。究其原因，可能是基因分布頻率受種族、地域等多種因素影響，致使不同種族及人群的FⅤ基因多態(tài)性存在差異；也可能是其他與血栓前狀態(tài)相關的基因參與了RSA的發(fā)生。因此，對于中國廣東地區(qū)人群中與RSA相關的基因及基因型的確定還需要進一步分析及篩查。

患者處于血栓前狀態(tài)時，血液的高凝狀態(tài)不一定導致嚴重的血栓性疾病，但可引起凝血功能增強及纖溶功能降低。凝血因子Ⅻ(FⅫ)是一種80 ku的絲氨酸蛋白酶，在體內(nèi)并不是重要的促凝因子，但在抗血栓及促進纖溶功能中發(fā)揮著重要作用。在FⅫ基因啟動子區(qū)第46 nt處發(fā)現(xiàn)了C/T多態(tài)性。46C/T多態(tài)性為mRNA創(chuàng)造了一個新的起始密碼子(ATG)，妨礙了翻譯起始位點的正確識別，降低了FⅫ的翻譯效率，最終導致血漿中Ⅻ因子水平降低[31]。 Asano等[32]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅻ活性較低(＜39%)女性的流產(chǎn)率明顯高于FⅫ活性正常的女性，RSA組的CT基因型分布頻率(53.1%)較正常對照組(38.0%)明顯升高，CT基因型是RSA的危險因素(OR=2.8，95%CI 1.37～5.85)。金艷慧等[31]對來自中國浙南地區(qū)的203例RSA患者及171名無不良妊娠史的健康女性進行了FⅫ基因46C/T多態(tài)性檢測，也發(fā)現(xiàn)RSA患者中FⅫ基因CT基因型的比例較高，提示FⅫ基因CT基因型可能是浙南地區(qū)育齡期女性發(fā)生RSA的危險因素 之一。

2.2 參與纖溶的基因多態(tài)性 TAFI是一種人血漿酶原，是近年來國內(nèi)外醫(yī)學界研究凝血及纖溶調(diào)控因子的熱點之一。TAFI是由401個氨基酸組成的單鏈血漿蛋白，以無活性的酶原形式在血液中循環(huán)。凝血酶、凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物及纖溶酶在TAFI的第92個Arg位點將其裂解，產(chǎn)生活化的TAFI(TAFIa)。TAFIa可將纖維蛋白羧基端賴氨酸位剪切，從而阻止纖維蛋白與纖溶酶原及組織纖溶酶原激活物的結合，減少纖溶酶的產(chǎn)生，最終導致纖溶作用減弱，增加了血栓形成的風險。Juhan-Vague等[33]研究發(fā)現(xiàn)，當血漿TAFI濃度＞129 nmol/L 時，可使血栓形成的危險性增加1倍；此外，還發(fā)現(xiàn)TAFI 1040C/T多態(tài)性可改變血液中的TAFI水平，影響TAFIa的纖溶作用，據(jù)此推測TAFI 1040C/T多態(tài)性可能與RSA有關。ElDanasori等[34]通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術分析了TAFI 1040C/T在RSA患者及健康女性中的發(fā)生頻率及相關性，結果發(fā)現(xiàn)，雖然T等位基因在RSA患者中具有較高的頻率，但差異無統(tǒng)計學意義，且CC及TT基因型與RSA無相關性(P=0.71)，提示TAFI 1040C/T尚不能作為RSA的一個預測因子。但Abulata等[35]發(fā)現(xiàn)，當eNOS突變與TAFI 1040C/T 突變同時發(fā)生時，會使R SA的發(fā)生風險提高1.5倍，提示可能一些基因的連鎖突變會影響某項生理活動，進而導致疾病的發(fā)生。纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)也是一類調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解的重要分子，研究發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)-675G/A(4G/5G)及-844G/A變異與血栓風險增加相關[35]。Barut等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)PAI-1 4G/5G及PAI-1 4G/4G的SNP與RSA明顯相關。Cao等[36]利用質(zhì)譜技術分析了6個血栓形成傾向基因[SERPINC1(G786A)、THBD(C1418T)、TFPI(T-33C)、FⅤL(G1628A)、F2(A19911G)及ANXA5(G76A)]的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)只有THBD(C1418T)多態(tài)性與RSA密切相關。由于血栓的形成原因復雜，參與表達的基因眾多，因此，需擴大樣本量進行大量的實驗篩選，以確定與RSA有關的分子基因型。

3 參與胎盤血管形成的基因多態(tài)性

胎盤是妊娠期胎兒在母體內(nèi)生長及發(fā)育的重要器官，胎兒通過胎盤血液循環(huán)系統(tǒng)與母體進行氣體交換，獲得營養(yǎng)物質(zhì)并排泄代謝產(chǎn)物。胎盤血管網(wǎng)絡形成及充足的血液灌注量是保障胎兒正常生長發(fā)育的重要因素。胎盤血管形成異常將直接導致流產(chǎn)。

3.1 VEGF基因多態(tài)性 VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，是血管生成的主要誘導因子，對刺激滋養(yǎng)層細胞增殖及胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育至關重要。有研究利用血管生成抑制劑AGM-1470處理懷孕小鼠，以干擾VEGF調(diào)控的胎盤血管發(fā)育，結果顯示胚胎生長失敗[37]。An等[38]研究了VEGF 3'-UTR區(qū)的SNP[rs3025040 (1451C＞T)、rs10434 (1612G＞A)、rs3025053 (1725G＞A)]與RSA的關系，結果發(fā)現(xiàn)，RSA組與正常對照組的rs10434 (1612G＞A)(GG vs. GA，OR=0.476，95%CI 0.293～0.774；GG vs. GA+AA，OR=0.446，95% CI 0.280～0.710)以及rs3025053 (1725G＞A)(GG vs. GA，OR=0.413，95%CI 0.207～0.825；GG vs. GA+AA，OR=0.381，95% CI 0.192～0.755)基因型頻率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示VEGF基因多態(tài)性與RSA的發(fā)生密切相關。Saboori等[39]檢測了100例RSA患者及100名健康女性的VEGF基因在+936C/T(rs3025039)、-1154G＞A (rs1570360)、rs3025010及+5092A/C(rs2146323)4個位點的多態(tài)性，結果發(fā)現(xiàn)，-1154G/A雜合基因型(GA)與RSA存在相關性，VEGF內(nèi)含子區(qū)(rs3025010)的SNP也與RSA相關。Pereza等[40]分析了血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)基因啟動子區(qū)域-2549插入/刪除(I/D)的多態(tài)性與RSA是否存在關聯(lián)，結果發(fā)現(xiàn)，在女性中-2549I/D多態(tài)性與RSA無關聯(lián)性；而攜帶DD基因型的男性與攜帶ID及II基因型的男性相比，其配偶發(fā)生RSA的風險增加了1.75倍(95%CI 1.05～2.93，P=0.032)，提示男性VEGFA基因中的-2549 I/D多態(tài)性可能與其配偶發(fā)生RSA有關。Vidyadhari等[41]發(fā)現(xiàn)，胎兒及母體中A1154D2549A2578T936單倍型VEGF顯示出更高的RSA風險，而G1154I2549A2578C936單倍型VEGF則與RSA存在低風險的關聯(lián)。VEGF基因上存在多個與RSA具有相關性的多態(tài)性位點，且這些位點間相互關聯(lián)，共同影響RSA的發(fā)生。

3.2 eNOS基因多態(tài)性 胎兒胎盤血管缺乏自主神經(jīng)支配，胎側界面的血管功能調(diào)節(jié)是由內(nèi)皮細胞來源的血管活性介質(zhì)(包括eNOS)介導的，并參與調(diào)控一氧化氮(NO)的生成。由eNOS催化產(chǎn)生的NO參與調(diào)節(jié)血管舒張、激活內(nèi)皮祖細胞及抑制血小板聚集等過程。eNOS基因突變主要表現(xiàn)為第4內(nèi)含子中VNTR多態(tài)性及+894 G/T SNP多態(tài)性。Pereza等[42]通過Meta分析研究894例RSA患者及944名健康對照女性第4內(nèi)含子中VNTR的多態(tài)性，以及1111例RSA患者及1121名健康對照女性+894 G/T SNP的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)+894 G/T的GT及TT基因型(OR=1.54，95%CI 1.28～1.86，P＜0.01)與RSA明顯相關。Zhao等[43]發(fā)現(xiàn)eNOS第4內(nèi)含子中VNTR A/B、G894T、C786T與R SA明顯相關。因此，進一步研究與不明原因復發(fā)性自發(fā)流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)密切相關的4VNTR A/B、G894T、C786T eNOS基因型，對高危女性RSA的篩查及預防具有重要意義。

4 總結與展望

目前，對RSA相關基因多態(tài)性的研究主要集中在參與妊娠活動的主要基因上。但是，由于基因表型復雜，因此不能忽視對一些次要基因的研究，否則容易造成結果的片面性；且基因多態(tài)性易受地域及人種的影響，也是需要考慮的一個重要因素。此外，采用基因分析的RSA患者較少(大部分研究不超過300例)，存在部分與RSA密切相關的基因型由于發(fā)生頻率低或樣本量少而無法被發(fā)現(xiàn)的情況。即使部分基因型被發(fā)現(xiàn)與RSA密切相關，但大多數(shù)缺乏導致妊娠失敗的功能性研究。因此，須在擴大樣本進行大量的實驗篩選并結合功能性研究后，才能確定與RSA密切相關的基因型，從而用于臨床對RSA的篩查及預防。