朱繼田 李倩 謝后田 祖雪芹 黃偉 黃濤

(宿州市立醫(yī)院心血管內科，安徽 宿州 234000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)發(fā)生、發(fā)展與冠脈血管壁組織中的炎癥反應明顯相關〔1〕；炎癥反應可促進免疫細胞和血小板在血管內皮細胞表面的黏附和激活，導致內部出血或斑塊破裂，繼發(fā)性血栓形成，引發(fā)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死的發(fā)生〔2〕。黏蛋白結構域的分子(Tim)3是動脈硬化的負調控因子，可提升調節(jié)性T細胞活性，下調效應性T細胞活性，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成〔3〕。但關于Tim3在冠心病中的調控機制目前仍未完全明確。研究者發(fā)現(xiàn)，白細胞介素(IL)-7可調控T細胞表面Tim3表達，參與慢性病毒感染的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。本研究在體外培養(yǎng)冠心病患者外周血單核細胞，觀察IL-7對患者T細胞表面Tim3的調控作用，探討IL-7和Tim3在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年6月至2018年12月宿州市立醫(yī)院收治的冠心病患者164例。均符合2015年中華醫(yī)學會心血管分會制定的冠心病診治指南中的診斷標準；排除合并肝腎功能不全、糖尿病、腦血管疾病的患者。其中男94例，女70例；年齡56～82歲。根據(jù)患者入院時臨床癥狀、心電圖、心臟彩超、冠脈造影結果，根據(jù)病情分為：穩(wěn)定型心絞痛組44例、不穩(wěn)定型心絞痛組78例、急性心肌梗死組42例。選取同期在醫(yī)院體檢的性別、年齡相匹配的健康人群40例為正常對照組，其中男24例，女16例；年齡55～80歲。冠心病患者與正常對照組受試者性別、年齡之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 淋巴細胞分離液購于上?；鄯f生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于北京雅安達生物技術有限公司；IL-7酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司；兔抗人轉錄激活因子(STAT)-5、磷酸化(p)-STAT-5單克隆抗體，鼠抗人細胞因子信號通路抑制因子(SOCS)3、β-actin單克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗人免疫球蛋白(Ig)G、鼠抗人IgG購于美國PeproTech公司。

1.3方法

1.3.1外周血單核細胞分離及培養(yǎng) 采集各組受試者外周血10 ml，肝素抗凝處理后使用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法分離外周血單核細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃ 10%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，細胞計數(shù)后按1×106/孔的密度接種于24孔板中，設置3個復孔，加入終濃度為30 ng/ml的重組IL-7刺激12 h，并設置無重組IL-7刺激的對照孔正常培養(yǎng)12 h，收集細胞用于檢測。

1.3.2流式細胞術檢測 取各組外周血單核細胞轉入流式細胞檢測管中，磷酸緩沖液洗滌后加入CD3(PERCP)、CD14〔復合熒光素(APC)-Cy7〕、CD8〔異硫氰酸熒光素(FITC)〕、熒光標記(TIM)-4-PE得州紅(Texasred)，避光條件下4℃靜置40 min，磷酸緩沖液洗滌后使用2%多聚甲醛固定后上流式細胞儀檢測Tim3陽性細胞占CD4+、CD8+T細胞的比例。

1.3.3血清IL-7濃度檢測 采集各組受試者清晨空腹外周靜脈血3 ml，2 000 r/min離心10 min，收集上層血清，-20℃保存待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清IL-7濃度，試劑盒購于江蘇寶萊生物科技有限公司，操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.3.4Western印跡檢測 取未刺激和重組IL-7刺激12 h后的急性心肌梗死患者外周血單核細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，離心收集上清，雙辛酸鈉(BCA)定量，行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加兔抗人STAT-5、p-STAT-5單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人SOCS3單克隆抗體(1∶300)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，滴加HRP標記的兔抗人IgG，鼠抗人IgG，均為1∶1 000稀釋，室溫下靜置2 h，電化學發(fā)光(ECL)顯色，避光顯影，采集圖像，使用Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

1.3.5重組IL-7刺激對外周血單核細胞表面Tim3表達的影響 選取28例急性心肌梗死組患者和18名正常對照組受試者的外周血單核細胞，向細胞培養(yǎng)基中加入重組IL-7刺激12 h后收集外周血單核細胞進行流式細胞術檢測。

1.4統(tǒng)計學分析 使用SPSS21.0軟件進行t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1外周血CD4+、CD8+T細胞Tim3表達水平分析 穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于正常對照組，急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)。不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細胞占CD8+T細胞的比例明顯高于正常對照組，急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細胞占CD8+T細胞的比例明顯高于穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)。見表1。

表1 各組外周血Tim3陽性細胞占CD4+、CD8+T細胞的比例

與正常對照組相比:1)P<0.05；與穩(wěn)定型心絞痛組相比:2)P<0.05；與不穩(wěn)定型心絞痛組相比:3)P<0.05

2.2血清IL-7濃度及與CD4+、CD8+T細胞Tim3表達的相關性分析 正常對照組、穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組血清IL-7水平分別為：(36.28±12.61)pg/ml、(39.45±19.30)pg/ml、(40.87±16.75)pg/ml、(67.71±17.48)pg/ml。急性心肌梗死組血清IL-7水平明顯高于正常對照組(P<0.01)；穩(wěn)定型心絞痛組和不穩(wěn)定型心絞痛組血清IL-7水平與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Pearson相關性分析顯示，血清IL-7濃度與Tim3+CD4+T、CD8+T細胞比例均無相關性(r=0.561、0.428，均P>0.05)。

2.3重組IL-7刺激對外周血單核細胞表面Tim3表達的影響 正常對照組重組IL-7刺激12 h的CD4+T細胞表面Tim3表達水平較未刺激者升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；急性心肌梗死組重組IL-7刺激12 h的CD4+T細胞表面Tim3表達水平較未刺激者明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組、急性心肌梗死組重組IL-7刺激12 h的CD8+T細胞表面Tim3表達水平較未刺激者明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4重組IL-7刺激后外周血單核細胞中IL-7信號通路相關分子表達水平分析 重組IL-7刺激后p-STAT-5蛋白相對表達量為3.69±0.57，明顯高于未刺激的細胞中0.52±0.08，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；重組IL-7刺激與未刺激STAT-5蛋白相對表達量分別為5.53±0.81、5.84±0.97，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；重組IL-7刺激后SOCS3蛋白相對表達量為3.03±0.45，明顯高于未刺激的細胞中1.91±0.24，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

表2 兩組IL-7刺激與未刺激的外周血Tim3陽性細胞占CD4+、CD8+T細胞的比例

與未刺激相比：1)P<0.05

1未刺激；2 重組IL-7刺激12 h后圖1 IL-7信號通路相關分子表達的Western印跡電泳

3 討 論

Tim3為T細胞免疫球蛋白黏蛋白家族成員，其與程序性死亡受體(PD)-1、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(CTLA)4等共同參與腫瘤和病毒感染的發(fā)生、發(fā)展，引發(fā)T細胞衰竭和免疫耐受〔5〕。抑制Tim3表達是目前惡性實體瘤的主要免疫療法之一〔6,7〕。研究者發(fā)現(xiàn)，在抗腫瘤免疫反應和適應性耐藥性引發(fā)的免疫異常中Tim3表達上調僅出現(xiàn)于CD4+、CD8+T細胞中，抗PD-1藥物與抗Tim3抗體聯(lián)用可有效抑制抗PD-1耐藥性的產生，提升T細胞的抗癌活性〔8〕。Tim3的免疫抑制活性在部分感染性疾病中能夠發(fā)揮免疫保護作用〔9〕。丙型病毒性肝炎中Tim3介導的信號通路可通過抑制輔助型T細胞(Th)17細胞分泌IL-16，增強調節(jié)性T細胞活性，避免肝細胞因免疫炎癥反應過強而引發(fā)的損傷〔10〕。目前研究認為，冠心病屬于炎性疾病的一種，在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中Tim3可通過抑制CD4+、CD8+T細胞功能，減少促炎癥因子的分泌，增強斑塊穩(wěn)定性，緩解病情〔11,12〕。本研究顯示，冠心病患者中不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者Tim3陽性細胞占CD4+、CD8+T細胞比例明顯升高，其中以急性心肌梗死患者升高最明顯，提示Tim3高表達可能對T細胞發(fā)揮抑制作用，進而影響機體的免疫炎癥應答，抑制心肌細胞損傷加重，防止病情進展。

IL-7與IL-4、IL-9同屬于共同γ鏈細胞因子，參與調控T細胞生長、分化過程〔13〕。雖然研究者發(fā)現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化患者中IL-7表達無明顯變化，但IL-7在不穩(wěn)定型心絞痛患者中可與血小板、趨化因子等相互作用，促進冠心病惡化〔14，15〕。本研究顯示，IL-7在穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中濃度均未出現(xiàn)明顯升高，但在急性心肌梗死患者血清中的濃度明顯高于同年齡段健康人群。為進一步探究IL-7在急性心肌梗死患者血清中升高的意義，本研究通過重組IL-7刺激急性心肌梗死患者和同年齡段健康人群中分離的外周血單核細胞，結果顯示重組IL-7能夠上調急性心肌梗死患者CD4+、CD8+T細胞表面的Tim3表達。提示重組IL-7誘導的Tim3表達上調在可進一步促進冠心病患者中Tim3的免疫抑制功能，緩解機體受到的免疫損傷。

研究者發(fā)現(xiàn)，慢性病毒感染過程中，IL-7信號通路促進STAT-5磷酸化，誘導細胞因子分泌，促進細胞增殖，下調抑制因子的表達水平，對抗免疫耐受。本研究對IL-7誘導急性心肌梗死患者外周血單核細胞中Tim3表達升高的機制分析顯示，重組IL-7刺激后，可促進STAT-5磷酸化，上調抑制因子SOCS3表達，提示IL-7在冠心病患者中的作用可能與慢性病毒感染中的作用完全相反，具體機制仍需進一步深入研究。同時，穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛患者血清IL-7濃度無明顯提升，但Tim3表達水平明顯升高，提示可能存在其他分子機制誘發(fā)Tim3表達上調，仍需進一步深入研究。