黃小抗，朱啟金，吳永貴

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥，并已成為終末期腎病重要的病因之一[1]，其發(fā)病機制復雜，最主要的機制是機體內(nèi)的高血糖微環(huán)境導致腎小球的濾過功能受損，引起腎小球基底膜的增厚、系膜細胞的增殖以及細胞外基質(zhì)的蓄積。近年越來越多的研究[2-4]證明了炎癥與DN的相關性，而巨噬細胞在其中起著至關重要的作用。除此之外，巨噬細胞是否具有其他的功能可以影響DN的發(fā)展已經(jīng)成為研究熱點[5]。外泌體是一種新的細胞與細胞間交流的方式，其內(nèi)包裹了蛋白、mRNA和microRNA(miRNA)等多種信息物質(zhì)，可以通過細胞釋放和細胞攝入的方式完成信息傳遞[6]。已經(jīng)有研究[7]發(fā)現(xiàn)DN患者體液中的外泌體對于疾病的診斷和治療都有著重要的作用。該研究前期在高糖共培養(yǎng)巨噬細胞和系膜細胞的微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)系膜細胞活化和增殖能力增加，這提示巨噬細胞可能通過某種方式影響了系膜細胞。另有文獻[8]表明，高糖環(huán)境下的腎小球內(nèi)皮細胞和系膜細胞共培養(yǎng)體系中，內(nèi)皮細胞分泌的外泌體可以通過TGF-β1/Smad3信號通路促進系膜細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)表達，從而促進腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)蛋白的過度表達。在此基礎下，現(xiàn)通過將外泌體注入小鼠體內(nèi)的方法，來探究不同糖刺激條件下巨噬細胞釋放的外泌體對小鼠腎組織中TGF-β1/Smad3通路的影響，進一步闡明巨噬細胞對系膜細胞功能的影響作用和機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)購自中科院上海細胞庫。動物購自南京大學模型動物研究所。選取體質(zhì)量20～30 g，6～8周齡的雄性SPF級C57小鼠60只。小鼠飲水、飼料和墊料均通過高壓滅菌后使用。本研究已通過安徽醫(yī)科大學動物研究倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與耗材外泌體提取試劑盒、CD63單克隆抗體(美國SBI公司)；DMEM培養(yǎng)基(以色列Biological industries公司)；免疫組化試劑盒(PV-9000)(北京中杉金橋公司)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白(Calnexin)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad3、p-Smad3單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；尿白蛋白ELISA試劑盒、CD68、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原蛋白(collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ)、TSG101、α-SMA、單克隆抗體(英國Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞分組與培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞系分為NG組(培養(yǎng)基內(nèi)含5.5 mmol/L葡萄糖)，MC組(培養(yǎng)基內(nèi)含25 mmol/L甘露醇)和HG組(培養(yǎng)基內(nèi)含25 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)。培養(yǎng)于加入10%胎牛血清與0.1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2。

1.3.2外泌體提取與鑒定 外泌體提取：細胞上清液以3 000 r/min離心15 min去除沉淀的細胞碎片，吸出上清液轉移到新的EP管，按Exo Quick ∶上清液=1 ∶5加入試劑混勻，4 ℃冰箱靜置保存12 h后以1 500 r/min離心30 min去除上清液，沉淀即為外泌體。最后使用200 μl無菌磷酸緩沖液(PBS)重懸外泌體后于-80 ℃保存。外泌體鑒定：取出外泌體置于冰上解凍，加液槍輕輕吹勻后滴加10 μl在銅網(wǎng)正面，濾紙吸干邊緣多余液體，室溫晾干后滴加30 μl醋酸雙氧鈾染色3 min，隨后PBS洗滌3次，室溫晾干后將樣品置于電子顯微鏡(H-7700，日本Hitachi公司)下進行觀察。

1.3.3外泌體蛋白提取 外泌體取出后冰上解凍，加入等體積的蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=9 ∶1)，加液槍輕輕吹勻后迅速置于冰上裂解15 min，以12 000 r/min離心15 min去除沉淀，上清液即為外泌體蛋白。

1.3.4動物分組與處理 為保持實驗條件一致性，依照C57BL/6小鼠大小、體質(zhì)量、周齡等因素，最終選取一般條件相仿的30只小鼠分為三組，每組為10只。提取不同培養(yǎng)條件下的巨噬細胞培養(yǎng)基上清中的外泌體注射到小鼠體內(nèi)，并按照外泌體分組將動物分為NG-Exo組(正常糖刺激外泌體注射組)，MC-Exo組(甘露醇刺激外泌體注射組)，HG-Exo組(高糖刺激外泌體注射組)；處理方法為隔天1次尾靜脈注射，持續(xù)8周。

1.3.5標本收集 取材前1 d將小鼠放入代謝籠，收集24 h尿標本后快速以4 000 r/min離心30 min棄去尿液沉渣，重新分裝后保存于-80 ℃冰箱。使用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，使用4 ℃預冷的生理鹽水經(jīng)腹主動脈插管進行灌流，觀察到腎臟增大后剪斷腎靜脈，用紗布輕輕按摩腎臟以促進灌注完全，待腎臟顏色變白后快速取材處理。左側腎臟置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h后脫水包埋制成蠟塊，并制成3 μm的石蠟切片留作后續(xù)病理及免疫組化染色。右側腎臟于冰上迅速分割成小塊后放置凍存管內(nèi)，并凍存于液氮中用作后續(xù)Western blot檢測相關蛋白。

1.3.6尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)檢測 ELISA法檢測小鼠尿白蛋白含量,UAER值為尿白蛋白含量測定值與24 h尿量乘積。

1.3.7病理染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后行HE染色和PAS染色并在光鏡下觀察。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機拍攝10個腎小球，依據(jù)系膜擴張與腎小球總體面積比例進行評分，并計算平均值，進行統(tǒng)計學處理。評分標準為：0分(0%)、1分(>0%～≤25%)、2分(>25%～≤50%)、3分(>50%～≤75%)、4分(>75%)。

1.3.8免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，沖洗后依次滴加3%的甲醇過氧化氫消除組織內(nèi)源性過氧化物酶(甲醇 ∶過氧化氫=9 ∶1)，室溫孵育30 min后沖洗，高壓法修復抗原(修復液為0.1%檸檬酸鹽緩沖液)，冷卻至室溫后滴加10%山羊血清37 ℃溫箱中孵育30 min(甩去血清即可，無需沖洗)，滴加一抗孵育CD68(1 ∶200)、Col-Ⅳ(1 ∶100)、FN(1 ∶100)，于37 ℃溫箱中1 h，沖洗后滴加二抗孵育(辣根酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG)，于37 ℃溫箱中30 min，沖洗后進行DAB顯色。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機選擇10個腎小球，通過ImageJ軟件分析腎小球陽性細胞數(shù)及陽性百分比，并進行統(tǒng)計學處理。

1.3.9Western blot 取出適量腎組織置于冰上，迅速使用4 ℃預冷的生理鹽水進行沖洗，隨后加入適量裂解液超聲勻漿裂解，4 ℃離心30 min后去除沉淀保存上清液。留取少許上清液，通過BCA法檢測蛋白濃度，并計算蛋白上樣量。取適量蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉移至NC膜上。轉膜結束后，通過麗春紅染色觀察條帶分布，將膜洗凈后用5%脫脂奶粉(TBST配置)室溫封閉2 h，洗膜后放入一抗孵育CD63(1 ∶1 000)、TSG101(1 ∶1 000)、Calnexin(1 ∶1 000)、FN(1 ∶5 000)、Col-Ⅳ(1 ∶5 000)、α-SMA(1 ∶20 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶5 000)、p-Smad3(1 ∶5 000)、β-actin(1 ∶3 500)，4 ℃孵育12 h，洗膜后放入HRP標記的二抗孵育(1 ∶2 000)，室溫下孵育1 h，洗膜后用濾紙吸干多余水分，滴加ECL發(fā)光試劑，通過化學發(fā)光凝膠呈像系統(tǒng)顯影。

2 結果

2.1 外泌體電鏡及蛋白鑒定外泌體形態(tài)：圖1A可以觀察到透射電鏡下，外泌體表現(xiàn)為直徑分布在50 ～150 nm的圓形雙層膜狀結構。圖1B說明各組蛋白均可以表達外泌體標志物CD63與TSG101，并且不含有Calnexin，提示各組細胞上清液中提取出的外泌體中均不含有細胞成分。圖1C表明標準化細胞數(shù)下，通過BCA定量法可以檢測外泌體相對總蛋白含量。并且結果顯示，與NG-Exo組和MC-Exo組相比，HG-Exo組中總外泌體蛋白含量增加(F=652.843,P<0.05)。

圖1 外泌體電鏡鑒定、外泌體蛋白分析及標準化細胞數(shù)的BCA外泌體蛋白定量

A：外泌體電鏡鑒定×20 000；B：外泌體蛋白分析；C：外泌體BCA定量；a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組；與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

2.2 各組小鼠UAER比較HG-Exo組小鼠UAER高于NG-Exo組和MC-Exo組，差異有統(tǒng)計學意義(F=91.581,P<0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠腎組織病理與免疫組化染色HE染色和PAS染色結果顯示，HG-Exo組中腎小球體積大于NG-Exo組與MC-Exo組，并且系膜擴張和增殖及系膜增生指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=233.538,P<0.05)；免疫組化結果顯示HG-Exo組中巨噬細胞CD68浸潤多于NG-Exo組與MC-Exo組(F=294.709,P<0.05)；同時HG-Exo組中Col-IV與FN表達同樣升高，差異有統(tǒng)計學意義(FCol-IV=466.773，F(xiàn)FN=186.358，P<0.05)。見圖3、表1。

圖2 各組小鼠UAER比較

a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組;與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

圖3 各組小鼠腎組織HE、PAS染色及腎組織CD68、Col-Ⅳ、FN免疫組化染色 ×400a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組

2.4 各組小鼠腎組織TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA、Col-IV、FN蛋白表達Western blot結果顯示，與NG-Exo組和MC-Exo組相比，HG-Exo組小鼠腎組織中炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、pro-IL-1β與細胞外基質(zhì)α-SMA、Col-IV、FN表達升高，并且差異有統(tǒng)計學意義(FTNF-α=28.114，F(xiàn)IL-1β=37.124，F(xiàn)pro-IL-1β=7.383，F(xiàn)α-SMA=43.996，F(xiàn)Col-IV=41.624，F(xiàn)FN=54.844，均P<0.05)。見圖4。

表1 各組小鼠系膜擴張指數(shù)及腎組織內(nèi)CD68、Col-Ⅳ和FN免疫組化

與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

圖4 各組小鼠腎組織α-SMA、Col-IV、FN、TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β蛋白變化

2.5 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達結果顯示HG-Exo組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的表達高于NG-Exo組和MC-Exo組，并且差異有統(tǒng)計學意義(FTGF-β1=124.536，F(xiàn)Smad3=61.012，F(xiàn)p-Smad3=144.991，均P<0.05)。見圖5。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β對細胞免疫功能及在細胞生長和分化過程都具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。在TGF-β超家族的38個家族成員中，TGF-β在慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中最為重要[10]。TGF-β具有多種亞型，其中TGF-β1與炎癥的聯(lián)系緊密。TGF-β1與受體結合后，磷酸化下游效應因子Smad2/3，從而發(fā)揮相應的生物學活性，而TGF-β1/Smad3信號通路的激活與腎小球系膜細胞的活化有著密切的聯(lián)系[11]。

有文獻[12]表明，糖尿病機體在高血糖的微環(huán)境中，腎小球系膜細胞可以被誘導發(fā)生活化，產(chǎn)生過量的α-SMA，進而產(chǎn)生過量的細胞外基質(zhì)。更有研究[13]表明，高糖環(huán)境下共培養(yǎng)的巨噬細胞和系膜細胞存在相互作用，巨噬細胞通過這種作用促進系膜細胞分泌炎性因子和細胞外基質(zhì)。

圖5 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白水平變化

a：NG-Exo組；b：MC-Exo組；c：HG-Exo組；與NG-Exo組和MC-Exo組比較：*P<0.05

近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)外泌體與DN之間有著緊的聯(lián)系。有文獻[14]提出，高糖刺激下的系膜細胞可以釋放出更多的外泌體。還有文獻發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞可以改善糖尿病腎臟功能，其機制可能是通過分泌外泌體來抑制炎性因子TNF-α表達，從而減少系膜基質(zhì)的產(chǎn)生并同時改善小管間質(zhì)的纖維化[15]。因此，巨噬細胞釋放的外泌體在DN腎組織中的作用將是另一個重要的研究方向。本研究結果顯示HG-Exo組外泌體蛋白含量更高，這意味著高糖環(huán)境下的巨噬細胞可以釋放更多的外泌體，可能攜帶更多的信息介質(zhì)。為了進一步觀察外泌體在小鼠腎組織內(nèi)的影響，本研究通過尾靜脈注射的方式將外泌體注入小鼠體內(nèi)，檢測小鼠腎組織病理學改變以及相關信號通路的表達變化，結果顯示HG-Exo組小鼠UAER增加，并且可以觀察到系膜細胞及基質(zhì)增生以及腎組織內(nèi)巨噬細胞的浸潤增加，這提示高糖刺激的巨噬細胞源外泌體可以引起小鼠腎組織的病理學改變。通過進一步研究顯示HG-Exo組小鼠腎組織內(nèi)TNF-α、pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA、Col-IV、FN、TGF-β1、Smad3和p-Smad3均表達增加，提示高糖刺激巨噬細胞產(chǎn)生的外泌體可以引起小鼠腎組織內(nèi)炎癥增加、系膜細胞的活化以及細胞外基質(zhì)的增加，其發(fā)生與TGF-β1/Smad3通路的激活有著極其密切的聯(lián)系。

綜上所述，本研究結果闡述了高糖環(huán)境下巨噬細胞釋放的外泌體在小鼠腎臟中的作用。在DN的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細胞除了釋放損傷介質(zhì)導致炎癥反應外，還可以通過釋放更多外泌體來激活TGF-β1/Smad3通路從而介導系膜細胞的活化，導致系膜細胞的增殖以及細胞外基質(zhì)的累積，這項發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，可以為DN的治療提供新的思路。但本研究中外泌體作用TGF-β1/Smad3通路的具體機制尚不明確，有待進一步的研究。