黃蓓蓓

（1.河南科技大學(xué) 應(yīng)用工程學(xué)院，河南 三門峽 472000；2.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 三門峽 472000）

目前，我國(guó)液體菌種技術(shù)已經(jīng)在國(guó)際上遙遙領(lǐng)先，液體菌種已經(jīng)廣泛應(yīng)用到黑木耳、金針菇、杏鮑菇、靈芝、猴頭菇等食用菌上。液體菌種發(fā)酵技術(shù)及培養(yǎng)設(shè)備為食用菌液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)，在此背景下，根據(jù)罐內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以猴頭菇為例觀察其液體菌種在罐內(nèi)培養(yǎng)中的發(fā)酵過程，分析不同碳源、氮源、pH、溫度等因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，對(duì)不斷優(yōu)化猴頭菇液體菌種培養(yǎng)方案以及促進(jìn)整個(gè)食用菌行業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展具有重要意義。

1 猴頭菇生產(chǎn)概述

1.1 猴頭菇及其生態(tài)環(huán)境

猴頭菇（Hericium erinaceus） 是我國(guó)傳統(tǒng)的“藥食同源”的真菌，因其具有重要的食用價(jià)值和藥用功效而受到了消費(fèi)者的廣泛喜愛[1]。我國(guó)食用猴頭菇的歷史由來已久，民間早有“多食猴頭，返老還童”之說，而《本草綱目》 中關(guān)于猴頭菇的記載“猴頭菇性平、味甘，具有利五臟、健脾益胃的功能”。隨著現(xiàn)代對(duì)猴頭菇研究的深入，還發(fā)現(xiàn)了猴頭菇能用于治療胃病、神經(jīng)衰弱等疾病，其中的多糖還具保護(hù)肝臟、抗衰老、氧化、抗癌等功效。目前來說，包括猴頭菇在內(nèi)的食用菌主要有2 種生產(chǎn)方式，根據(jù)食用菌培養(yǎng)的生態(tài)環(huán)境的不同，可以分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，而對(duì)猴頭菇來說后者更具優(yōu)勢(shì)。猴頭菇液體菌種培養(yǎng)可將其制袋或裝罐，以罐內(nèi)培養(yǎng)的方式準(zhǔn)備猴頭菇發(fā)酵所需的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)的方式能夠有效減少成本，接種簡(jiǎn)便，更加適用于現(xiàn)如今食用菌生產(chǎn)的工廠化進(jìn)程。

1.2 猴頭菇次級(jí)代謝產(chǎn)物

猴頭菇中的萜類化合物最早是由美國(guó)學(xué)者Kawagishi 于1990 年從猴頭菇菌絲體中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成十分有效；提取的甾醇類化合物能夠阻斷致癌物誘發(fā)癌細(xì)胞形成，預(yù)防心血管疾病；提取的生物堿類化合物，具有抗炎活性。2015 年，我國(guó)學(xué)者汪鍇進(jìn)一步從猴頭菌菌絲體中分離出了葡萄糖苷酶抑制活性的生物堿[2]。同時(shí)，猴頭菇也含有其他食用菌普遍含有的活性成分，包括酚類、脂肪酸等。

1.3 猴頭菇液體發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)的要求

猴頭菇的罐內(nèi)發(fā)酵需要具備一定的條件。首先碳源占據(jù)猴頭菇菌體元素的60%及以上，因此碳源也是猴頭菇液體培養(yǎng)重要的營(yíng)養(yǎng)來源，罐內(nèi)培養(yǎng)對(duì)碳的需求量大，因此可以充分利用葡萄糖、纖維素、果膠、淀粉等高分子有機(jī)物，滿足猴頭菇罐內(nèi)培養(yǎng)發(fā)酵的要求，但是需注意食用菌屬于低糖發(fā)酵，因此罐內(nèi)培養(yǎng)基的含糖量不宜超過5%[3]。氮源是猴頭菇菌種發(fā)酵的重要元素，氮源充足會(huì)幫助菌絲獲得充足的生長(zhǎng)，需要將罐內(nèi)培養(yǎng)基氮濃度控制在0.15%~0.30%，過多會(huì)導(dǎo)致猴頭菇次級(jí)代謝產(chǎn)物減少，不足則引起菌絲生長(zhǎng)不良。此外，pH 也影響猴頭菇的生長(zhǎng)，一般來說，大多數(shù)食用菌習(xí)慣于偏酸性的環(huán)境，適宜的pH 在5~7；食用菌對(duì)溫度環(huán)境要求高，罐內(nèi)培養(yǎng)的溫度應(yīng)嚴(yán)格加以控制，根據(jù)各個(gè)生長(zhǎng)階段的不同形成最適宜子實(shí)體生長(zhǎng)的溫度[4]。

2 猴頭菇液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)的材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料準(zhǔn)備

菌種猴頭菇；液體發(fā)酵培養(yǎng)罐；馬鈴薯、淀粉碳源培養(yǎng)基（PDA）；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏1 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1。

2.2 試驗(yàn)方法過程

2.2.1 液體菌種的制備

取用準(zhǔn)備好的猴頭菇菌種接種于罐內(nèi)培養(yǎng)基中，將溫度控制在25℃以下，滿足1∶5 的比例[5]。發(fā)酵培養(yǎng)基方案根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)逐次進(jìn)行調(diào)整，直至找到最適宜猴頭菇發(fā)酵的罐內(nèi)培養(yǎng)設(shè)計(jì)方案。

2.2.2 最適猴頭菇培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)液體菌種制備的方案，進(jìn)行猴頭菇最適培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將上述培養(yǎng)基的試驗(yàn)因素進(jìn)行編號(hào)，以對(duì)猴頭菇罐內(nèi)培養(yǎng)方案進(jìn)行直觀對(duì)比，見表1。

表1 猴頭菇罐內(nèi)培養(yǎng)基因素水平Tab.1 Factors and levels of the medium of Hericium erinaceus

2.2.3 猴頭菇液體菌種罐內(nèi)發(fā)酵條件的確定

猴頭菇液體菌種培養(yǎng)條件的確定罐內(nèi)發(fā)酵液中的最佳碳源與最佳氮源，通過方案對(duì)比得出最佳碳氮比，由此決定發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間。要選擇猴頭菇菌絲體發(fā)酵最適宜的pH，進(jìn)行菌絲體最適宜發(fā)酵溫度的研究。分別對(duì)馬鈴薯（A）、淀粉（B）、酵母膏（C）、KH2PO4（D）、MgSO4·7H2O（E） 進(jìn)行成分測(cè)定比較。在發(fā)酵過程中注意檢測(cè)罐內(nèi)發(fā)酵液pH、猴頭菇菌絲體粗多糖、生物量的參數(shù)的變化。

2.2.4 菌絲干重?cái)?shù)據(jù)的采集

對(duì)猴頭菇生長(zhǎng)的菌絲測(cè)量，選用細(xì)胞干重法，取一定比例的培養(yǎng)液，通過轉(zhuǎn)速搖床收集菌絲球，將菌絲用水洗凈并用蒸餾法，控制溫度為80℃烘干至衡重[6]，獲得猴頭菇菌絲的干重，并稱重。

3 猴頭菇液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)的結(jié)果

3.1 不同碳源對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的影響

在猴頭菇液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)過程中，碳源應(yīng)占據(jù)猴頭菇培養(yǎng)基的60%及以上，有碳源存在才能維持猴頭菇菌種生長(zhǎng)需要的生命活力，幫助猴頭菇產(chǎn)生萜類、甾醇類、生物堿、酚類、脂肪酸等次級(jí)代謝物[7]。在罐內(nèi)培養(yǎng)基中，能夠利用多種含碳的材料作為猴頭菇液體發(fā)酵的碳源，包括淀粉、葡萄糖、甘露醇、糊精、乳糖等，既能滿足猴頭菇菌種發(fā)酵對(duì)碳源的要求，又能保證在低糖的培養(yǎng)基環(huán)境中達(dá)到菌絲產(chǎn)量的最高化，見圖1。

由圖1 可知，不同碳源對(duì)猴頭菇液體發(fā)酵后菌絲干重的影響，甘露醇、糊精、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖均可為猴頭菇菌種發(fā)酵提供碳源，但以葡萄糖和淀粉2 個(gè)碳源產(chǎn)出的猴頭菇菌絲產(chǎn)量最高，為葡萄糖時(shí)達(dá)到4.79 g·L-1，淀粉時(shí)達(dá)4.46 g·L-1。其中乳糖作為培養(yǎng)基碳源出現(xiàn)碳源供給不足的情況。

3.2 不同氮源對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的影響

氮源是構(gòu)成猴頭菇生物體的重要成分，試驗(yàn)選擇豆餅粉、玉米粉、麥麩、牛肉膏、酵母膏作為罐內(nèi)培養(yǎng)基中的氮元素來源，通過逐次試驗(yàn)對(duì)比得出最適宜的猴頭菇菌種發(fā)酵氮源，具體見圖2。

由圖2 可知，選擇的罐內(nèi)培養(yǎng)基氮源樣本總體來說對(duì)菌絲干重影響不大，但秉持最大程度節(jié)約成本的態(tài)度，在選擇酵母膏時(shí)，產(chǎn)出的猴頭菇菌絲干重比例最多，因此在實(shí)際生產(chǎn)過程中，可以廣泛選擇酵母膏作為氮源。

3.3 不同溫度對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的影響

在進(jìn)行猴頭菇罐內(nèi)培養(yǎng)過程中，要根據(jù)猴頭菇不同生長(zhǎng)階段對(duì)不同溫度的要求進(jìn)行溫度控制，為直觀對(duì)產(chǎn)出的猴頭菇菌絲干重作比較，在逐次進(jìn)行罐內(nèi)培養(yǎng)時(shí)將培養(yǎng)基溫度控制在20℃~30℃，確定具體溫度為23℃、25℃、27℃、29℃。其他碳源、氮源、溫度條件相同，見圖3。

由圖3 可知，在不同溫度的罐內(nèi)培養(yǎng)條件下，猴頭菇液體發(fā)酵菌絲產(chǎn)出差異顯著，其規(guī)律是從23℃起，猴頭菇液體發(fā)酵產(chǎn)出菌絲隨溫度的升高而產(chǎn)量增大，但當(dāng)達(dá)到了27℃時(shí)則開始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，因此在27℃的罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度條件，產(chǎn)生的菌絲體生物數(shù)量值最大。事實(shí)上，對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的罐內(nèi)培養(yǎng)來說，溫度對(duì)猴頭菇內(nèi)部分次級(jí)產(chǎn)出物會(huì)有所影響，因而溫度低菌體生長(zhǎng)趨緩，菌絲干重也就小；溫度逐漸升高則菌體也隨之生長(zhǎng)，菌絲干重?cái)?shù)值增大[8]。

3.4 不同pH 對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的影響

根據(jù)食用菌普遍對(duì)pH 要求偏酸性的特點(diǎn)，設(shè)定猴頭菇液體菌種發(fā)酵的罐內(nèi)培養(yǎng)基pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，對(duì)猴頭菇菌種進(jìn)行罐內(nèi)培養(yǎng)，其他氮源、碳源、溫度條件不變，具體見圖4。

根據(jù)圖4 可知，當(dāng)猴頭菇液體菌種發(fā)酵的罐內(nèi)培養(yǎng)基pH 達(dá)到5.5 時(shí)，菌絲體生物量最大，其它pH 情況下則對(duì)猴頭菇產(chǎn)出菌絲影響不大。但是在進(jìn)行猴頭菇乃至其他食用菌液體菌種發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)，必須充分考慮食用菌對(duì)pH 的要求，對(duì)猴頭菇來說，不宜在堿性培養(yǎng)基環(huán)境下進(jìn)行液體發(fā)酵，要注重適度原則，過酸或過堿都會(huì)影響猴頭菇菌絲的生長(zhǎng)，要將猴頭菇罐內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境控制在弱酸環(huán)境下。

4 對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)建議

4.1 正確操作發(fā)酵罐是獲得優(yōu)質(zhì)猴頭菇液體菌種的關(guān)鍵

進(jìn)行猴頭菇液體菌種發(fā)酵前，需要進(jìn)行發(fā)酵罐的清理和消毒工作，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間未使用的發(fā)酵罐要及時(shí)進(jìn)行高溫蒸汽消毒，有必要的情況下進(jìn)行滅菌，高溫后也應(yīng)對(duì)設(shè)備及時(shí)進(jìn)行冷卻，溫度過高容易引起食用菌菌種的死亡，例如猴頭菇液體菌種發(fā)酵的溫度就須得控制在27℃左右。此外，罐內(nèi)培養(yǎng)還需注意的是要對(duì)罐壓進(jìn)行控制，最好保持發(fā)酵罐內(nèi)部壓力大于罐外壓力。

4.2 持續(xù)把好猴頭菇液體菌種的質(zhì)量關(guān)

對(duì)菇農(nóng)來說，對(duì)合格液體菌種的判斷存在著困難，因此需要把好猴頭菇液體菌種的質(zhì)量關(guān)，為后續(xù)生產(chǎn)建立良好的基礎(chǔ)。人工液體菌種發(fā)酵需要按時(shí)觀察，并記錄參數(shù)變化，罐內(nèi)培養(yǎng)可以采用“三看一聞一測(cè)”的質(zhì)量檢測(cè)法，三看：看罐內(nèi)培養(yǎng)基顏色、菌液清澈度、看菌絲數(shù)量增長(zhǎng)情況；一聞：聞罐內(nèi)菌液味道；一測(cè)：測(cè)定pH，保證罐內(nèi)pH 維持在5.5 的值域內(nèi)，當(dāng)pH 下降到4，說明罐內(nèi)存在雜菌生長(zhǎng)，將不能再用于接種。

4.3 罐內(nèi)培養(yǎng)料水分控制是發(fā)菌成敗的關(guān)鍵

液體菌種培養(yǎng)要適當(dāng)控制養(yǎng)料的加水比例，罐內(nèi)水分少，培養(yǎng)基則不能長(zhǎng)效吸收菌液水分，猴頭菇菌絲不能有效獲得培養(yǎng)基的吸附，久而久之影響菌絲生長(zhǎng)。罐內(nèi)水分多，又會(huì)導(dǎo)致接入的菌種受到擠壓和浸泡，導(dǎo)致菌絲死亡。對(duì)于猴頭菇這樣耐水性好的菌類，罐內(nèi)培養(yǎng)液體菌種時(shí)將含水量控制在58%~62%即可。

4.4 把握菌絲生理成熟時(shí)間，及時(shí)誘導(dǎo)出菇

相對(duì)于固體菌種，液體菌種發(fā)酵顯然具有更大的優(yōu)勢(shì)。猴頭菇液體菌種接種后吸收培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)快，菌絲萌發(fā)快，周期短。雖然液體菌種能夠有效縮短發(fā)酵時(shí)間，但是也需要結(jié)合實(shí)際誘導(dǎo)菌絲出菇。要針對(duì)猴頭菇的特點(diǎn)，猴頭菇成熟時(shí)間早，當(dāng)菌絲吃料超過2/3 時(shí)，就可以恰當(dāng)安排出菇時(shí)間，即一邊發(fā)菌一邊出菇。

5 結(jié)論

通過對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基因素進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，在碳源需求上，葡萄糖、淀粉較之于其他碳源來說，能夠最大程度地為猴頭菇液體發(fā)酵提供碳源，在滿足猴頭菇碳源需求大的基礎(chǔ)上同時(shí)保證猴頭菇在低糖發(fā)酵的環(huán)境下產(chǎn)出菌絲；各類氮源對(duì)猴頭菇液體菌種發(fā)酵影響因素不大，但秉持節(jié)約成本的思路，在進(jìn)行液體菌種的工廠化生產(chǎn)過程中，普遍選用酵母膏最為合適；猴頭菇對(duì)溫度的需求保持在23℃~29℃，以27℃為臨界點(diǎn)；罐內(nèi)pH 維持在5.5 最適宜猴頭菇液體菌種發(fā)酵。通過逐次進(jìn)行培養(yǎng)基試驗(yàn)，得出猴頭菇液體菌種發(fā)酵最優(yōu)化方案，為猴頭菇乃至為其他同類型的真菌液體發(fā)酵提供參考，同時(shí)加快食用菌液體菌種發(fā)酵的工廠化進(jìn)程，促進(jìn)食用菌行業(yè)的發(fā)展。