雷雨廣 徐繼鵬 陳超 張偉麗

(1信陽市第二人民醫(yī)院病理科，河南 信陽 464000；信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 2護(hù)理學(xué)院；3附屬醫(yī)院皮膚科)

星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于腦組織中的一種膠質(zhì)細(xì)胞，通過分泌激素、營養(yǎng)因子參與神經(jīng)元生長及凋亡等生物學(xué)過程，可調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生及發(fā)展過程〔1〕。研究顯示，腦組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)?？蓪?dǎo)致腦組織損傷〔2〕。因而探究星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機(jī)制對(duì)減少細(xì)胞凋亡具有重要意義。兔脊髓缺血再灌注損傷模型蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)A3呈高表達(dá)，與脊髓缺血再灌注損傷密切相關(guān)〔3〕。PDIA3可作為一種保護(hù)蛋白調(diào)控神經(jīng)退行性病變過程，還可通過減少氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激降低缺血誘導(dǎo)的損傷〔4,5〕。然而，相關(guān)研究顯示，甲型流感病毒可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激反應(yīng)并上調(diào)PDIA3表達(dá)，下調(diào)PDIA3表達(dá)可通過抑制凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制上皮細(xì)胞凋亡〔6〕。目前關(guān)于PDIA3表達(dá)變化對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響尚未見報(bào)道，本研究通過雙向調(diào)控PDIA3表達(dá)探討PDIA3表達(dá)變化對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海生物工程有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海艾研生物科技有限公司；RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)所需試劑均購自日本TaKaRa公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒購自上海齊一生物科技有限公司；PDIA3 siRNA(si-PDIA3)、陰性對(duì)照(si-NC)及pcDNA過表達(dá)載體均購自美國Invitrogen公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠PDIA3與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人磷酸化(p)-p38與p38抗體均購自美國CST公司。

1.2星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 參照李清等〔7〕研究報(bào)道培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，麻醉出生2～3 d無特定病原體(SPF)級(jí)雄性小鼠，取出T11～L6處脊髓背角組織，加入胰蛋白酶消化，放入溫度37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，30 min后取出細(xì)胞懸液接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，8 d后置于搖床震蕩15 h，以5×106個(gè)/ml細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞板(包被多聚賴氨酸)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d后待星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)98%左右時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3構(gòu)建PDIA3干擾及過表達(dá)載體穩(wěn)定株系 收集星形膠質(zhì)細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/ml)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至80%更換為不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別將si-con、si-PDIA3、pcDNA 及pcDNA-PDIA3轉(zhuǎn)染入星形膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換含有10%胎牛血清新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用qRT-PCR與Western印跡檢測驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，構(gòu)建轉(zhuǎn)染穩(wěn)定株系。

1.4H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型及分組 選取對(duì)數(shù)生長期星形膠質(zhì)細(xì)胞，分為對(duì)照組(NC組)與H2O2組，其中NC組不進(jìn)行任何處理；H2O2組中在星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入100 μmol/L H2O2制備氧化損傷模型〔8〕。收集轉(zhuǎn)染后12 h星形膠質(zhì)細(xì)胞，加入濃度為100 μmol/L的H2O2作用24 h，實(shí)驗(yàn)將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為NC組、H2O2組、H2O2+si-con組、H2O2+si-PDIA3組、H2O2+pcDNA組、H2O2+pcDNA-PDIA3組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行檢測。

1.5qRT-PCR檢測PDIA3 mRNA表達(dá) 利用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃ 10 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。PDIA3 以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PDIA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測PDIA3及p38MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá) 收集“1.2.3”中各組星形膠質(zhì)細(xì)胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取總蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測樣品濃度，取50 μg蛋白樣品分別與上樣緩沖液混合，經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)(80 V 30 min，120 V 2 h)，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，2 h后用脫脂奶粉封閉60 min，加入稀釋比為1∶1 000的PDIA3、p38及p-p38蛋白一抗，再把膜放入IgG二抗(1∶5 000)中反應(yīng)，室溫放置2 h，TBST清洗3次，10 min/次，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯影反應(yīng)，置于凝膠成像系統(tǒng)分析，利用Quantity One軟件分析蛋白條帶積分光密度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白條帶積分光密度值與GAPDH內(nèi)參條帶積分光密度值的比值。

1.7檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活力 分別取各組星形膠質(zhì)細(xì)胞，以細(xì)胞密度為5×104/L接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(120 μl/孔)，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后分別加入濃度為5 g/L的MTT溶液(20 μl)，4 h后棄培養(yǎng)基，分別加入DMSO 150 μl，置于搖床內(nèi)10 min，放入酶標(biāo)儀檢測各孔在波長為490 nm處光密度值，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞光密度值/正常組細(xì)胞光密度值)×100%。培養(yǎng)48 h后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測LDH含量，LDH釋放率(%)=細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)酶活力單位/(細(xì)胞裂解液測定酶活力單位+細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)酶活力單位)×100%〔9〕。

1.8檢測上清液中TNF-α、IL-6濃度 采用放射免疫法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板，胰酶消化制備細(xì)胞懸液，置于離心機(jī)，1 000 r/min離心15 min，分別加入1 ml結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞(5×104/L)，按照試劑盒說明書分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育20 min，置于流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1H2O2對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞PDIA3表達(dá)的影響 H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中PDIA3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2PDIA3干擾或過表達(dá)載體構(gòu)建 與si-con組相比，si-PDIA組PDIA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-PDIA3組PDIA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖2，表2。表明PDIA3干擾或過表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞PDIA3蛋白表達(dá)

表1 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞PDIA3 mRNA和蛋白表達(dá)

與NC組比較:1)P<0.05

1～4: si-con組，si-PDIA3組，pcDNA組，pcDNA-PDIA3組圖2 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞PDIA3蛋白表達(dá)

表2 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞PDIA3 mRNA和蛋白表達(dá)

與si-con組比較:1)P<0.05；與pcDNA組比較:2)P<0.05

2.3PDIA3干擾或過表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響 H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量顯著高于NC組(P<0.05)，星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率顯著低于NC組(P<0.05)，表明H2O2可加重星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞存活。與H2O2+si-con組比較，H2O2+si-PDIA3組LDH釋放量明顯增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。與H2O2+pcDNA組比較，H2O2+pcDNA-PDIA3組LDH釋放量明顯減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。表明PDIA3過表達(dá)可有效減少星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH釋放量并提高細(xì)胞存活率，抑制PDIA3表達(dá)作用效果則相反。

2.4PDIA3干擾或過表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 與NC組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6水平均明顯上升(P<0.05)，表明H2O2可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。與H2O2+si-con組相比，H2O2+si-PDIA3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-PDIA3組TNF-α、IL-6水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。表明PDIA3可能通過抑制H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

2.5PDIA3干擾或過表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組(P<0.05)。H2O2+si-PDIA3組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著高于H2O2+si-con組(P<0.05)；H2O2+pcDNA-PDIA3組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著低于H2O2+pcDNA組(P<0.05)，見表3、圖3。表明PDIA3過表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。

2.6PDIA3干擾或過表達(dá)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的影響 H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-p38蛋白表達(dá)明顯高于NC組(P<0.05)，表明H2O2可能激活p38MAPK信號(hào)通路。H2O2+si-PDIA3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-p38蛋白表達(dá)明顯高于H2O2+si-con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H2O2+pcDNA-PDIA3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-p38蛋白表達(dá)顯著低于H2O2+pcDNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p38表達(dá)水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖4。表明PDIA3過表達(dá)可能通過抑制p38MAPK信號(hào)通路活化進(jìn)而發(fā)揮作用。

表3 各組LDH釋放量、細(xì)胞存活率、IFN-α、IL-6、p-38、p-p38及細(xì)胞凋亡率比較

與NC組比較：1)P<0.05；與H2O2+si-con組比較:2)P<0.05；與H2O2+pcDNA組比較：3)P<0.05

圖3 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率

1～6：NC組，H2O2組，H2O2+si-con組，H2O2+si-PDIA3組，H2O2+pcDNA組，H2O2+pcDNA組-PDIA3組圖4 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p38和p-p38蛋白表達(dá)

3 討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過促進(jìn)血腦屏障形成并調(diào)控代謝過程以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并可通過修復(fù)及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育〔10〕。機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腦組織氧化狀態(tài)失衡而造成腦組織氧化損傷〔11〕。

PDIA3可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊并可參與乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔12〕。β-淀粉肽與PDIA3結(jié)合形成復(fù)合物從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，若PDIA3與β-淀粉肽的結(jié)合能力減弱導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變〔13〕。研究表明PDIA3可通過調(diào)控脂肪代謝過程進(jìn)而參與非酒精性脂肪肝發(fā)生及發(fā)展過程，同時(shí)PDIA3還可通過影響體內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)控腸易激綜合征發(fā)生過程〔14,15〕。H2O2屬于體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧并可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷而建立細(xì)胞氧化損傷模型〔16〕。本研究說明PDIA3可參與星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程。機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化可促使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化異常從而增加細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞內(nèi)LDH流出細(xì)胞至細(xì)胞膜外，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量增加表示細(xì)胞氧化損傷〔17〕。本研究提示上調(diào)PDIA3表達(dá)可能通過抑制H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)氧化應(yīng)激損傷而抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞存活能力。

機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)p38MAPK信號(hào)通路被激活，p38MAPK可從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核并通過促進(jìn)TNF-α等炎癥因子釋放而促進(jìn)疾病進(jìn)展，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子可降低其氧化應(yīng)激反應(yīng)〔18,19〕。張瑤等〔20〕研究表明，利拉魯肽可通過抑制p38MAPK信號(hào)通路激活進(jìn)而改善高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷〔20〕。汪蓮等〔21〕研究表明抑制p38MAPK信號(hào)通路激活可通過降低Caspase-1、IL-1β等表達(dá)而降低炎癥反應(yīng)。本研究說明PDIA3過表達(dá)能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時(shí)本研究說明PDIA3過表達(dá)可抑制p38MAPK信號(hào)通路激活。提示PDIA3可能通過抑制p38MAPK信號(hào)通路活化而降低TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子水平而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

綜上，PDIA3可通過抑制p38MAPK信號(hào)通路活化而發(fā)揮抗炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激作用，為防治星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷提供理論依據(jù)。